水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット

Bioengineering

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Summary

油汚染の浄化のための持続可能な自動調整システムは、標準的な細菌DNAの交換部品(BioBricks)を使用して設計されました。エンジニアリング

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Brinkman, E. K., Schipper, K., Bongaerts, N., Voges, M. J., Abate, A., Wahl, S. A. A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments. J. Vis. Exp. (68), e4182, doi:10.3791/4182 (2012).

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Abstract

この作品は、前方の大腸菌によるアルカンの変換を可能にし、その適用性の原理の証明を提示するツールキットを置きます。このツールキットには、複数の標準交換部品(BioBricks)9アルカンの変換、有毒な炭化水素に富む環境における遺伝子発現と生存の調節をアドレッシングで構成されています。

アルカン分解の3段階経路を大腸菌で実装されました大腸菌それぞれアルカノール、カナール、最終的にアルカン-アミノ酸に、中長期鎖アルカンの変換を有効にする。後者はネイティブのβ-酸化経路を介して代謝された。中鎖アルカン(C5〜C13)とシクロアルカン(C5〜C8)、Gordonia spからアルカンヒドロキシラーゼシステムの4つの遺伝子(alkB2、rubA3、rubA4rubB)の酸化を促進する。 TF6 8,21を 大腸菌に形質転換した大腸菌 。の変換のための長鎖アルカン(C15-C36)は、Geobacillus thermodenitrificansからLADA遺伝子実装されました。分解プロセスの必要なさらなる手順については、ADHALDHは(G. thermodenitrificans由来する)10,11を導入ました。活動は休止細胞アッセイにより測定した。各酸化ステップでは、酵素活性が観察された。

プロセス効率を最適化するために、式は唯一、低グルコース条件下で誘導されました:基板-調節プロモーター、pCaiF、使用されていました。 pCaiFは大腸菌に存在している大腸菌 K12と非グルコース炭素源の分解に関与する遺伝子の発現を調節する。

ツールキットの最後の部分-生存を標的に- PhPFDαとβ溶媒耐性遺伝子、 パイロコッカスホリコシ OT3からの両方を使用して実装されていました。有機溶媒としては、否定的にaffectinによって細胞ストレスを誘導し、生存性を低下させる可能性がGタンパク質の折り畳み。シャペロンとして、PhPFDαβはアルカンの存在下でタンパク質の折りたたみのプロセスなどを改善します 。培地で10%n-ヘキサンのプレゼンスの増加成長率(最大50%)で示される炭化水素の改善·トレランスにつながったこれらの遺伝子の発現が観察された。

要約すると、結果は、ツールキットは大腸菌を可能にすること示す大腸菌水性環境中の炭化水素に変換して耐える。このように、それは合成生物学のアプローチを用いてオイル浄化のための持続的な解決に向けた第一歩を表しています。

Protocol

1。 BioBrickアセンブリ

  1. 標準生物学的部分のレジストリからBioBricksはIGEM本部によって提供されています。既存BioBricksから新しいBioBrickを構築するために、アクセプター部分のドナー部分の下流に位置決めするための酵素EcoRIとSpeIでドナーBioBrick(最大1.0μg)を消化。アクセプター部の上流ドナー部分を位置決めするためのXbaIとPstIでダイジェスト。ドナーのバックボーンにカット第三適切な制限酵素を追加します。サプライヤー(最終濃度1X)によると、適切な緩衝液20〜25 mlの総体積で消化を行う。制限酵素のた​​めの5単位/μgのDNAを使用しています。
  2. EcoRIおよびXbaIまたはSpeIとPstIでどちらかとアクセプタBioBrickを消化。
  3. 37℃で1時間(少なくとも)のために消化をインキュベート℃に制限エンドヌクレアーゼは、熱によって不活性化、80℃インキュベーションまもなく10分間遠心℃で。
  4. 消化BioBrickを連結一緒にパーツ(ドナーとアクセプター)。 XbaIとSpeIでは、互換性のDNA末端を生成するので、混合型のサイトは、4つの標準的な制限部位に隣接、新しい "複合" BioBrickに起因するいかなる制限酵素で切断することはできませんが作成されます。ライゲーション混合物で最終DNA濃度は、好ましくは約100 ng /μlに。 T4のライゲーションバッファー(最終濃度1x)とT4リガーゼ(1単位/μgのDNA)を10〜15 mLの全量ライゲーション反応を行う。
  5. 少なくとも3時間16℃でライゲーション混合物をインキュベートする。
  6. ライゲーションミックスの年頃の半分を使った変換反応を行う。
  7. シーケンスと正しいことがBioBrickを確認します。
  8. 合成されたDNAから新しいBioBrickを構築するために、Eの最適な発現のために合成するための遺伝子を変更JCatウェブツール(による大腸菌 http://www.jcat.de/ )。 Bの要件に合わせてさらに変更を加え ioBrick標準。この標準化は、すべてのBioBrickがプレフィックスが先行し、接尾辞が続く目的のDNA配列で構成されていることを意味します。接頭辞と接尾辞は、残りのプラスミド配列には存在しない事前定義された制限部位を含む配列である。これらの標準的な制限部位は、インターチェンジと9柔軟BioBrickインサートを延長することが可能になる。接頭辞と接尾辞は、以下の配列を持っている:
名前 シーケンス コメント
接頭辞 5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' 次の部分は、コード配列または "ATG"で始まる任意の一部である場合
サフィックス 5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'
Vivoで ove_title "> 2。アルカン変換一休み細胞アッセイ、

