تسهيل اكتشاف المخدرات: مؤتمتة فحص التهاب عالية المحتوى في الزرد

Immunology and Infection
 

Summary

نحن هنا وصف رواية عالية المحتوى فحص الالتهاب الناجم كيميائيا يهدف إلى التعرف على المناعة تغييري bioactives. لقد نجحنا في الجمع بين المجهر الآلي مع العرف مخطوطات البرمجيات المتقدمة تمكين الكمي الآلي للاستجابة التهابية، فضلا عن مزيد من معالجة البيانات وتحليلها، والتعدين، والتخزين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الزرد اليرقات قابلة خاصة إلى كل الحيوانات الصغيرة 1،2 شاشات جزيء نظرا لصغر حجمها والسهولة النسبية للتلاعب والمراقبة، فضلا عن حقيقة أن مركبات ببساطة أن تضاف إلى مياه الاستحمام ويمتص بسهولة عندما تدار في <حل DMSO 1٪. يرجع ذلك إلى وضوح بصري اليرقات الزرد، ومدى توافر خطوط المعدلة وراثيا التعبير عن البروتينات الفلورية في الكريات البيض، الزرد توفر ميزة فريدة من نوعها لرصد رد فعل حاد للالتهابات في الجسم الحي. وبناء على ذلك، والاستفادة من الزرد لارتفاع محتوى شاشات جزيء صغير يهدف إلى التعرف على المركبات المناعية تغييري مع إنتاجية عالية وقد اقترح 3-6، مما يشير إلى سيناريوهات الحث على سبيل المثال التهاب النكات المترجمة في الأنسجة الزعانف، والضرر ليزر موجهة إلى السطح من صفار البيض الأجنة (7) أو tailfin بتر 3،5،6. العيب الرئيسي من هذه الأساليب ولكن كانشرط تلاعب يرقة دليل للحث على جرح، وبالتالي منع الفرز الفائق الإنتاجية. القضاء مقدمة من الالتهاب الناجم كيميائيا (الذقن) 8 فحص هذه العقبات. منذ يلحق اصابة كيميائيا عدد الأجنة التي يمكن معالجتها في وقت واحد تكاد تكون غير محدودة. علاج مؤقت من يرقات اسماك الزرد مع كبريتات النحاس يستحث موت الخلايا بشكل انتقائي في خلايا الشعر لنظام الخط الجانبي والنتائج في تجنيد المحببة السريع إلى neuromasts الجرحى. يمكن اتباعها لاستجابة التهابية في الوقت الحقيقي باستخدام مركب المعدلة وراثيا cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 يرقات اسماك الزرد 6،9 تعبر عن ببروتين أخضر في الخلايا neuromast، فضلا عن وضع العلامات الحمراء بروتين فلوري المحببة.

من أجل وضع استراتيجية الفرز من شأنها أن تسمح على حد سواء تحليل محتوى عالية وعالية الإنتاجية، وعرض علينا التعامل مع السائل الروبوتية وميكر الآلية المشتركةoscopy مع برنامج نصي مخصص البرمجيات المتقدمة. هذا السيناريو يمكن القياس الكمي الآلي للاستجابة التهابية بتسجيله المنطقة التي تحتلها في المئة الكريات البيض فلوري الحمراء ضمن المنطقة المحددة تجريبيا المحيطة المصابين neuromasts الفلورية الخضراء. وعلاوة على ذلك، ونحن الآلي ومعالجة البيانات، والمناولة، والتصور، وتخزين تقوم على العرف وضعت جميع MATLAB والبرامج النصية بيثون.

وباختصار، نحن نقدم الآلي HC / HT الشاشة التي تسمح اختبار المركبات الكيميائية من حيث تأثيرها على التقدم، وبدء أو قرار من استجابة التهابية المحببات. هذا البروتوكول يخدم نقطة انطلاق جيدة لمزيد من التحليل المتعمق لآليات المخدرات وطرق المشاركة في تزامن من استجابة المناعة الفطرية. في المستقبل، قد يساعد تحديد الآثار السامة لا يطاق أو بعيدا عن المرمى، في المراحل السابقة من اكتشاف المخدرات وبالتالي الحد من المخاطر والتكاليف الإجرائية لتطوير الأدوية.

