촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

Immunology and Infection
 

Summary

여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

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Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).

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Abstract

Zebrafish의 애벌레는 작은 크기와 조작과 관찰의 상대적 용이성뿐만 아니라 시행 때 화합물은 단순히 입욕 물에 추가할 수 있으며, 쉽게 흡수되고있다는 사실로 인해 작은 분자 스크린 1,2 전체 동물에 특히 의무가 있습니다 <1 % DMSO 솔루션입니다. zebrafish 애벌레와 leukocytes에 형광 단백질을 표현 형질 전환 라인의 가용성의 광학 선명도 때문에 zebrafish는 생체내에 급성 염증 반응을 모니터링의 독특한 장점을 제공합니다. 따라서, 높은 처리량과 면역 - modulatory 화합물의 식별을 목표로 우수한 컨텐츠 작은 분자 화면에 대한 zebrafish을 활용하면, 염증 유도 시나리오 지느러미 조직에서화된 닉스를 예의 노른자 표면으로 이동 레이저 손상을 제안, 3-6 제안되었습니다 배아 7 tailfin 절단 3,5,6. 이러한 방법의 주요 단점은 있지만였다수동 유충 조작의 요구하므로 높은 처리량 검사를 방지할 남긴 상처를 유발합니다. 화학적으로 유도된 염증 (친) 분석 8 도입은 이러한 장애물을 제거. 남긴 상처를 입은 있기 때문에 화학적으로 동시에 치료할 수 배아의 개수는 거의 제한이 없습니다. 구리 황산과 zebrafish 애벌레의 임시 치료 선택 측면 라인 시스템 및 부상 neuromasts에 대한 신속한 과립 모집 결과의 세포에서 세포 죽음을 유도합니다. 염증성 반응은 화합물 유전자 변형 cldnB :: GFP / lysC :: neuromast 세포뿐만 아니라 빨간 형광 단백질 상표 granulocytes에 녹색 형광 단백질을 표현 DsRED2 6,9 zebrafish 애벌레를 사용하여 실시간으로 따라 할 수 있습니다.

모두 높은 컨텐츠와 높은 처리량 분석을 허용 심사 전략을 고안하기 위하여 우리는 로봇 액체 핸들링과 결합된 자동 micr을 도입사용자 정의 개발 소프트웨어 스크립트 oscopy. 이 스크립트는 부상 녹색 형광 neuromasts를 둘러싼 경험적으로 정의된 영역 내에 빨간색 형광 leukocytes에 의해 점령 %의 영역을 채점하여 염증 반응의 자동 부량 수 있습니다. 또한, 자동 데이터 처리, 처리, 시각화, 스토리지는 MATLAB과 파이썬 스크립트를 개발 정의에 기초.

간단한에서는 granulocytic 염증 반응의 개시, 진행이나 ​​해상도에 미치는 영향에 대한 화학적 화합물의 테스트를 허용 자동 HC / HT 화면을 소개합니다. 이 프로토콜은 타고난 면역 반응의 오케스트 레이션에 관련된 약물 메커니​​즘과 경로보다 심층적인 분석을위한 좋은 출발점을 제공합니다. 앞으로, 그것은 약물 발견의 초기 단계에서 참을 독성이나 오프 타겟 효과를 식별하는 데 도움함으로써 약물 개발을위한 절차적 위험과 비용을 절감할 수 있습니다.

Protocol

1. 동물 처리

친 분석 사용 3 dpf의 애벌레는 homozygous 이중 형질 전환 cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2와 AB (야생 형) 물고기 사이의 그룹 matings 인한하십시오. 자연 산란에 의해 배아를 수집 29에서 그들을 키울 ° 배양 접시에 E3 중간에 C (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.33 MM MgSO 4, 파랑의 0.1 %의 메틸렌, 산도 7.0 equilibrated). 그것은 접시 당 50-70를 초과하지 배아의 밀도를 유지하기 위해 필수적입니다.

2. 유충 정렬

형광 기자의 표현, 자발적인 염증과 적절한 연령 관련 개발을위한 형광 입체경 미만의 모든 애벌레를 확인하십시오.

3. 상영 매체 준비 (항상 신선한를 준비)

DMSO (1 % 최종)과 MS222 (0.05 G / L)로 보완 메틸렌 블루없이 E3 매체를 준비합니다.

4. CuSO4준비 (항상 신선한 준비)

첫째 CuSO 4 아웃 무게 (M R = 159.6 g / 몰) DH와 20 밀리미터 주식 솔루션을 준비하는 O. E3/DMSO (1 %) / MS-222에서 120 μm의 CuSO 4 작업 솔루션 (20 밀리미터 주식 용액에서) 준비합니다. 빛으로부터 CuSO 4 용액을 보호합니다.

