Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

Immunology and Infection
 

Summary

Aqui nós descrevemos um romance de alto teor de ensaio inflamação induzido quimicamente visando a identificação de moduladores-imune bioativos. Temos sucesso combinado microscopia automatizada com scripts personalizados de software desenvolvidos permitindo a quantificação automática da resposta inflamatória, bem como processamento de dados ainda mais, a análise, mineração e de armazenamento.

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Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).

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Abstract

Larvas Zebrafish são particularmente sensíveis ao animal como um todo pequena molécula 1,2 telas devido ao seu pequeno tamanho e relativa facilidade de manipulação e de observação, bem como o facto de que os compostos podem ser simplesmente adicionados à água de banho e são facilmente absorvidos quando administrados em uma <1% de solução de DMSO. Devido à claridade óptica de larvas do peixe-zebra e da disponibilidade de linhas transgénicas que expressam proteínas fluorescentes em leucócitos, peixe-zebra oferecem a vantagem única de monitorização uma resposta inflamatória aguda in vivo. Por conseguinte, utilizando o peixe-zebra de alta conteúdo telas de moléculas pequenas destinadas à identificação de moduladores-imune compostos com alta taxa de transferência tem sido proposto 3-6, sugerindo cenários indução da inflamação, por exemplo, entalhes localizadas no tecido fin, danos de laser dirigido para a superfície de gema de 7 embriões ou tailfin amputação 3,5,6. A principal desvantagem destes métodos, porém, foio requisito de manipulação manual do larva para induzir ferimento, impedindo assim a seleção de alto rendimento. Introdução da inflamação induzida quimicamente (queixo) ensaio 8 eliminou esses obstáculos. Uma vez que ferimento é infligida quimicamente o número de embriões que podem ser tratadas simultaneamente é virtualmente ilimitada. Tratamento temporário de larvas do peixe com sulfato de cobre seletivamente induz a morte celular nas células ciliadas do sistema de linha lateral e os resultados no recrutamento de granulócitos rápida para neuromasts feridos. A resposta inflamatória pode ser seguido em tempo real, utilizando o composto transgénico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larvas do peixe 6,9 que expressam uma proteína verde fluorescente em células neuromastos, bem como um vermelho granulócitos marcação fluorescente da proteína.

A fim de elaborar uma estratégia de rastreamento que permita ambas as análises de conteúdo de alta e de alto rendimento, introduzimos manipulação de líquidos robótica e micr automatizada combinadaoscopy com um script personalizado software desenvolvido. Este script permite a quantificação automática da resposta inflamatória, marcando a área ocupada por cento fluorescentes vermelhas leucócitos dentro de uma área definida empiricamente em torno feridos verdes neuromasts fluorescentes. Além disso, o processamento automatizado de dados, manipulação, visualização e armazenamento de todas baseadas no costume desenvolvido MATLAB e scripts Python.

Em resumo, introduzimos uma tela HC / HT automatizado que permite o teste de compostos químicos para o seu efeito sobre a progressão da iniciação, ou a resolução de uma resposta inflamatória granulocítica. Este protocolo serve um bom ponto de partida para mais análises aprofundadas de mecanismos de drogas e vias envolvidas na orquestração de uma resposta imune inata. No futuro, pode ajudar a identificar os efeitos tóxicos intoleráveis ​​ou meta-off em fases anteriores da descoberta da droga e, assim, reduzir riscos e custos processuais para o desenvolvimento de drogas.

Protocol

1. Manejo dos animais

Para o queixo ensaio utilização larvas dpf 3 resultantes de cruzamentos do grupo entre homozigotos duplo transgênico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 e peixe AB (tipo selvagem). Recolher embriões por desova natural e levantá-los a 29 ° C em meio E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, e de metileno 0,1% de azul, equilibrada a pH 7,0) em placas de Petri. É essencial para manter uma densidade de embriões não superiores a 50-70 por placa.

2. Classificação Larva

Confira todas as larvas sob um estereoscópio de fluorescência para a expressão repórter fluorescente, inflamação espontânea e desenvolvimento adequadas à idade relacionados.

3. Preparação Triagem Médio (Sempre preparar fresco)

Preparar meio E3 sem azul de metileno suplementado com DMSO (1% final) e MS222 (0,05 g / l).