Protocol

1. التعامل مع الحيوان

لاستخدام فحص الذقن 3 يرقات DPF الناتجة عن التزاوج بين مجموعة متماثلة اللواقح cldnB المعدلة وراثيا المزدوج :: GFP / lysC :: DsRED2 وAB السمك (من النوع البري). جمع الأجنة عن طريق التفريخ الطبيعي ورفعها حتى 29 درجة مئوية في المتوسط ​​E3 (5 ملم كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 0.33 ملي MgSO و 0.1٪ الميثيلين الأزرق ومعايرتها إلى درجة الحموضة 7.0) في أطباق بتري. فمن الضروري للحفاظ على كثافة الأجنة لا تتجاوز 50-70 في لوحة.

2. يرقة الفرز

تحقق من كل اليرقات تحت المجسام مضان للتعبير مراسل فلوري، التهاب عفوية ومناسبة تنمية سن ذات الصلة.

3. فحص تحضير متوسط ​​(إعداد دائما الطازجة)

إعداد المتوسطة E3 بدون أزرق الميثيلين تستكمل مع DMSO (1٪ النهائي)، وMS222 (0.05 جم / لتر).

4. CuSO4إعداد (إعداد دائما الطازجة)

وزن أول من CUSO 4ص = 159.6 غرام / مول) وإعداد حل الأوراق المالية 20 ملم في DH 2 O. إعداد 120 ميكرومتر CUSO حل الفريق 4 (من 20 مم وحل الأوراق المالية) في E3/DMSO (1٪) / 222-MS. حماية CUSO 4 حل بعيدا عن الضوء.

5. 384 كذلك التحضير لوحة (384 غرينر Microplate حسنا)

قبل إضافة 20 ميكرولتر من E3/DMSO (1٪) / 222-MS إلى كل بئر مع ماصة عكسي. مطلوب زيادة رأس تتحمل ماصة للتعامل مع الأجنة بعناية دون إلحاق أي اصابة، تستطيع فعل ذلك عن طريق خفض الحافة إلى 2 مم تتحمل. نقل يرقة واحدة في 74 ميكرولتر من المتوسطة إلى كل بئر (84 ميكرولتر من أجل السيطرة غير المعالجة). إذا لزم الأمر، توجيه اليرقات في موقف الأفقي داخل البئر باستخدام مرن إيبندورف Microloader الماصة نصيحة (إيبندورف، 5242 956.003).

إجراء جميع الخطوات التالية لمعالجة السائل مع السائل الروبوتالتعامل مع محطة العمل لضمان معاملة في وقت واحد من جميع اليرقات.

6. العلاج من تعاطي المخدرات

خلط المركبات في لوحة مخزون المخدرات 5 مرات من قبل pipetting صعودا وهبوطا. يضيف 16 ميكرولتر من 7.5X المخدرات لوحة الأوراق المالية إلى كل بئر وتخلط 5 مرات. ضبط موقف طرف في الآبار لمنع الإصابة من اليرقات والاستغناء عن وسيلة في 10 ثانية / ميكرولتر. مزيج المتوسطة في الآبار 4 مرات لضمان توزيع متجانس من المخدرات داخل البئر.

7. حضانة

احتضان لوحة الفحص لمدة 1 ساعة عند 29 درجة مئوية مغطاة بورق الألومنيوم لحماية المركبات، فضلا عن CUSO 4 من ضوء.

8. الكيميائية الجرح

إضافة 10 ميكرولتر من 120 ميكرومتر حل 4 CUSO العمل على كل بئر إلا لضوابط السلبية، مزيج 4 مرات ومرة أخرى احتضان لمدة 1 ساعة على 29 درجة مئوية.

9. غسل

إزالة وتبادل 80 ميكرولتر من لي dium من كل بئر مرتين (في 20 خطوات ميكرولتر) لإزالة المركبات وCUSO 4.

10. صورة اكتساب

بدء الحصول على الصور على المجهر الآلي مقلوب (أي: أوليمبوس المسح ^ R) 90 دقيقة بعد تلقي العلاج النحاس الأولي. مجموعة أولية Z-مستوى بحيث neuromasts من خط اليمين واليسار الخلفي الجانبي مرئية. صورة كل بئر مرة واحدة لكل ساعة في brightfield القنوات، وCy3 GFP في 4 طائرات اتصال (50 مسافة ميكرومتر) باستخدام الهدف 4X (NA = 0.13).