5. 384 잘 플레이트 준비 (Greiner 384 자 Microplate)

역방향 피펫으로 각각 잘으로 E3/DMSO (1 %) / MS-222의 20 μl를 사전에 추가합니다. 증가 피펫 팁을 구멍은 어떤 남긴 상처를 보면서 겁에 질리게하지 않고 신중하게 배아를 처리하는 데 필요한, ​​이것은 보어 2mm로 팁을 절단하여 이루어집니다. 각도 (치료 제어를위한 84 μl)로 매체의 74 μl의 단일 유충을 전송합니다. 필요한 경우, 잘 내에서 수평 위치에 동양의 유충은 유연 Eppendorf Microloader 피펫 팁 (; 5242 956.003 Eppendorf)를 사용합니다.

로봇 액체로 모두 다음과 같은 액체 처리 단계를 실시모든 애벌레의 동시 치료를 보장하기 위해 워크 스테이션을 취급.

6. 약물 치료

아래로 pipetting 및하여 약물 주식 판의 화합물 5 회를 섞습니다. 각도에 7.5X 약물 주식 판 16 μl을 넣고 5 번 섞는다. 애벌레의 부상을 방지하고 10 μl / s의 매체를 하는걸 우물 이내 팁 위치를 조정합니다. 잘 내에서 약물의 동질적인 유통을 보장하기 위해 우물의 중간 4 회를 섞습니다.

7. 잠복

29에서 1 H에 대한 검사 판을 품어 ° C에서 빛으로부터뿐만 CuSO 4와 같은 화합물을 보호하기 위해 알루미늄 호일 있었다.

8. 화학 남긴 상처

부정적인 컨트롤 믹스 4 배까지를 제외하고 각 잘 ~ 120 μm의 CuSO 4 작업 용액 10 μl를 추가 29에서 1 H에 다시 품어 ° C.

9. 세정

나 80 μl를 제거하고 교환 각각의 dium 잘 회 (20 μl 단계에서) 화합물을 제거하고 CuSO 4.

10. 이미지 수집

90 분이면 초기 구리 치료 : 거꾸로 자동화된 현미경 (올림푸스 스캔 ^ R IE)에서 이미지 수집을 시작합니다. 좌우 측면 후부 라인 neuromasts가 표시되도록 초기 Z-레벨을 설정합니다. 이미지가 각각 잘 한 채널 brightfield에서 시간당 4 초점 비행기 (50 μm의 거리)에 Cy3와 GFP는 4X 목적 (NA가 = 0.13)을 사용합니다.

이미지 및 데이터 처리에 대한 자세한 내용은 요청시 가능합니다.

11. 이미지 처리

1. 정렬 데이터

RAW 이미지는 우리의 정의 LabView 소프트웨어 스크립트로 처리됩니다. 영상 처리 파이프라인의 첫 번째 작업은 채널, 잘하고 시간이 지점 정보에 의해 현미경 생성된 데이터 폴더에서 원시 이미지 정렬됩니다.

ove_step "> 2. 확장 초점

이후 소프트웨어 채널의 각 4 초점 비행기에서 연장 초점 이미지를 생성합니다.

3. RGB-오버레이

마지막 단계에서는 3 채널의 확장된 초점 이미지는 최종 RGB-오버레이 이미지에 결과로 병합됩니다.

4. 자동 neuromast 검출

패턴 인식 도구 (LabView 래피드 아이오와 프로토 타이핑 도구)는 RGB 오버레이 이미지 내에서 neuromasts를 식별하고 neuromasts 주위의 관심 경험적으로 정의된 영역을 만듭니다.

5. 부량

부상당한 neuromasts 주변 관심 경험적으로 정의된 영역 내에 빨간색 형광 leukocytes는 (빨강 픽셀로 반영) eukocytes (Paol)에 의해 ccupied P ercent 정말이에요 O의 기본 판독 결과 채점됩니다. 평균 95.27 ± 2.11 % (FDA1) 및 95.12 ±에우물 (애벌레)의 1.56 % (FDA2)을 제대로 감지하고 있으며 이후 추가로 데이터 처리를 받게되었습니다. 원시 데이터 출력 (각 감지 neuromast 대한 Paol) txt 파일에 저장하고 추가로 원시 데이터를 처리하는 MATLAB 스크립트를위한 데이터 입력으로 제공됩니다.

