原位膀胱肿瘤模型和评价治疗膀胱萨纳

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Summary

建立原位膀胱肿瘤模型来评估膀胱内交付萨纳和超声监测肿瘤的生长和发光成像的抗肿瘤作用。

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Kang, M. R., Yang, G., Charisse, K., Epstein-Barash, H., Manoharan, M., Li, L. C. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), e4207, doi:10.3791/4207 (2012).

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Abstract

我们提出了一个新颖的方法治疗膀胱癌与膀胱内交付的小活化RNA(萨尔纳)的原位移植瘤小鼠膀胱肿瘤模型。小鼠模型的建立吸入全身麻醉下导尿。化学烧伤,然后介绍了使用膀胱内的硝酸银溶液膀胱粘膜破坏膀胱聚糖层,使细胞附着。用无菌水,人膀胱癌KU-7-luc2-GFP细胞经过几个清洗灌输通过导管进入膀胱停留2个小时。被确认和监测膀胱肿瘤的后续增长在体内的膀胱超声和生物发光成像。萨纳脂质纳米粒(岭澳核电站)制定的肿瘤治疗膀胱内。肿瘤的生长监测与超声和发光。此过程的所有步骤都体现在影随行。

Protocol

已批准制度的动物护理和使用委员会(IACUC),旧金山加州大学动物学科,涉及的程序。

1。细胞的制备

  1. 是生长在人类膀胱癌细胞株KU-7-luc2-GFP(卡尺生命科学,霍普金顿,马)的RPMI-1640含10%胎牛血清和50微克/毫升的庆大霉素补充媒体。
  2. 文化是保持在37℃,5%,与媒体的CO 2的变化,每两至三天。
  3. 胰蛋白酶消化收获细胞,并计算使用血球。一个单细胞悬液2×10 6细胞在50μL准备在磷酸盐缓冲液放在冰上。

2。原位膀胱肿瘤模型

  1. 女性裸体(女/女)小鼠8-10周龄(西蒙森实验室,Gilory,CA)的使用。
  2. 加热垫置于一个无菌的悬垂性服务SA手术平台。无菌润滑与管芯针,硝酸银溶液,无菌水果冻,24有瓜葛导管准备。
  3. 全身麻醉诱导小鼠吸入异氟醚诱导(3%,为维护1-2%),并通过鼻锥保持。无菌眼药膏适用于动物的眼睛,热垫使用,以保持身体的热量。
  4. 将鼠标在仰卧位。
  5. 轻轻与稳定钳抓住动物的外阴。
  6. 使用24有瓜葛静脉导管取出用针管芯,鼠标尿道插管。应使用足够的润滑。用鼠标仰卧,尿道口位于后外阴皱褶和阴道前。最初是一个45度的角度采取以cannulate尿道和耻骨下方通过。一个更浅的角度,然后通过尿道传入膀胱。温柔的骨盆压力确保整顿尿道往往可以帮助。必须小心,以避免推太硬反对阻力,因为这可能会导致尿道或膀胱穿孔。看到尿导管内确认其在膀胱腔的位置。
  7. 从导管和膀胱流明使用管芯针吸尿。管芯用于所有后续的愿望和注射针,离开导管地方。这使得消除死空间内的导管注射用准确的卷,它使重复导管不必要的。
  8. 膀胱尿路上皮损害聚糖层,注入10μL0.5 M的硝酸银和允许停留10秒。这可能会形成白色沉淀物与剩余尿。
  9. 吸并放弃使用管芯针的沉淀和膀胱内容。
  10. 注入100μL无菌水冲洗膀胱。吸出并丢弃的水。 REPE用无菌水冲洗3次,共4清洗。
  11. 尿道口周围放置一个4-0真丝领带,准备拔除尿管尿道闭塞。
  12. 注入事先准备好的2×10 6 KU-7-luc2-GFP的细胞,在50μL,使用管芯针。
  13. 同时取出导管和管芯针,离开尿道闭塞的真丝领带。
  14. 鼠标将保持2小时之前,真丝领带和动物被唤醒,在全身麻醉下。

3。超声

  1. 全身麻醉诱导与异氟醚蒸发和保持通过鼻锥。
  2. VEVO一个VisualSonics 体内770高分辨率显微成像系统(VisualSonics公司,多伦多,安大略省,加拿大)RMV-704 40 MHz探头使用。
  3. 鼠标放置在超声平台上的仰卧姿势。
  4. 确保动物的后腿用胶带,以避免在操纵的超声探头多余的动作。
  5. 应用超声凝胶鼠标骨盆。
  6. 鼠标骨盆降低到1 RMV-704(40 MHz)的超声探头获得横向或纵向的图像。
  7. 如果发现肿瘤,肿瘤尺寸测量图像可以保存为。

4。生物发光成像

  1. 进行腹腔注射200μL(150毫克/公斤)荧光素底物。
  2. 汽化异氟醚全身麻醉诱导和维持通过鼻锥。
  3. 在仰卧位放置在发光成像的小鼠。
  4. 五分钟后,荧光素注射,测量光子每秒动物发光。

5。萨纳的制备

  1. 合成的RNA寡核苷酸的规模在50-100μmol。
  2. 退火互补的单链寡核苷酸我NTO双工saRNAs。
  3. 脂质纳米粒(LNP)萨纳准备电离脂质1,2-dilinoleyl-4-(2 - 二甲氨基) - [1,3]二氧(DLinKC2,DMA),disteroylphosphatidyl胆碱,胆固醇和PEG-德马吉使用自发囊泡的形成制定过程如前所述。