このアッセイは、藤井 (2004)によって記載された方法に基づいて行われた。

  1. 文化、E.アルカン水酸化酵素系(発現している大腸菌細胞BBa_K398014空ベクター(簿価)と細胞BBa_J13002を一晩適切な抗生物質を5 mlのLB培地中で)を。
  2. 新鮮なLBの50ml(抗生物質を含む)に一晩培養液500μlを移すと、細胞濁度が600nmで0.3のOD(光学密度)に達するまでインキュベートする。
  3. 4,000 rpmで10分間遠心し、5mlの0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)でペレットを再懸濁します。
  4. 4,000 rpmで10分間遠心分離し、再び今のE2の塩および0.66パーセントv / vグリセロール(窒素deficienを含む5mlの0.1Mリン酸緩衝液中でペレットを再懸濁トン培地)。
  5. 細胞濁度(OD 600)を測定します
  6. 25ミリリットルクローズドキャップガラスフラスコおよび無細胞コントロールで6ミリリットル(E2塩+ 0.66%(v / v)のグリセロール)の細胞混合物のアリコートを準備します。
  7. 各フラスコにアルカンの100ナノモルを追加します。
  8. 24時間(より高いレートが得られたときに短縮)37℃で混合物をインキュベートする。
  9. インキュベーション後、OD 600を測定します
  10. 酢酸エチルで培地中の炭化水素を抽出し、ガスクロマトグラフィー(プロトコル3を参照)により、細胞培養における炭化水素濃度を測定します。
  11. 各フラスコ内の全バイオマス存在する(乾燥重量のOD 600に変換)によって変換されたアルカンの合計額で除してバイオマスの単位あたりの劣化を計算します。実験期間で結果を分割する単位時間当たり、単位当たりのバイオマス分解活性が得られます。平均は3個々の実行から取得されます。