12. 데이터 처리

1. iMaps

색상 코드에서 원시 데이터 출력 Paol의 그래픽 시각화에 의한 개별 실험의 성공 여부를 평가하는 것은 소위 염증지도 (iMaps) (그림 2)로 실현될 수 있습니다. 밝은 초록색은 높은 초기 염증 지수를 반영, 블랙은 염증을 나타냅니다. 이것은 간략하게 다음 추가 데이터 분석에서 제외됩니다 실패한 실험의 신속한 식별을 허용합니다.

2. 컨트롤의 평균

각 실험 음식을 반영하는 320 화합물이 포함되어 있습니다단일 데이터는 각각 화합물 및 시간 - 포인트뿐만 아니라 32 긍정적이고 부정적인 통제에 따라 지적한다. 32 제어 복제는 평균과 표준 편차를 계산합니다. 컨트롤의 2 표준 편차 이내에만 데이터 포인트가 포함되어 있습니다.

3. 표준화

정상화는 스프레드 시트 분석을 통해 이루어집니다. 부정적인 제어되는 DMSO의 평균 값은, 0으로 설정되고 구리 컨트롤에 대한 높은 평균 Paol은 긍정적이고 부정적인 통제 사이의 최대 차이가 1로 설정되어 있도록 1로 설정됩니다. 각 화합물의 Paol는 선형적으로 보정이나 실험용 접시에 각각의 컨트롤로 추정된다.

4. 최종 읽기 아웃 : 염증성 지수

충분한 복제 실험 (즉 15)이 실시되고 나면, 복제 실험에서 표준 원시 데이터 읽기 아웃 최종 결과, 평균값이된다 - 염증색인. 구리 컨트롤의 초기 염증 지수는 시간이 포인트 제로를위한 100 % 시작과 이미지 수집 시작 시간 (90분 초기 구리 치료 후)에 연결합니다.

5. Monotonic 지수 회귀 피팅

시간의 경과에 염증 해상도로 인해 우리가 사용하여 초기 염증 향해 monotonic 지수 비선형 회귀 피팅을 수행 등식 1 - 0 t = 0에서 초기 대응을위한 조치이며, 1 시간에 따른 규모의 슬로프와 관련되어 있습니다.

6. 2-D 기능 공간 계획 (그림 4)

기능 공간을 생성하려면 비선형 회귀가 적용되고 클러스터 분석은 따라서 다른 면역 - modulatory 카테​​고리에서 재미있는 후보자의 자동 식별 (안티 inflammat 수 있도록, 특색있는 지역으로 기능 공간을 분할ory, 안티 해상도, 프로 - 염증, 프로 해상도). 모든 화합물은 매개 변수가 0과 1을 바탕으로 2 차원 플롯에 표시됩니다.

13. 데이터 처리 및 저장

우리의 데이터는 루틴과 같이 '결과뿐만 아니라, 사용자가 10 요청 상세한 전망을 처리 빠르게 이미지의 개요 및 데이터를 제공하는 등 마약 화면을 시각화하고 표현하는 웹 페이지를 만드는 처리. 기타 관련 이종 생물 학적 및 화학적 데이터베이스에 대한 소프트 링크는 비교과 소설 연구 11 귀중한 자원을 제공하기 위해뿐만 아니라 통합되었습니다. 이러한 루틴으로, 적절한 데이터 표준 및 metainformation이 데이터의 장기 보관을 위해 설정됩니다.

14. 대표 결과

파일럿 화면에서 우리는 640로 구성된 라이브러리를 분석 FDA는 granul의 개시, 진행이나 ​​해상도에 대한 영향에 대해 알려진 bioactive 화합물을 승인ocytic 염증 반응. 우리는 행동 다른 모드는 지표가 될 수 있습니다 면역 modulatory의 phenotypes의 4 가지 유형 분류 관찰된 효과를 바탕으로 : 안티 - 염증성를 (1), 안티 해상도 (2), 프로 - 염증 (3) 및 프로 해상도 (4) 어느 monotonic 비선형 회귀 피팅 (E AO + alx -)에서 발생하는 매개 변수가 0과 1로 표현할 수있는 초기 염증 큰 기여를했다. 1 곡선의 기울기를 특징 때문에 염증 해상도를 설명 반면 0 염증 반응의 정도를 나타냅니다. 2-D 기능 공간 줄거리 (01)에있는 모든 성분을 표시하는 것은 다른 면역 modulatory 카테고리에서 충돌 후보자 (그림 3)의 자동 식별을 허용합니다.