معلومات إضافية حول معالجة الصور والبيانات متاحة عند الطلب.

11. معالجة الصور

1. فرز البيانات

تتم معالجة الصور الخام مع عادتنا البرنامج النصي ابفيف. أول عملية في صورة خط أنابيب المعالجة والفرز من الصور الخام من المجلد مجهر البيانات التي تولدها بشكل جيد، وقناة المعلومات في الوقت نقطة.

ove_step "> 2. التركيز الموسعة

في وقت لاحق البرنامج يخلق صورا التركيز امتدت من 4 طائرات اتصال لكل من القنوات.

3. RGB-تراكب

في الخطوة الأخيرة يتم دمج الصور التركيز الممتدة من 3 إلى قنوات تؤدي إلى صورة RGB-تراكب النهائي.

4. كشف الآلي neuromast

أداة التعرف على الأنماط (ابفيف السريع أداة النماذج IA) يحدد neuromasts داخل تراكب الصور RGB ويخلق منطقة محددة تجريبية من اهتمام في جميع أنحاء neuromasts.

5. الكمي

ضمن المنطقة المحددة تجريبيا من مصلحة المحيطة neuromasts الجرحى وسجل الكريات البيض أحمر فلوري (كما هو مبين بكسل الأحمر) مما أدى إلى قراءات الأولية من ercent ف 1 س الجرمية ccupied بواسطة eukocytes لتر (Paol). على متوسط ​​95.27 ± 2.11٪ (FDA1) و 95.12 ±وقد تم الكشف عن 1.56٪ (FDA2) آبار (اليرقات) بشكل صحيح وبعد ذلك قد تعرضوا لمعالجة المزيد من البيانات. يتم تخزين بيانات الناتج الخام (Paol لكل neuromast الكشف) في ملف TXT وبمثابة إدخال البيانات للمخطوطات MATLAB أن معالجة البيانات الخام أخرى.

12. معالجة البيانات

1. iMaps

ويمكن تقييم نجاح التجارب الفردية التي تصور بياني للPaol الخام إنتاج البيانات في رمز اللون تتحقق مع خرائط التهاب يسمى (iMaps) (الشكل 2). خضراء زاهية يعكس ارتفاع مؤشر الالتهابات الأولية؛ أسود يشير إلى أي التهاب. هذه نظرة سريعة تتيح التعرف السريع على التجارب الفاشلة، والتي يمكن بعد ذلك سيتم استبعادها من تحليل المزيد من البيانات.

2. في المتوسط ​​من الضوابط

كل لوحة تحتوي على 320 مركبات التجريبي الذي يعكسبيانات نقطة واحدة في مركب وتستغرق وقتا نقطة فضلا عن 32 الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي. مراقبة 32 مكررات وبلغ متوسط ​​ويتم احتساب قيمة الانحراف المعياري. لعناصر مشمولة نقاط البيانات فقط في حدود 2 الانحرافات المعيارية.

3. تطبيع

ويتم تطبيع من خلال تحليل البيانات. يتم تعيين قيمة متوسط ​​من DMSO، ويجري التحكم سلبي، إلى 0 وتعيين أعلى Paol المتوسط ​​لمراقبة النحاس إلى 1، بحيث يتم تعيين الحد الأقصى لفرق بين الرقابة الإيجابية والسلبية إلى 1. وخطيا Paol كل مجمع لمحرف أو استقراء للضوابط كل منها على لوحة التجريبية.

4. نهائي قراءة شاملة: مؤشر التهابية

بعد أجريت تجارب تكرار كافية (أي 15)، وبلغ متوسط ​​البيانات الخام تطبيع من تكرار التجارب، مما أدى إلى النهائي للقراءة خارج - للالتهاباتمؤشر. المؤشر الأولي للالتهابات من سيطرة النحاس يبدأ عند 100٪ بالنسبة للوقت نقطة الصفر، ويرتبط الحصول على الصور وقت البدء (90 دقيقة بعد تلقي العلاج النحاس الأولي).

5. رتيب المناسب الانحدار المتسارع

بسبب قرار التهاب مع مرور الوقت ونحن أداء رتيب الأسي المناسب الانحدار غير الخطية نحو التهاب الأولي باستخدام المعادلة 1 - أ 0 هو مقياس للاستجابة الأولية في = ر 0، ويرتبط (أ) 1 إلى المنحدر من ضخامة مع مرور الوقت.