3。アルカン変換酵素アッセイでは 、ビトロ

このアッセイは、Li (2008)により記載された方法に本質的に従って行った。

  1. 文化、E. LADA遺伝子(発現している大腸菌細胞BBa_K398017 )と空ベクター(担持する細胞BBa_J13002を一晩適切な抗生物質を50mlのLB培地中で)を。
  2. 新鮮なLBの50ml(抗生物質を含む)に一晩培養液500μlを移すと、細胞濁度が600nmで0.6の光学密度に達するまで培養する。
  3. 4000 RPM(4℃)で10分間遠心分離し、50mMトリス緩衝液5mlにペレットを再懸濁します。
  4. 4の出力制御を40%のデューティサイクルで超音波洗浄します(細胞破砕、LA Biosystems社)細胞は、全期間にわたって氷の上で解決策を保つ。
  5. 4&dで4,000 rpmで5分間遠心し、得られた混合物を例えば、C細胞破片を除去する。新鮮なバイアルに上清を移してください。
  6. ブラッドフォードアッセイにより細胞抽出物の総タンパク質濃度を決定します。注:バックグラウンドの増加および/またはタンパク質の損失を防ぐために、ガラスバイアルを使用します。
  7. 0.1パーセントv / vのアルカンおよび50mM Tris-HCl緩衝液を含む100mlの混合物を準備します。
  8. 5分間100℃で混合物を加熱する。注:のみ沸点の高い中型の長鎖アルカンに対してこの手順を実行します。 ( 例えば、C 16:287℃)。
  9. 均質、粘性の混合物が得られるまでアルカンの最適な溶解性を達成するためには、まだ温かいうちに1分間超音波洗浄します。
  10. NADHの1mm、1mMのFMN、1mMのMgSO 4および0.01 V / VのTriton X-100を追加します。
  11. 25ミリリットルクローズドキャップフラスコに6 mlのアリコートを準備します。
  12. 細胞抽出物(ブラッドフォードアッセイ、5 mgタンパク質/ lの最終濃度に依存します)の適切な量を追加します。無タンパク質制御を準備します。
  13. 60℃でインキュベート(最適なeについて24時間nzymatic活動)。
  14. 酢酸エチルで培地中の炭化水素を抽出し、ガスクロマトグラフィー(プロトコル3を参照)により、細胞培養における炭化水素濃度を測定します。
  15. 各フラスコ(ブラッドフォード検量線による)に加え全タンパク質によって変換されたアルカンの合計額で除してバイオマスの単位あたりの劣化を計算します。さらに実験期間で割ると、単位時間あたりの細胞タンパク質の単位当たりの分解活性が得られます。平均は3個々の実行から取得されます。

4。酢酸エチルの炭化水素抽出と濃度測定

  1. アルカンは6ミリリットル実験溶液中に2.5ミリリットルの酢酸エチル(無極性solvant)を加えることによって、水溶液から抽出されます。内部標準は、0.1%(v / v)の濃度で溶媒に添加される。標準( 例えばシクロデカン)興味のあるピークの予想範囲に応じて変化した。
  2. オプション:追加トリトン水性混合物のX-100および適切な二相系を得るために4,000 rpmで10分間サンプルを遠心分離する。
  3. ボルテックス5秒(1,500 rpm)と別々の二つの相になるまで室温でインキュベートするための混合物。
  4. 有機層(上部)の最大量を削除し、無水硫酸マグネシウムを用いて溶媒を乾燥させてください。
  5. ろ過によりMgSO 4を取り外します(0.2μm)と測定のためのガスクロマトグラフバイアルにろ液を転送、または-20℃で保存する
  6. CP-SIL 5CB列(長さ= 5メートル)を使用してガスクロマトグラフィーを用いて濃度を測定します。 (1:10、230℃)、スプリットモードではサンプルの10μlを注入します。 1ml /分(ヘリウム)にカラムガス流量を設定します。以下のオーブン温度プログラムは使用されています:
    温度[°C] 時間[分]
    0 50 7.5
    50 90 1.0
    50 110 2.0
    50 130 2.0
    50 145 2.0
    50 160 2.0
    50 170 2.0
    50 185 2.0
    50 210 2.0
    50 250 2.0
    50 320 2.0
  7. ピークを積分し、内部標準に対する濃度を修正します。

5。アルコール/アルデヒド脱水素酵素活性アッセイ

このアッセイは、加藤の方法によれば、基本的に行った(2010)。

  1. 文化、E. ADH(発現している大腸菌細胞BBa_K398018 )またはALDH( BBa_K398030 )遺伝子と空ベクター(担持する細胞BBa_J13002を一晩適切な抗生物質を50mlのLB培地中で)を。
  2. 新鮮なLBの50ml(抗生物質を含む)に一晩培養液500μlを移すと、細胞濁度が600nmで0.6の光学密度に達するまで培養する。
  3. 4℃、4,000 rpmで10分間遠心分離し、50mMトリス緩衝液5mlにペレットを再懸濁します。
  4. 4の出力制御(超音波処理中に氷の上で解決策を保つ)と40%のデューティ·サイクルで細胞溶液を超音波洗浄します。
  5. °Cは、細胞破片を除去するために4℃、4,000 rpmで5分間、得られた混合物を遠心分離します。
  6. に決定Bradfordアッセイ(:結合タンパク質を防止するために、ガラスバイアルを使用注)により細胞抽出物のタンパク質濃度TAL。
  7. 各ウェル中のNAD(最終濃度1mM、pH 9.5)で含む180μlの57 mMグリシン緩衝液を用いて、96ウェルプレートをセットします。
  8. ウェルにテストされるアルコール(アルデヒド)の5μlを添加する。注:ヒート長鎖アルコールアッセイの開始前の液体を持っている。各アルコール(アルデヒド)のための基質を含まない対照(陰性コントロール)を追加する必要があります。加えて、細胞抽出せずにバッファと基板との混合物を含有するブランクを準備します。
  9. 予熱37℃で15分間プレートリーダー(TecanマゼランV7.0)のプレート°C系の平衡化を可能にする。
  10. 細胞抽出物(ブラッドフォードアッセイ、5 mgタンパク質/ lの最終濃度に依存します)の適切な量を追加します。無タンパク質制御を準備します。
  11. 340 nmの波長で37℃で1時間2〜3分ごと℃<を分光光度計を用いてNADH産生を測定/ LI>
  12. OD(340 nm)の斜面からのNADHの​​生産率を計算します。アカウントへの光路長と6220 M -1 cm -1のNADHの吸光係数を取る。細胞抽出物(U / mgの全細胞タンパク質)における脱水素酵素反応の活性を発現するために追加されたタンパク質の総量によってNADH生産速度を割ります。平均値と3は独立して動作しますから標準偏差を計算します。