6。的膀胱政府的配方萨纳

  1. 原位膀胱肿瘤模型的建立后,小鼠的治疗膀胱小活化脂质纳米粒(岭澳核电站)( 见表1)RNA(萨纳)制定。
  2. 全身麻醉,建立和保持与异氟醚蒸发,应用无菌眼科润滑剂。
  3. 将动物仰卧位。
  4. 执行导尿如前所述。
  5. 尿道周围和导管放置一个4-0真丝领带。
  6. 从导管吸出所有的尿液和膀胱使用一个空的注射器和管芯针。
  7. 注入膀胱内的LNP-萨纳总剂量为50μL(3毫克/公斤)。同时取出导管和管芯针,离开尿道闭塞的真丝领带。
  8. 鼠标将保持2小时闭塞尿道麻醉。
  9. 治疗膀胱的LNP-萨纳开始肿瘤植入后第4天。小鼠连续治疗,每3天,共有14个治疗。

7。代表结果

可以监测膀胱肿瘤KU-7-luc2-GFP细胞产生荧光素酶生物发光成像( 图1A和C)和膀胱超声( 图1B和D)。肿瘤往往在3-5天内检测细胞接种后。我们发现,在超过90%的小鼠膀胱肿瘤成功植入。由于治疗膀胱双链RNA随之而来,肿瘤进展可以监视无线网络TH这些方式。动物牺牲后,肿瘤的生长,也可以得到证实使用GFP荧光。在一般情况下,平均发光与膀胱肿瘤的平均超声尺寸,直观地看到在图1C和1D。然而,后处死动物,证实GFP的肿瘤,我们发现存在可行的肿瘤比超声测量,生物发光与更加紧密。这是因为治疗小鼠残留瘢痕组织往往是通过超声波可视化,但不能从现场的肿瘤分化明显,尤其是在萨纳(相对于对照组)治疗小鼠。

图1
图1。膀胱肿瘤的肿瘤生长动力学。 (一)在膀胱肿瘤生物发光成像测量荧光素酶活性,以确认他们的位置和生长。 (二) 在体内膀胱ultrasounð使用一个40MHz的探头产生肿瘤的图像,可以准确测量其尺寸。 (三)图说明肿瘤的发光和超声尺寸逐步增加。值代表的意思(+ / -标准差)6动物的测量。 点击这里查看大图

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Discussion

随后制定的LNP萨纳转录激活目标为P21 CIP1/WAF1(P21)启动肿瘤灌注治疗鼠标原位移植膀胱肿瘤模型的建立,我们提出了一个协议。2,由此产生的肿瘤可以确认和监测生物发光成像和膀胱超声。原位模型可能优于通过腹腔,皮下或静脉注射模型提供了一个环境,更接近内源性膀胱癌的尿液和尿路上皮。各种原位小鼠膀胱肿瘤已建立了直接的膀胱壁注射以及灌注4-8肿瘤灌注,这里展示,更加紧密地模仿人类的膀胱肿瘤开始在黏膜上皮细胞表面,更深增长他们的进展。我们的方法使用硝酸银,以适应BLAD肿瘤摄取ders是价格低廉,技术简单。

hadaschik 等。描述小鼠膀胱肿瘤灌注和报告可靠的发光的肿瘤评估。我们同样发现肿瘤植入导管和细胞灌注成功率高。我们的肿瘤不仅被证实,而且也与体内的膀胱超声发光,量化肿瘤的发展提供了一个额外的方法。

在这个协议中,我们注意到一些别人的技术修改。我们采用硝酸银溶液滴入,破坏膀胱肿瘤细胞植入外粘多糖层,而不是电灼。我们发现这是一种廉价,简单,可靠的方法,尽量减少潜在的用户错误。在膀胱超声评价中,我们发现它不必要的执行导尿事前。只要动物没有受到显著的苦恼引起排尿前接受麻醉的小鼠膀胱可靠扩张过程中成像,让优秀的肿瘤可视化。毫无疑问,导尿是最不可靠的协议一步。根据我们的经验,无胸腺裸鼠的导管是比C57小鼠更困难。然而,在此协议中描述的技术和视频,超过90%的动物被反复插管成功用于肿瘤灌注和治疗。

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Disclosures

拼箱上等候萨尔纳相关专利申请已提交由加州大学旧金山分校,并授权给Alnylam制药是名为发明者。

Acknowledgements

这项研究是由亨利·谢泼德的AACR膀胱癌的研究资助(09-60-30-李)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KU-7-luc-GFP cells Caliper Life Sciences 128091
thymic nude mice ( nu/nu) Simonsen Laboratories 6-7 weeks old Sim:(NCr) nu/nu fisol
Ultrasound unit VisualSonics, inc. Vevo 770 RMV-704 probe
Bioluminescence unit Caliper Life Sciences IVIS Spectrum
Exel safelet catheter Fisher Scientific 14-841-21 24G X ¾"
Silver nitrate Sigma-Aldrich S8157
Hamilton syringe Hamilton Co 80301
LNP-saRNA Alnylam Pharmaceuticals
Table 1. Specific reagents and equipment.

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References

  1. Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
  2. Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
  3. Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
  4. Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
  5. Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
  6. Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
  7. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
  8. Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).

Comments

1 Comment

  1. KU7 has been shown to be HeLa - this is not a bladder cancer cell line. The model may still be relevant to testing intravesical delivery of novel drugs, but the authors and the readers should recognize that the cancer is derived from poorly differentiated cervical carcinoma and not urothelial carcinoma of the bladder.
    Reference: PMID 23500642

    Reply
    Posted by: Peter B.
    October 2, 2017 - 12:00 AM

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