6. 2 مد ميزة مؤامرة الفضاء (الشكل 4)

لتوليد الفضاء ميزة، يتم تطبيق الانحدار غير الخطية ومجموعة التحليل يقسم الفضاء ميزة في مناطق مميزة، مما يسمح بتحديد آلية للمرشحين للاهتمام من فئات المناعية تغييري مختلفة (المضادة للinflammatأوري، المضادة للقرار، الموالية للالتهابات، والمؤيدة للقرار). يتم عرض كافة المركبات في المؤامرة 2-D على أساس معايير 1 0 و 1 1.

13. بيانات المناولة والتخزين

التعامل مع البيانات المتوفرة لدينا إجراءات إنشاء صفحات الويب إلى تصور وتمثل شاشات المخدرات مثل تقديم لمحة سريعة عن الصورة ومعالجة البيانات نتائج الخطوات "، وكذلك على عرض تفصيلي عند الطلب من قبل المستخدم 10. يتم دمج وصلات ميسرة لقواعد البيانات غير المتجانسة الأخرى ذات الصلة والبيولوجية والكيميائية وكذلك لتوفير مصدرا قيما للدراسات المقارنة ورواية 11. من هذه الإجراءات، يتم تعيين البيانات الصحيحة والمعايير ومن metainformation للتخزين على المدى الطويل من هذه البيانات.

14. ممثل النتائج

في شاشة الطيار قمنا بتحليل مكتبة يتألف من 640 وافقت ادارة الاغذية والعقاقير المركبات الحيوية النشطة معروف للآثار في التقدم، وبدء أو قرار من granulالتهابات استجابة ocytic. بالاستناد إلى آثار لاحظنا المصنفة 4 أنواع من الظواهر تغييري المناعية التي قد تكون مؤشرا على وسائط مختلفة للعمل هي: مضادة للالتهابات (1)، المضادة للقرار (2)، الموالية للالتهابات (3) والموالية للقرار، (4) ، والتي يمكن وصفها مع المعلمات 1 0 و 1 (أ)، التي تنشأ من تركيب رتيب الانحدار غير الخطية (ه AO + ALX -) نحو التهاب الأولي. أ 0 يمثل حجم الاستجابة الالتهابية في حين أن 1 يميز المنحدر من منحنى، وبالتالي يصف قرار التهاب. عرض جميع المركبات في مؤامرة ميزة الفضاء 2-D (أ 1 مقابل 1 0) يسمح لتحديد الهوية الآلي للمرشحين ضرب من الفئات تغييري مناعية مختلفة (الشكل 3).

مارست 45 من أصل 640 مركبات كبيرة مضادة للالتهابات عن طريق الحد من تأثير المؤشر الأولي للالتهابات إلى 50٪ أو أقل. ضمن ثيS فئة وجدنا 6 مركبات تابعة لفئة الدوائية من الأدوية المضادة للالتهاب غير الستيرويدية (الخالية)، مما يؤكد صحة وجهة نظرنا. ومع ذلك، في المرتبة المسكنات ليس من بين العقاقير المضادة للالتهابات أقوى. وبصرف النظر عن المسكنات وجدنا عدة فصول إضافية المخدرات الدوائية مثل لحاصرات مستقبلات الأنجيوتنسين سبيل المثال (المجالس) والمضادات الحيوية ومثبطات مضخة البروتون.

التقى 7 مركبات المعايير عتبة محددة تجريبيا للمخدرات المؤيدة للقرار محتمل.

18 الأدوية التي تمارس تأثيرا الموالية للالتهابات، مما أدى إلى تجنيد مبالغ فيه الكريات البيض إلى neuromasts بجروح بالمقارنة مع الضوابط الإيجابية.

منعت فقط 2 مركبات القرار في الوقت المناسب للاستجابة للالتهابات.