6。 pCaiFキャラクタリゼーション

  1. 文化、E. pCaiF-GFPコンストラクト(発現している大腸菌細胞BBa_K398331 )と単独のプロモーター(担持する細胞BBa_K398326を適切な抗生物質を一晩5mlのLB培地で一晩)。
  2. 一晩培養した培養液50μlと、10g / lのグルコースおよび抗生物質を含む5mlのM9を接種し、一晩増殖。 新鮮なM9 with10 g / lでインキュベートし、5mlの中に一晩伸長のサブカルチャー50μlの細胞濁度は、600nmで0.2の光学密度に達するまで。
  3. 各ウェルにテストするための炭素源の所望の量を含有する新鮮なM9培地100μlの96ウェルプレートをセットします。統計的評価のために3回の実験を行い、それぞれのネガティブコントロール(野生型大腸菌 K12)を追加します。
  4. 井戸を含む培地に一晩培養液5μlを添加する。
  5. 成長曲線(OD 600)とプレートリーダーを用いてGFP蛍光(485 nm励起と520発光)37℃で18時間毎に10分°Cの定数と振とうして測定します。
  6. 成長率は、それぞれの測定値から特定のGFP量を計算し、コントロールと比較します。平均値と少なくとも3つの独立した実験の標準偏差を計算します。

7。許容アッセイ

  1. 文化PhPFDαおよびβ遺伝子(発現する大腸菌 BBa_K398406 5 mlのLB培地と適切な抗生物質で一晩)、E. LADA遺伝子(発現している大腸菌は BBa_K398017 )ネガティブコントロールとして使用されます。
  2. 新鮮なLBの5ミリリットル(抗生物質)とインキュベート中に一晩伸長のサブカルチャー10μlの細胞濁度は、600nmで0.3から0.4の光学密度に達するまで。
  3. 0.1のOD 600に到達するまで、新鮮な培地で培養液を希釈します。
  4. 適切な抗生物質と三重で毒性化合物( 例えば、0、4、8、n-ヘキサンの10%)の適切な最終濃度を含む180μlのM9培地で96ウェルプレートをセットします。アルカン-水混合物は、二相系につながる可能性があるので、それはプレート上の適切なコントロール( 例えば dを持つことが不可欠であるifferent株とそれぞれのブランク実験)。
  5. ウェルに培養液20μl(コントロール)を追加します。
  6. 一定振盪しながらプレートリーダーを37℃で24時間毎に10分°Cを使ってバイオマス濃度(OD 600)を測定します
  7. 異なる薬剤濃度については、それぞれの測定値からの成長率を計算し、陰性対照と比較します。平均値と、少なくとも3つの独立した実行の標準偏差を計算します。

8。同族体の相互作用のマッピング

  1. アプリケーションHIMは、STRINGデータベース(学術的な使用のため無料)20を稼動しているPostgreSQLサーバ上のタンパク質のクエリを実行するために開発されました。同族体の相互作用マッピングアプリケーションはSTRINGデータベースを使用して、元の宿主生物において作用するタンパク質を識別します。それぞれの相互作用遺伝子の配列は、標的生物の相同遺伝子を見つけるために、BLAST検索で使用されています。 Cytoscape 4 https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping。
  2. マッピングを実行するには、(1)BioBrick IDを入力すると、アプリケーションは自動的に標準生物パーツ9、または(2)を入力(ペースト)、アプリケーション内の配列データのレジストリから一部のシーケンスデータをダウンロードします。
  3. 入力したアミノ酸配列のSTRINGプロテインIDを見つけるために、文字列データベースのWebサイトを使用しています。
  4. 高い相同性を持つタンパク質は、BLASTを用いて決定される。その後、アプリケーションは、宿主生物におけるホモログ( 例えば大腸菌 )のソース生物と検索で既知の各相互作用タンパク質を示しています。
  5. テキストまたはCytoscapeに結果の推定上の相互作用リストをエクスポートします。

