Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

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Summary

Núcleos cardíaca são isolados através de sedimentação densidade e immunolabeled com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar e classificar os núcleos dos cardiomiócitos por citometria de fluxo.

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Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. (65), e4205, doi:10.3791/4205 (2012).

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Abstract

Identificação de núcleos de cardiomiócitos tem sido um desafio em cortes de tecido como a maioria das estratégias de contar apenas com proteínas marcadoras citoplasmáticos 1. Eventos raros em miócitos cardíacos, tais como a proliferação e apoptose necessitam de uma identificação precisa dos núcleos dos miócitos cardíacos para analisar a renovação celular e na homeostasia em condições patológicas 2. Aqui, nós proporcionar um método para isolar a partir de núcleos de cardiomiócitos pós tecido mortem por sedimentação densidade e imunomarcação com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) e triagem de citometria de fluxo posterior. Esta estratégia permite uma análise com rendimento elevado e de isolamento, com a vantagem de se trabalhar igualmente bem em tecido fresco e material de arquivo congelado. Isto torna possível estudar o material já recolhidos na biobancos. Esta técnica é aplicável e testado em uma vasta gama de espécies e adequados para várias aplicações tais como a jusante de carbono-14 namoro 3, a célula-cycle análise 4, visualização de análogos da timidina (por exemplo, BrdU e UDI) 4, a análise de transcriptoma e epigenética.

Protocol

1. Isolamento dos Núcleos Cardiac

  1. Revestimento tubos de ultracentrifugação (Tubos centrífuga Beckman # 363664) com 10 ml de solução de revestimento de 1% BSA / PBS. Tapar os tubos e deixá-los girar durante 30 min num rotor tubo. Remover a solução de revestimento e deixar que o tubos de centrifugação de ar seco (um tubo por coração do rato é necessária para a análise de corações de rato individuais, alternadamente até 5 corações de rato ou 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente (por exemplo, humanos) podem ser processados em um tubo).
  2. Todos os passos seguintes devem ser realizados no gelo. Dissecar o ventrículo esquerdo do coração de rato fresco ou congelado snap-com um bisturi. Nota, este protocolo é optimizado para coração de rato, mas também pode ser adaptado para rato ou do coração humano. Alternativamente, usam-se a 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente.
  3. Apare o espécime em cubículos pequenos, com um bisturi.
  4. Transfira os pedaços de tecido em um tubo Falcon 50 ml cheia com 15 ml de tampão de lise.
  5. Homogeneizar atecido do coração com uma T-25 Ultra-Turrax sonda homogeneizador (IKA) com 24.000 rpm durante 10 seg.
  6. Diluir o homogeneizado com um volume igual de tampão de lise a 30 ml.
  7. Utilizar um vidro douncer (40 ml) para continuar a homogeneizar o tecido e os núcleos livre. Executar oito traçados com um pilão de grande folga.
  8. Passe o núcleo bruto isolar através de um 100 mm e 70 mM de nylon de malha de células do filtro (BD Biosciences), consecutivamente.
  9. Girar para baixo os núcleos isolado bruto numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min.
  10. Remover o sobrenadante cuidadosamente por inversão dos tubos e limpar o interior do tubo com uma toalha de papel. Tenha cuidado para não perturbar o pellet núcleos.
  11. Dissolve-se o isolado bruto núcleos em 5ml de tampão de sacarose por pipetagem a solução várias vezes para cima e para baixo. Adicionar mais 25 ml de tampão de sacarose para o sedimento dissolvido.
  12. Adicionar 10 ml de tampão de sacarose recentemente preparada para o tubo de ultracentrifuga revestido (ver passo 1.1). </ Li>
  13. Cuidadosamente sobrepor a 10 ml adicional de tampão de sacarose, com a ressuspenso núcleos sedimento dissolvido em tampão de sacarose a partir do passo 1.9.
  14. Equilibrar os tubos de centrifugação antes de os colocar num rotor JS13.1 livre oscilante e colocar o rotor em uma centrífuga de alta velocidade (Beckman Avanti-S 25).
  15. Girar a amostra núcleos em 13.000 xg, a 4 ° C durante 60 min.
  16. Quando a rotação foi concluída, remover os tubos cuidadosamente a partir do rotor e descartar o sobrenadante por inversão dos tubos e limpando os detritos remanescente a partir do interior dos tubos com toalha de papel.
  17. Dissolve-se o pellet núcleos em 1 ml de tampão de núcleos de armazenamento (NSB mais tampão). Nota: NSB plus contém 1,5 mM espermina na forma de um estabilizador de DNA.
  18. Prossiga com o passo 2.1, imunocoloração de núcleos de cardiomiócitos.