4. CuSO4Preparação (Sempre preparar fresco)

Primeiro pesar CuSO4 (M r = 159,6 g / mol) e preparar uma solução-mãe 20 mM em dH2O Preparar 120 uM CuSO Solução de trabalho de 4 (a partir de 20 mM de solução stock) em E3/DMSO (1%) / MS-222. Proteja CuSO 4 solução da luz.

5. 384-bem Preparação Plate (Greiner 384 Bem Microplaca)

Pré-adicionar 20 ul de E3/DMSO (1%) / MS-222 a cada poço com uma pipeta inversa. Um aumento da pipeta furo é necessário para lidar com os embriões cuidadosamente sem infligir qualquer ferimento, o que é feito cortando a ponta de um furo de 2 mm. Transferir larva único em 74 uL de meio a cada poço (84 uL para o controlo não tratado). Se necessário, orientar as larvas em posição lateral no interior da cavidade utilizando um flexível Eppendorf Microloader pipeta (Eppendorf; 5242 956,003).

Conduz todos os passos seguintes para manipulação de líquidos com um líquido robômanuseamento da estação de trabalho para assegurar o tratamento simultâneo de todas as larvas.

6. Tratamento de Drogas

Misture compostos em chapa estoque de drogas 5 vezes por pipetagem cima e para baixo. Adicionar 16 ul de estoque de chapa 7.5x droga a cada poço e misturar 5 vezes. Ajuste a posição da ponta dentro dos poços para evitar lesões de larvas e dispensar o médio de 10 s / ul. Misturar médio em poços 4 vezes para assegurar uma distribuição homogénea do fármaco no interior do poço.

7. Incubação

Incubar placa de rastreio durante 1 h à 29 ° C coberto com folha de alumínio para proteger compostos, bem como CuSO 4 a partir de luz.

8. Ferir Química

Adicionar 10 ul de 120 mM CuSO4 solução de trabalho para cada poço, excepto para controlos negativos, mistura de 4 vezes e incubar novamente durante 1 h em 29 ° C.

9. Lavagem

Retire e trocar 80 ul de mim sódio de cada poço duas vezes (em passos de 20 ul) para remover compostos, bem como CuSO4.

10. Aquisição de Imagem

Iniciar a aquisição da imagem em um microscópio invertido automatizado (isto é: Olympus digitalização ^ r) 90 minutos após o tratamento de cobre inicial. Definir inicial z nível para que neuromasts de direita e esquerda da linha lateral posterior são visíveis. Imagem cada poço uma vez por hora no brightfield canais, Cy3 e GFP em 4 planos focais (50 distância mm) usando uma objetiva de 4x (NA = 0,13).

Informações adicionais sobre a imagem e processamento de dados estão disponíveis mediante solicitação.

11. Processamento de Imagem

1. Dados de classificação

Imagens brutas são processados ​​com nosso script personalizado software LabView. A primeira operação no pipeline de processamento de imagem é a classificação de imagens brutas do microscópio pasta de dados gerado pelo bem do canal, e tempo-informação.

ove_step "> 2 foco. prolongado

Subsequentemente, o software cria imagens de foco estendidos a partir de 4 planos de contacto para cada um dos canais.

3. RGB-overlay

Em uma última etapa as imagens desfocadas estendidos a partir dos 3 canais são combinadas para resultar em uma imagem RGB-sobreposição final.

4. Detecção automática neuromasto

Uma ferramenta de reconhecimento de padrões (LabView rápida IA ​​ferramenta de prototipagem) identifica neuromasts dentro das imagens de sobreposição RGB e cria uma área empiricamente definida de interesse em torno dos neuromasts.

5. Quantificação

Dentro da área empiricamente definido de interesse em torno neuromasts lesionados vermelhas leucócitos fluorescentes (reflectido como pixels vermelhos) são pontuados resultando em uma leitura primária de p ercent um ó rea ccupied por eukocytes l (PAOL). Em média 95,27 ± 2,11% (FDA1) e 95,12 ±1,56% (FDA2) de poços (larvas) foram detectados de forma adequada e foram subsequentemente submetidos a processamento de dados adicional. A saída de dados brutos (PAOL para cada neuromasto detectado) é armazenado em um arquivo txt e serve como entrada de dados para os scripts do MATLAB que processam os dados brutos mais.

12. Informática

1. Imaps

Avaliar o sucesso de experiências individuais através da visualização gráfica da PAOL-prima de dados de saída em um código de cor pode ser realizado com os mapas chamados inflamação (imaps) (Figura 2). Verde brilhante reflete um índice inicial de alta inflamatória; preta indica que não há inflamação. Esta visão rápida permite a identificação rápida de experiências com falha, que pode então ser excluídos da análise de dados complementares.

2. Média de controles

Cada placa experimental contém 320 compostos refletindo umadados de ponto único por composto eo tempo de ponto, bem como 32 controlos positivos e negativos, respectivamente. O controle de 32 repetições são média e desvio padrão é calculado. Para os controlos apenas os pontos de dados dentro de 2 desvios padrão estão incluídos.

3. Normalização

A normalização é feita por análise de planilhas. O valor médio de DMSO, sendo o controlo negativo, é definido como 0 e os mais altos PAOL calculada a média para o controlo de cobre é definido como 1, de modo que a diferença máxima entre o controlo positivo e negativo é definido como 1. PAOL cada composto é linearmente interpolados ou extrapolados para os controlos respectivos na placa experimental.

4. Final ler-out: índice Inflamatória

Depois de experiências duplicadas suficiente (ou seja 15) foram realizados, normalizados dados brutos de experiências duplicadas são em média, resultando em uma final ler-out - o inflamatóriaíndice. O índice de inflamatória inicial do controle de cobre começa a 100% para o tempo de ponto zero e correlaciona-se para a imagem de tempo de início de aquisição (90 minutos após o tratamento de cobre inicial).

5. Montagem de regressão exponencial Monotonic

Devido à resolução da inflamação ao longo do tempo realizamos um ajuste de regressão monotônica exponencial não-linear para a inflamação inicial usando Equação 1 - Um 0 é uma medida para a resposta inicial em t = 0, um 1 está relacionada com a inclinação da magnitude ao longo do tempo.

6. 2-D trama espaço de características (Figura 4)

Para gerar o espaço de características, uma regressão não-linear e é aplicado um cluster de análise-divide o espaço de características em regiões característicos, permitindo assim que identificação automática de candidatos interessantes de diferentes modulatórios-imune categorias (anti-inflammatteoria, anti-resolução, pró-inflamatória, de resolução de pro). Todos os compostos são apresentados no gráfico 2-D com base nos parâmetros de um 0 e um 1.

13. Manuseio e Armazenamento de Dados

Nossos dados manipulação rotinas criar páginas web para visualização e representam as telas de drogas tais fornecendo uma visão rápida da imagem e processamento de dados dos resultados passos, bem como uma visão detalhada, quando solicitada pelo usuário 10. Soft links para outros bancos de dados heterogêneos relevantes biológicas e químicas são integrados, assim como para fornecer um recurso valioso para estudos comparativos e romance 11. Por essas rotinas, normas adequadas de dados e metainformação são definidas para armazenamento a longo prazo destes dados.

14. Os resultados representativos

Em uma tela de piloto analisamos uma biblioteca composta de 640 aprovados pela FDA conhecidos compostos bioativos para efeitos na progressão da iniciação, ou resolução de um granulresposta inflamatória ocytic. Com base nos efeitos observados nos classificados 4 tipos de fenótipos moduladores do sistema imunológico que podem ser indicativos de diferentes modos de ação: anti-inflamatórios (1), a resolução anti-(2), pro-inflamatória (3) e pró-resolução (4) , que pode ser descrito com os parâmetros um 0 e um 1, que surgem a partir de um encaixe de regressão não-linear monotónica (e AO + alx -) para a inflamação inicial. A 0 representa a magnitude da resposta inflamatória ao passo que um 1 caracteriza o declive da curva e, assim, descreve resolução da inflamação. Mostrar todos os compostos num lote espaço 2-D característica (um 1 vs um 0) permite a identificação automática de candidatos atingidos a partir das diferentes categorias modulatórios imunes (Figura 3).

45 para fora de 640 compostos exerceu efeito anti-inflamatória significativa através da redução do índice de inflamatória inicial a 50% ou menos. Dentro this categoria encontramos 6 compostos pertencentes à classe farmacológica de não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides), confirmando a validade da nossa abordagem. No entanto, os AINE não classificado entre os mais potentes anti-inflamatórios. Além dos AINEs encontramos várias classes de drogas farmacológicas adicionais como, por exemplo, os bloqueadores do receptor da angiotensina (BRA), antibióticos e inibidores da bomba de protões.

7 compostos preencheram os critérios de limite empiricamente definidos para potenciais pró-resolução drogas.

18 medicamentos exerceu um efeito pró-inflamatória, resultando em recrutamento de leucócitos exagerada a neuromasts feridos em comparação com os controlos positivos.

Apenas 2 compostos impediu a resolução atempada da resposta inflamatória.

O efeito anti-inflamatório de candidatos vários hit (candidatos exemplares acima mencionados a partir de classes de drogas farmacológicas) a partir do ecrã coul pilotod ser confirmado, de maneira dose-dependente em subsequentes ensaios Chin secundárias (dados não mostrados). Novo teste de 4 potenciais pró-drogas resolução não confirmar o modo de ação indicada como exercida na tela principal. 2 dos fármacos tinham um potencial anti-inflamatório ligeiro em concentrações mais elevadas (20 mM). Uma terceira droga exibiu um marginal não-dose-dependente efeito anti-inflamatório em concentrações que variam de drogas 5-20 uM. O quarto fármaco não teve nenhum efeito sobre a resposta inflamatória com as concentrações testadas.

A Figura 1
Figura 1. Fluxo de Trabalho do ensaio Chin. Individual composto transgênico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larvas (3 dpf) são manualmente distribuídas em placas de microtitulação 384-bem. Drogas são adicionados simultaneamente a cada cavidade utilizando um Zephyr Workstation Handling Compact líquido. Placas de ensaio são então incubadas durante 1 h em 29 ° C. O tratamento com CuSO 4

A Figura 2
Figura 2. . Resumo imagem de imagens brutas A figura mostra imagens brutas de 4 planos focais (Z = 0 - 3) a distâncias de 50 um dos canais Cy3 (esquerda) e GFP (direita), respectivamente. Setas (Z = 1,2) indicam neuromasts exemplares, pontas de seta (Z = 1,2) apontam para cerca de leucócitos cluster neuromasts.

A Figura 3
Figura 3. Mapas inflamação (IMAPS) O sucesso das experiências individuais podem ser avaliados em imaps refletindo a resposta inflamatória (dados brutos) em um código de cores: verde brilhante. Reflete uma inflação alta inicial resposta mmatory; preta indica que não há inflamação imaps no instante 0 (esquerda) e tempo-5 (à direita) mostram claramente se um experimento devem ser incluídos no tratamento dos dados.. Controles de cobre (linha 13 e 24) aparecem em vários tons de verde, enquanto DMSO poços de controlo (linha 1 e 12) aparecem em verde escuro ou preto. Em tempo de ponto-5, a inflamação é quase resolvido nos controles de cobre, agora indicado em tons escuros de verde ou preto. Clique aqui para ver maior figura .

A Figura 4
Figura 4. 2-D trajetória no espaço de recurso de 320 compostos de um FDA aprovou biblioteca e seus respectivos controles. Todos os poços compostos podem ser exibidos em uma trama espaço 2-D característica com base nos parâmetros de um 0 e um 1, que surgem a partir de um não-linear montagem de regressão (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" Equação 1 "/>) para a inflamação inicial. Este lote espaço recurso permite a identificação automática de candidatos interessantes que pertencem a uma das seguintes 4 modulatórios-imune categorias que podem ser indicativos das drogas "modo de ação:. anti-inflamatório (1), anti-resolução (2), pro-inflamatória (3) e pró-resolução (4) Clique aqui para ver maior figura .

Discussion

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl sulphoxide Carl Roth GmbH Co KG A994.2
Copper(II) sulphate anhydrous Carl Roth GmbH Co KG PO23.1
FDA approved drug library Enzo Life Sciences BML-2841-0100
384 microwell plate Non-binding, μClear Greiner 781906 black
Olympus scan^R Olympus
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation Caliper

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