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Discussion

BioBrick原理は、アルカンの分解のために、シャーシを構築するために使われ、このツールキットの単一コンポーネントの原理の証明を得た。いくつかのアッセイは、in vivoおよびアルカン分解する経路酵素のin vitro活性を測定するために提案されている。提示された仕事は、正常宿主生物大腸菌の酵素活性と発現を決定するために使用できるメソッドの数を示しています適当BioBricksの実施後大腸菌 。さらに、それはBioBrick原理はアルカンの分解に必要なタンパク質を発現する生物を設計するために使用できることが示されている、唯一の必要なこれらの酵素を生産し、炭化水素の存在下で宿主生物の耐性を増強する規制システムを提供しています。一度さらに発展、このシャーシは、残油、水を尾行オイルサンドにおける 、または治療のための生物学的分解を使用することができる石油産業からの排水。

アルカン劣化に関しては、アッセイは、アルカン分解(AH-システムとLADA)の最初のステップに関与する酵素のキャラクタリゼーションを行った。それは、E.ことが実証された大腸菌はGordonia spのAH-システムを運ぶ負担。 TF6 、in vivo オクタンを変換することができましたこの知見は、藤井の結果と一致している。ら8、n-アルカンの生体内変化がEを使用して AH-システムの最低限の構成遺伝子を発現している大腸菌を達成した。変換アクティビティが一定時間後の比較研究(野生型対変異体)を用いて測定した。完全な特性のために、追加の研究は、時間とシステムの動態上、AH-システムの活性に実行する必要があります。

長鎖アルカン(C 15〜C 36)、GeobaからLADA遺伝子変換用cillusのthermodenitrificansが実装されました。酵素活性は、長鎖炭化水素源としてヘキサデカンを用いてin vitro 試験した。この修正された大腸菌大腸菌株は対照株と比較して増加した酵素活性を示したが、ラダ換えタンパクを実証することにより、E.ヘキサデカンの変換を可能にする大腸菌。変換アルカンのプロパティに加えアルカノール、E大腸菌株は、それぞれ、ADHALDH遺伝子の実装によってアルコールとアルデヒドのための改良された分解過程で開発された。細胞抽出液中の酵素活性は、NAD +からNADHの産生を測定することによって 、in vitro 試験した。 E. ADHを発現する大腸菌株は、野生型の活性に比べてアルコール脱水素酵素活性の2倍の増加を示した。コントロール株と比較して、ALDHタンパク質の発現は、 大腸菌でドデカナールデヒドロゲナーゼ活性を増加させ大腸菌 CELlが3倍に抽出します。明確に示され、これらのアッセイは、in vitroでの酵素活性を増加させたので、 形質転換したことを推測することができます大腸菌株は、同様にインビボで活性の高いレベルを持っています。

ホスト誘導発現(例えば:誘導化学物質や成長中の低負担の非依存性)の可能性を探るために、分解経路はpCaiFプロモーターの制御下で発現させた。血糖値が低い、 などである場合、このプロモーターは、遺伝子発現を活性化する。バッチ成長期の終わりに。原理の証明として、このプロモーターは、差分グルコース体制の下でGFPの生産を介してテストされました。それはpCaiF-GFPは、E.を変えていることが示された大腸菌は対数期(高グルコースレベル)に比べて静止(グルコースが制限された)段階でより多くのGFPを作り出した。二次炭素源( 例えば 。ラウリン酸)の存在下では、GFPの生産速度は、Agを減少させた二次炭素源の異化作用に起因するAIN。

実験では、このプロモーターが効果的に新しい分解経路へのグルコースから異化シフトを有効にするために使用することができることを示した。これは、分解経路が活性化される前に、急速に富栄養培地中の生物の膨大な量を栽培することができます。我々は上流AlkS転写調節因子をpCaiFプロモーターを使用することを提案する。 シュードモナスプチダで、AlkSはエフェクターとしてC 5-C 10の n-アルカンを認識します。その後AlkS-アルカン錯体の高いレベルは、脂肪酸19〜n-アルカンの変換に関与するオペロンalkBFGHJKLエンコーディングタンパク質の発現をもたらすPalkBプロモーターを活性化する。

細胞が生存可能であるためにはセンシングと炭化水素の変換は十分ではありません。環境の増加の炭化水素のレベルでは、野生型大腸菌の増殖大腸菌は水力発電の存在によって抑制されるタンパク質のミスフォールディングを引き起こす可能性が膜内と細胞中の炭素、。P.ホリコシプレフォルディンはアルカン17の存在下でタンパク質の正しい折りたたみを助けるシャペロンである。 HIMを使用して、それは、このタンパク質が大腸菌ホモログと相互作用することが予測されたEのプレフォルディンの過剰発現を示唆する大腸菌シャペロンタンパク質、 大腸菌は、溶媒耐性を向上させることができます。 BioBrickとBBa_K398406 (phPFDαphPFDβ遺伝子からなる)、 大腸菌の生存アルカンの存在下で大腸菌を 50%まで向上した。 HIMは、潜在的な機能的なホモログを選択するのに適したツールです。

全体としてツールボックスを考えると、それは水性環境中の炭化水素のバイオレメディエーションのために、シャーシの構築の最初のステップを提供していると結論付けることができる。これは、小さな自律的、自己複製とrを表しますelatively安価な方法。結果は、主に酵素アッセイを介して取得し、フラッシュ·文化を振るので、大規模に検証する必要がありました。このシステムのさらなる研究は、炭化水素分解のための想定システムを生成するために、個々に動作するようにここに示されている種々の酵素の結合に焦点を当てるべきである。さらに、他の汚染物質の分解のための代替経路の追加だけでなく、汚染物質のより広い範囲に単独での炭化水素のバイオレメディエーションを超えてこのシャーシの使用を拡大する可能性がある、ことによると、製品の経路の実装では、偶数の生産のために、このシステムを利用することができる貴重な物質。我々の結果は、油汚染に対処できる新しい生物を構築する合成生物学でBioBricksアセンブリ戦略の妥当性を強調し、さらに他のさまざまなアプリケーションを開発するのは役に立つかもしれません。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

このビデオの記事で行った実験国際遺伝子改変マシン競争9のために開発されました。著者はIGEMのチームメンバーにルークBergwerff、ピーテルTMバンBoheemen、Jelmerクノッセン、ヒューゴ·F Cuetoロハスとするためラモンファンデルファルクに感謝したいと思います研究の援助。我々は有用な議論ハン·デ·Winde、ステファンデコックとEsengülYILDIRIMに感謝し、この研究をホスティング。この作品は、バイオテクノロジーのデルフト工科大学部、デルフトインフォマティクス研究室、Bionanoscienceのデルフト工科大学学科、オイルサンドリーダーシップイニシアティブ(OSLI)、スタッドstudentenuitzendbureau、オランダゲノミクスイニシアティブ、Kluyverセンター、Nederlandse Vereniging Biotechnologische(開発元:Stichtingバイオオランダ)によってサポートされていました、DSM、GENEART、グライナーバイオ1とジェネンコア。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli K12 New England Biolabs C2523H
Octane Fluka 74822
Hexadecane Fluka 52209
octanol-1 Fluka 95446
dodecanol-1 Sigma-Aldrich 126799
Hexane Sigma-Aldrich 296090
NADH Sigma-Aldrich N4505
FMN Sigma-Aldrich F2253
MgSO4 J.T. Baker Casno 7487 889
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
T4 ligase New England Biolabs M0202L
Gas chromatograph
Cell disrupter LA Biosystems CD-019
Spectrophotometer Amersham pharmacia spec 2000
Plate reader Tecan Group Ltd. Magellan v7.0
Incubator Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts BBa_K398014 Alkane Hydroxylase System
Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts BBa_K398027 ladA Protein Generator
Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts BBa_K398018 ADH generator
Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts BBa_K398030 ALDH generator
Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts BBa_K398326 pCaiF promoter
Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401 Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts BBa_K398331 pCaiF measurement device
Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts BBa_K398406 Solvent tolerance cluster
Resistance: Chloramphenicol

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References

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