640 화합물의 밖으로 45 50 % 이하로 초기 염증성 인덱스를 줄임으로써 상당한 안티 - 염증성 효과를 진력. 생 이내의 범주 우리는 6 화합물 우리 접근법의 유효성을 확인하는 비 steroidal 안티 - 염증성 약물 (NSAIDs)의 pharmacological 클래스에 속하는 발견. 그러나, NSAIDs는 가장 강력한 항정 염증성 약물끼리 위를 기록했다. 이외 NSAIDs에서 우리는 이러한 예제 안지오텐신 수용체 차단제 (ARBs), 항생제 및 프로톤 펌프 억제제에 대한 같은 몇 가지 추가 pharmacological 약물 클래스를 발견.

7 화합물은 잠재적 프로 해상도 의약품에 대한 경험적으로 정의된 임계값 기준을 만났습니다.

18 마약 긍정적인 컨트롤에 비해 부상 neuromasts로 과장 백혈구 모집 결과, 프로 - 염증 효과를 진력.

오직 두 화합물은 염증 반응의 적시 해상도를 못했습니다.

파일럿 화면 coul에서 여러 히트 후보자의 안티 - 염증성 효과 (위에서 언급한 pharmacological 약물 클래스에서 모범적인 후보자)D는 이후 보조 턱 assays (데이터가 표시되지 않음)에 복용 종속적인 방식으로 확인됩니다. 기본 화면에 진력으로 4 잠재적인 프로 해상도 의약품의 Retesting 행동의 지정된 모드를 확인하지 않았다. 약물 2는 높은 농도 (20 μm의)에서 약간의 안티 - 염증성 잠재력을했다. 20 μm의 - 세번째 약물은 5에서부터 약물 농도에 한계가 아닌 선량 종속 항 염증 효과를 전시. 네 번째 약물 테스트 농도에서 염증 반응에 아무런 영향을 미치지 않았다.

그림 1
1 그림. 친 분석의 워크플로우. 개별 화합물 유전자 변형 cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 애벌레 (3 dpf)을 수동으로 384 잘 microtiter 접시에 배포됩니다. 약물이 잘 제퍼 컴팩트 액체 처리 워크 스테이션을 사용하여 각에 동시에 추가됩니다. 검정 접시 그러면 29에서 1 H 위해 incubated있다 ° C. CuSO 4 치료

그림 2
그림 2. . 채널을 각각 Cy3 (왼쪽)와 GFP (오른쪽)이 50 μm의의 거리에서 - 개요 RAW 이미지의 그림은 그림 4 초점 비행기 (3 Z = 0)의 RAW 이미지를 보여줍니다. 화살표 (Z = 1,2) neuromasts 주변 클러스터된 leukocytes의 모범 neuromasts, 화살촉 (Z = 1,2) 지점을 나타냅니다.

그림 3
그림 3. 염증지도 (iMaps) 각 실험의 성공은 색상 코드의 염증성 반응 (원시 데이터) 반영 iMaps로 평가하실 수 있습니다. 밝은 녹색은 높은 초기 infla을 반영 mmatory 반응, 블랙이 더 염증을 나타냅니다 timepoint 0 (왼쪽)와 시간 - 포인트 5 (오른쪽)에서 iMaps 분명 실험이 추가로 데이터 처리에 포함해야하는지 여부를 보여줍니다.. DMSO 제어 우물 (행 1, 12) 녹색의 어두운 또는 검은색에 나타나는 반면 구리 컨트롤 (행 13, 24), 녹색의 음영 변화에 표시됩니다. 시간 - 포인트 5, 염증이 거의 지금 녹색 또는 검은색의 어두운 그늘에 나타나, 구리 컨트롤에서 해결되었습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 4
4 그림. FDA는 320 화합물의 2 차원 기능 공간 줄거리는 라이브러리 및 각각의 컨트롤을 승인했습니다. 모든 화합물 우물은 비선형에서 발생하는 매개 변수를 0과 1을 기반으로 2 차원 기능 공간 계획에 표시할 수 있습니다 회귀 피팅 (d/4203/4203eq1.jpg "고도 ="초기 염증을 향해 / 수식 1 ">가).이 기능은 공간 줄거리는 마약을 나타내는 수도 있습니다 다음 4 면역 - modulatory 범주 중 하나에 속하는 흥미로운 후보자의 자동 식별을 허용 행동 '모드 :. 안티 염증성 (1), 안티 해상도 (2), 프로 - 염증 (3) 및 프로 해상도 (4) 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

Discussion

Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl sulphoxide Carl Roth GmbH Co KG A994.2
Copper(II) sulphate anhydrous Carl Roth GmbH Co KG PO23.1
FDA approved drug library Enzo Life Sciences BML-2841-0100
384 microwell plate Non-binding, μClear Greiner 781906 black
Olympus scan^R Olympus
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation Caliper

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References

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