2. A imunocoloração para Citometria de Fluxo

  1. Prepare o controlo negativo para a imunocoloração. Tomar uma alíquota de 20 uL para fora da amostra núcleos e umadd ul 980 de NSB mais buffer.
  2. Adicionar anti-pericentriolar material de um anticorpo (anticorpo de coelho anti-PCM-1, Antibodies Atlas) para a amostra núcleos em uma diluição de 1:500 a immunolabel núcleos de cardiomiócitos. Adicionar o anticorpo de isotipo para a diluição mesmo que o anticorpo anti-PCM-1 para o controlo negativo, preparado no passo 2.1.
  3. Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante a noite.
  4. Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender o pellet núcleos em 1 ml de tampão mais NSB).
  5. Adicionar anti-coelho de anticorpo fluorescente secundário (FITC ou APC) para controlo negativo e tubo de amostra em uma diluição de 1:1000.
  6. Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante 1 h.
  7. Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante e dissolver os núcleos sedimento em 1 ml de tampão mais NSB).
  8. Continuar com a análise por citometria de fluxo e triagem.

3. Citometria de Fluxo

  1. Revestimento tubos núcleos de recolha (Falcon de 15 ml) com 1% de solução de BSA / PBS antes de começar a citometria de fluxo de triagem, tal como descrito no passo 1,1.
  2. Filtrar a amostra eo controlo negativo através de um filtro 30 uM célula e carregar primeiro o controlo negativo para o citómetro de fluxo (afluxo BD). Definir o portão primeiro e segundo para definir núcleos e singuletos (núcleos único), com base na dispersão para a frente (FSC), largura de pulso para a frente de dispersão (FS largura de pulso) e dispersão lateral (SSC) (Fig. 2a e b). Adicionando um DNA mancha (DRAQ5 (1:500)) para a amostra pode ajudar a identificar a população núcleos inicialmente.
  3. Carregar a amostra immunolabeled e definir a terceira porta para isolar os núcleos dos cardiomiócitos (PCM-1-positve) de não-cardiomiócitos núcleos (PCM-1-negativo). Inicie a triagem(Fig. 2c, d).

Opcional: A fim de analisar o conteúdo de DNA nuclear (ploidia) e para executar a análise do ciclo celular adicionar uma mancha de DNA adequado para os núcleos (por exemplo, Hoechst 33342 ou DRAQ5) (fig. 2e).

  1. Após a triagem de citometria de fluxo, colocar os núcleos em gelo e re-analisar para determinar a pureza de classificação (Fig. 3a e b).
  2. Girar para baixo os núcleos classificados nos tubos de recolha a 1500 xg numa centrifugadora refrigerada durante 15 min.
  3. Dissolve-se o pellet núcleos num tampão compatível com a aplicação a jusante.

4. Os resultados representativos

Morfologia núcleos e integridade pode ser avaliada por manchas de DNA e visualizada por microscopia (Fig. 1). Bem sucedida PCM-1 rotulagem pode ser avaliado por microscopia de epifluorescência e por citometria de fluxo (Fig. 1 e Fig.. 2c e d). PCM-1-positive e populações negativas devem ser bem separadas umas das outras (Fig. 2c, d). Em ventrículo esquerdo murino cerca de 30% de todos os núcleos deve ser os núcleos dos cardiomiócitos (Fig. 2d). Triagem pureza pode ser avaliada por re-analisando os núcleos ordenadas (Fig. 3a e b). Ambas as populações núcleos deve ter uma pureza superior a 95% de triagem.

A Figura 1
Figura 1. PCM-1 identifica os núcleos dos cardiomiócitos. Núcleos Cardíaca (a) são coradas com anticorpos para PCM-1 (b), e para Nkx2.5 (c) em um coração de rato adulto. (D) PCM-1-rotulado núcleos são cercados por citoplasma dos cardiomiócitos (miosina de cadeia pesada (MHC)) e expressar o fator de transcrição Nkx2.5, documentando a identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos pelo PCM-1 coloração (barras de escala 20 microns e 10 iM (d, inserção)). (E) isolados núcleos cardíacas visualizado com o DNA mancha DRAQ5. (Feg) Cardiomyocnúcleos YTE são rotulados com anticorpos contra PCM-1 (barra de escala 10 mm). Note, o padrão de coloração epinuclear de PCM-1 em núcleos dos miócitos em secção de tecido e em núcleos isolados (setas).

A Figura 2
Figura 2. Classificação por citometria de fluxo de núcleos de cardiomiócitos. (A) núcleos cardíaca são identificados por dispersão frontal (FSC) e dispersor lateral (SSC). (B) Um segundo portão identifica núcleos único pelo FSC e largura de pulso FS 5. (C, d) gating fluorescente permite a separação de núcleos de cardiomiócitos (PCM-1-positivo) e não-cardiomiócitos (PCM-1-negativa) núcleos a partir de tecido do coração. (E) cardiomiócito do rato são na maior parte (> 80%) diplóide (2n), apenas um pequeno subconjunto é tetraplóide (4n) 6. Note, cardiomiócitos humanos contêm uma maior frequência de núcleos poliploidia (> 2n) 7,8.

A Figura 3

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Discussion

A identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos é crucial para a análise dos processos regenerativos no miocárdio 2,3. As técnicas convencionais para isolar cardiomiócitos de tecido fresco baseiam-se principalmente a digestão enzimática de proteínas da matriz extracelular e da subsequente purificação a partir de células intersticiais por centrifugação a baixa velocidade. A purificação adicional de cardiomiócitos de vida a partir de células estaminais embrionárias (ESC) pode ser realizada por imunomarcação com marcadores de superfície tais como Sirpa 9 ou corantes mitocondriais 10, cardiomiócitos fixas podem ser identificados por meio de marcadores, tais como citoplasmáticos miosina de cadeia pesada (MHC) ou proteínas nucleares, tais como GATA4 ou Nkx2.5. No entanto, a expressão de Nkx2.5 e GATA4 não se restringe a cardiomiócitos maduras, mas pode ser também detectada em células progenitoras durante o desenvolvimento e após enfarte cardíaco 11,12. Estratégias genéticas para identificar cardiomiócitos mostrar a maior especificidade, mas cannot ser aplicada em modelos animais ou seres humanos grandes 1. As limitações das estratégias existentes, levaram a conclusões controversas que dependem da quantificação de eventos raros, como apoptose, proliferação e quimerismo 1,13. Assim, existe uma necessidade de estabelecer uma estratégia precisas para identificar e purificar os núcleos dos cardiomiócitos madura diferenciada.

Aqui, nós descrevemos uma técnica de purificação com base em material pericentriolar 1 (PCM-1). Anteriormente, reforçou a validade do nosso isolamento núcleos, mostrando que três marcadores independentes nucleares, PCM-1, troponina T e I, identificar a mesma população de cardiomiócitos. 2,3 A população purificada apresentou um enriquecimento elevado de cardiomiócitos produtos de genes específicos, tais como troponinas cardíacas, proteína miosina de cadeia pesada e do fator de transcrição Nkx2.5 e GATA4 2,3.

O protocolo atual, baseado em PCM-1, foi aplicada com sucesso fou a análise de humano e ratinho volume de cardiomiócitos 2,4, bem como para a análise do perfil de cardiomiócitos transcricional 2. Prevemos que a estratégia apresentada pode também ser adaptado para o isolamento de cardiomiócitos de outras espécies. PCM-1, uma proteína centrossoma, re-localiza-se à membrana nuclear, onde se acumula e forma uma matriz insolúvel apenas em miócitos diferenciadas 2,14 (fig. 1). A citometria de fluxo permite a análise rápida imparcial de um número elevado de células, o que é necessário para quantificar eventos raros em cardiomiócitos, tais como a apoptose e ciclo celular re-entrada 15. Além disso, análogos de nucleótidos (por exemplo, BrdU) ensaios de proliferação base pode ser prontamente aplicado utilizando o nosso técnica apresentada 4. A nossa técnica tem a vantagem de que o conteúdo de DNA de núcleos de cardiomiócitos única (ploidia nuclear) pode ser analisada em cardiomiócitos multinucleadas 16,17, o que proporciona informação importantea discriminar entre a duplicação dos cardiomiócitos e polyploidisation 6-8. No entanto, devido à natureza da nossa estratégia, uma caracterização de multinucleação cardiomiócitos não é possível.

Outras aplicações do método apresentado são estudos focados em mudanças epigenéticas da cromatina, nucleoproteínas, interações protein-DNA/RNA e sobre o transcriptoma nuclear 18,19.

Devido à estabilidade de núcleos em congelar-descongelado tecido, a estratégia de isolamento apresentavam núcleos podem também ser aplicados aos tecidos congelados, tornando-se possível utilizar material arquivado a partir de biobancos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Nós gostamos de reconhecer Marcelo Toro para a assistência com a citometria de fluxo. Este estudo foi financiado pelo sueco Coração e Pulmão Foundation, da Comissão Européia, FP7 "CardioCell", Sueco de Pesquisa do Conselho, seguros AFA e ALF. OB foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Lysis Buffer
Name of the reagent
0.32 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM CaCl2
5 mM magnesium acetate
2.0 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1 mM DTT
2. Sucrose buffer
Name of the reagent
2.1 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM magnesium acetate
1 mM DTT
3. Nuclei storage buffer (NSB plus)
Name of the reagent
0.44 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)
70 mM KCl
10 mM MgCl2
1.5 mM spermine
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody Life Technologies
DRAQ5 Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle "L" VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664 Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor Beckman Coulter
Influx cytometer Beckman Coulter
Tube Rotator VWR

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References

  1. Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. 298-1603 (2010).
  2. Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
  3. Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
  4. Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. 1-31 (2010).
  5. Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
  6. Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
  7. Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
  8. Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
  9. Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
  10. Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
  11. Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
  12. Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  13. Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
  14. Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
  15. Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
  16. Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
  17. Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
  18. Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
  19. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).

Comments

1 Comment

  1. Hi, I have a question regarding the component of lysis buffer. Why put CaCl2 and magnesium with EDTA and EGTA together? Would EDTA and EGTA remove both Ca and Mg?

    Reply
    Posted by: Haodong C.
    January 26, 2016 - 12:40 PM

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