تأثير مضاد للالتهابات من المرشحين ضرب عدة (المرشحين مثالي من المذكورة أعلاه الطبقات المخدرات الدوائية) من الطيار قد يزيد عدد الجياع الشاشةوأكد أن د بطريقة تعتمد على الجرعة في فحوصات لاحقة الذقن الثانوية (لا تظهر البيانات). ولم إعادة الاختبار من 4 المخدرات المؤيدة للقرار محتمل من تأكيد وضع المشار إليه من العمل وبذل في الشاشة الرئيسية. وكان 2 من المخدرات طفيف المضادة للالتهابات محتملة في تركيزات أعلى (20 ميكرون). عرضت دواء ثالث هامشية غير تعتمد على الجرعة المضادة للالتهابات تأثير المخدرات بتركيزات تتراوح بين 5-20 ميكرون. وكان هذا الدواء 4 أي تأثير على الاستجابة الالتهابية في تركيزات التي تم اختبارها.

الشكل 1
الشكل 1. وتوزع يدويا سير العمل لفحص الذقن. فردي مركب المعدلة وراثيا cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 اليرقات (3 DPF) في لوحات microtiter 384 أيضا. تضاف المخدرات في وقت واحد على كل باستخدام بئر التعامل مع النسيم العليل السائل الميثاق محطة العمل. وحضنت ثم لوحات فحص لمدة 1 ساعة على 29 درجة مئوية. المعاملة مع CUSO 4

الشكل 2
الشكل 2. نظرة عامة على صورة من الصور الخام ويوضح الشكل الصور الخام من 4 طائرات اتصال (Z = 0 - 3) على مسافات من 50 ميكرومتر في القنوات Cy3 (يسار) وGFP (يمين)، على التوالي. سهام (Z = 1،2) تشير neuromasts مثالي، رؤوس سهام (Z = 1،2) نقطة إلى الكريات البيض تتجمع حول neuromasts.

الشكل (3)
الشكل 3. خرائط التهاب (iMaps) ويمكن تقييم نجاح بعض المحاولات الفردية في iMaps يعكس استجابة التهابية (بيانات أولية) في رمز اللون: أخضر لامع يعكس ارتفاع infla الأولية استجابة mmatory؛ أسود يشير إلى أي التهاب iMaps في 0 timepoint (يسار) وتستغرق وقتا نقطة 5 (يمين) تظهر بوضوح ما إذا كان ينبغي أن تدرج عبارة عن تجربة في معالجة المزيد من البيانات. ضوابط النحاس (صف 13 و 24) تظهر في اختلاف الوانها من الاخضر، في حين DMSO مراقبة الآبار (الصف 1 و 12) تظهر في الأخضر الداكن أو الأسود. في نقطة في الوقت 5، يتم حل ما يقرب من التهاب في الضوابط والنحاس، وأشارت الآن في ظلال داكنة من اللون الأخضر أو الأسود. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 4
الشكل 4. وافقت 2 مد ميزة مؤامرة الفضاء من 320 مركبات من ادارة الاغذية والعقاقير مكتبة والضوابط الخاصة بكل منها. يمكن عرض كل الآبار مركب في مؤامرة ميزة الفضاء 2-D على أساس معايير 1 0 و 1 1، والتي تنشأ من غير الخطية الانحدار المناسب (d/4203/4203eq1.jpg "ALT =" المعادلة 1 "/>) نحو التهاب الأولي. هذه المؤامرة مساحة تسمح ميزة التعرف الآلي للمرشحين للاهتمام الذين ينتمون إلى إحدى الفئات التالية المناعية تغييري 4 الذي قد يكون مؤشرا على المخدرات 'طريقة العمل:. المضادة للالتهابات (1)، المضادة للقرار (2)، الموالية للالتهابات (3) والمؤيدة للقرار (4) انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl sulphoxide Carl Roth GmbH Co KG A994.2
Copper(II) sulphate anhydrous Carl Roth GmbH Co KG PO23.1
FDA approved drug library Enzo Life Sciences BML-2841-0100
384 microwell plate Non-binding, μClear Greiner 781906 black
Olympus scan^R Olympus
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation Caliper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, R. T., Fishman, M. C. Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish. Methods Cell Biol. 76, (2004).
  2. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).
  3. Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish. J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).
  4. Martin, J. S., Renshaw, S. A. Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease. Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).
  5. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  6. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
  7. Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
  8. D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish. BMC Biol. 8, 151 (2010).
  9. Haas, P., Gilmour, D. Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line. Dev Cell. 10, 673-680 (2006).
  10. Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge. Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).
  11. Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. Harvester': a fast meta search engine of human protein resources. Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics