Um modelo de tumor de bexiga ortotópico e Avaliação de Tratamento de sarna intravesical

* These authors contributed equally
Published 7/28/2012
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Medicine

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Summary

Estabelecer um modelo de tumor de bexiga ortotópico para avaliar os efeitos antitumorais de sarna intravesical entregue e acompanhamento do crescimento tumoral por ultra-som e de imagem de bioluminescência.

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Kang, M. R., Yang, G., Charisse, K., Epstein-Barash, H., Manoharan, M., Li, L. C. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), e4207, doi:10.3791/4207 (2012).

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Abstract

Apresentamos um novo método para o tratamento de cancro da bexiga com intravesical entregue pequena activador RNA (sarna) em um xenoenxerto modelo de rato ortotópico tumor da bexiga. O modelo do rato é estabelecido por cateterismo uretral sob anestesia geral inalatória. Queimadura química é então introduzido para a mucosa da bexiga usando solução de nitrato de prata intravesical para romper a camada de glicosaminoglicano bexiga e permite que as células para anexar. Após várias lavagens com água estéril, cancro da bexiga humana KU-7-luc2-GFP células são instilado através do cateter no interior da bexiga para habitar durante 2 horas. Subsequente crescimento de tumores de bexiga é confirmada e monitorado por ultra-som na bexiga vivo e de imagem de bioluminescência. Os tumores são então tratados com intravesical sarna formulados em nanopartículas de lípidos (LNPs). O crescimento do tumor é monitorizado com ultra-sons e bioluminescência. Todos os passos do presente processo são demonstradas no vídeo que o acompanha.

Protocol

Procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC) da Universidade da Califórnia, em San Francisco.

1. Preparação de células

  1. A bexiga humana linha de células de cancro KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) é crescido em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 50 gentamicina ug / ml.
  2. As culturas são mantidas a 37 ° C, 5% de CO 2 com os meios de muda a cada dois a três dias.
  3. As células foram colhidas por digestão com tripsina e contadas utilizando um hemocitómetro. Uma única suspensão celular de 2 x 10 6 células em 50 ul foi preparada em solução salina tamponada com fosfato e mantido em gelo.

2. Modelo de tumor ortotópico de bexiga

  1. Fêmeas nu (nu / nu) ratinhos 8-10 semanas de idade (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) foram usadas.
  2. Coloque um pano estéril sobre uma almofada de aquecimento para servir a umsa plataforma cirúrgica. Estéril lubrificante geleia, 24-Guage cateteres com agulhas estilete, solução de nitrato de prata, e água estéril, que são preparados.
  3. Anestésico geral é induzida nos ratinhos com isoflurano inalado (3% para a indução, 1-2% para manutenção) e mantida através nosecone. Pomada oftálmica estéril é aplicada para os olhos do animal, e uma almofada de calor é utilizado para manter o calor do corpo.
  4. Posicione o mouse na posição supina.
  5. Suavemente agarrar vulva do animal com uma pinça, para estabilização.
  6. Utilizando um cateter 24-guage intravenosa com o estilete agulha removido, a uretra do rato é cateterizada. Lubrificação amplo deve ser usado. Com o supino do mouse, a uretra está localizado imediatamente posterior às pregas vulvares e anterior à vagina. Um ângulo de 45 graus é inicialmente tomadas a fim de canular a uretra e passar por baixo do osso púbico. Um ângulo de mais superficial é então levado a passar através da uretra para a bexiga. Suaves pres pélvicosCertifique-se de endireitar a uretra muitas vezes podem ajudar. Cuidados devem ser tomados para evitar empurrar demasiado duro contra a resistência, pois isso pode levar à perfuração da uretra ou bexiga. Urina visto dentro do cateter confirma a sua localização no interior do lúmen da bexiga.
  7. Aspirar a urina a partir do lúmen do cateter e da bexiga usando a agulha estilete. A agulha estilete é usado para todas as aspirações subsequentes e injecções, deixando o cateter no lugar. Isto permite a injecção de volumes precisos, eliminando o espaço morto dentro do cateter, e faz cateterismos repetidas desnecessária.
  8. Para prejudicar a camada de glicosaminoglicano do urotélio da bexiga, 10 ul de 0,5 M de nitrato de prata é injectado e deixou-se habitar durante 10 segundos. Isto pode formar um precipitado branco com urina restante.
  9. Aspirar e descartar o conteúdo precipitar e bexiga usando uma agulha de estilete.
  10. Lave a bexiga através da injeção de água 100 uL estéril. Aspirar e descarte a água. Repeem lavagem com água estéril 3 vezes para um total de 4 lavagens.
  11. Coloque uma gravata de seda 4-0 ao redor do meato uretral para ocluir a uretra na preparação para a remoção do cateter.
  12. Injectar previamente preparado 2 x 10 6 KU-7-GFP-luc2 células em 50 uL utilizando a agulha de estilete.
  13. Simultaneamente remover o cateter ea agulha estilete, deixando a uretra ocluída pelo laço de seda.
  14. O rato será mantida sob anestesia geral, durante 2 horas antes do laço de seda é removido eo animal é acordado.

3. Ultra-som

  1. Anestesia geral foi induzida com isoflurano vaporizado e mantida através de cone do nariz.
  2. A VisualSonics Vevo 770 In Vivo de Alta Resolução Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontário, Canadá) com a RMV-704 sonda de 40 MHz foi utilizado.
  3. Posicione o mouse na posição supina na plataforma ultra-som.
  4. Proteger as patas traseiras do animalcom fita para evitar o movimento excesso durante a manipulação da sonda de ultra-som.
  5. Aplique o gel de ultra-som à pelve mouse.
  6. Baixa um RMV-704 sonda de ultra-som (40 MHz) para a bacia do mouse para obter imagens transversais ou longitudinais.
  7. Se o tumor for encontrado, as imagens podem ser salvas para a medição das dimensões do tumor.

4. Bioluminescent imagem

  1. Executar a injecção intraperitoneal de 200 uL (150 mg / kg) substrato luciferina.
  2. Induzir anestesia geral com isoflurano vaporizado e manter através de cone do nariz.
  3. Coloque ratos em decúbito dorsal no imager bioluminescência.
  4. Cinco minutos após a injecção luciferina, medir a bioluminescência a partir do animal em fotões por segundo.

5. Preparação sarna

  1. Sintetizar RNA oligonucleotídeos em uma escala de 50-100 mmol.
  2. Recozer complementares de um único oligonucleótidos de cadeia isaRNAs nto duplex.
  3. Lipid nanopartícula-(LNP)-sarna são preparados com o lípido ionizável 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimetilaminoetil) - [1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl colina, colesterol, e PEG-DMG usando uma espontânea de vesículas procedimento de formulação de formação, como descrito anteriormente. 1

6. Administração intravesical de sarna Formulado

  1. Depois de estabelecer o modelo de tumor ortotópico bexiga, os ratos são tratados com intravesical pequena activador RNA (sarna) formulada em nanopartículas de lípidos (LNPs) (Tabela 1).
  2. Anestésico geral é estabelecido e mantido com vaporizado isoflurano, e lubrificante oftálmica estéril é aplicado.
  3. Coloque o animal em decúbito dorsal.
  4. Realizar cateterismo uretral como descrito anteriormente.
  5. Coloque uma gravata de seda 4-0 ao redor da uretra e do cateter.
  6. Aspirar toda a urina a partir do cateter ebexiga usando uma seringa e agulha vazio estilete.
  7. Injectar LNP-sarna intravesical para uma dose total de 50 uL (3 mg / kg). Simultaneamente remover o cateter ea agulha estilete, deixando a uretra ocluída pelo laço de seda.
  8. O rato permanecerá anestesiados com a uretra ocluída durante 2 horas.
  9. O tratamento com intravesical LNP-sarna foi iniciado no dia 4 após a implantação do tumor. Os ratinhos foram tratados em série, cada 3 dias, para um total de 14 tratamentos.

7. Os resultados representativos

Tumores da bexiga decorrentes KU-7-luc2-GFP células pode ser monitorizada por luciferase bioluminescente de imagem (Figura 1A e C) e de ultra-som da bexiga (Figura 1B e D). Os tumores são frequentemente detectável dentro de 3-5 dias após a inoculação das células. Encontramos a implantação do tumor de bexiga com sucesso em mais de 90% dos ratos. Como o tratamento com ARNdc intravesical se segue, a progressão do tumor pode ser monitorizada wiº destas modalidades. Depois de o animal é sacrificado, o crescimento do tumor pode também ser confirmada utilizando GFP de fluorescência. Em geral, a média de bioluminescência correlacionada com dimensões de ultra-som médios para os tumores da bexiga, como visto visualmente nas Figuras 1C e 1D. No entanto, depois de os animais foram sacrificados e tumor foi confirmada por GFP, verificou-se que a bioluminescência correlacionada mais estreitamente com a presença de tumor viáveis ​​do que as medições de ultra-som. Isto foi especialmente aparente entre ratinhos tratados com sarna (em oposição aos controlos), porque o tecido da cicatriz residual em ratinhos tratados era muitas vezes visualizadas por ultra-sons, mas não podia ser diferenciado do tumor ao vivo.

A Figura 1
Figura 1. Cinética de crescimento de tumor de tumores da bexiga. (A) de imagem bioluminescência mede a actividade da luciferase em tumores da bexiga para confirmar a sua localização e crescimento. (B) In vivo ultrasoun bexigad usando uma sonda de 40MHz produz imagens tumorais, cujas dimensões podem ser medidos com precisão. (C) Os gráficos ilustrando aumento progressivo do tumor em dimensões de bioluminescência e ultra-som. Os valores representam a média (+ / - desvio padrão) medições a partir de 6 animais. Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

Apresenta um protocolo para o estabelecimento de um modelo ortotópico xenoenxerto rato tumor da bexiga, seguido de tratamento intravesical dos tumores com LNP sarna formulado que tem como alvo o promotor de p21 CIP1/WAF1 (p21) para a activação transcricional. 2, 3 Os tumores resultantes podem ser confirmada e monitorados com exames de imagem de bioluminescência e ultra-som da bexiga. Modelos ortotópicos pode ser superior à intraperitoneal, subcutânea ou intravenosa os modelos, fornecendo um meio de urina e urotélio que mais se aproxima o cancro da bexiga endógena. Uma variedade de tumores da bexiga ortotópicos rato foram estabelecidas utilizando tanto a injecção directa de parede da bexiga, bem como a instilação intravesical. 4-8 instilação intravesical de tumor, como demonstrado aqui, mais imita tumores de bexiga humana que começam superficialmente no epitélio da mucosa e crescer mais profunda à medida que progridem. O nosso método de utilização de nitrato de prata para acomodar bladders para captação de tumor é barato e tecnicamente simples.

Hadaschik et al. Descrito instilação intravesical de tumores de bexiga em ratos e relatados avaliação confiável tumor bioluminescente. 5 Nós igualmente encontraram taxas elevadas de implantação do tumor sucesso com cateterização e instilação de células. Os nossos tumores não só foram confirmadas com bioluminescência, mas também com ultra-sons em bexiga in vivo, proporcionando um método adicional para quantificar a progressão do tumor.

Neste protocolo, notamos várias modificações à técnica dos outros. Foram utilizados instilação de solução de nitrato de prata para interromper a bexiga camada de glicosaminoglicano extracelular para o implante de células de tumor, em vez de electrocauterização. Descobrimos que este é um método barato, simples e confiável, que minimizou o potencial de erro do usuário. Durante a avaliação do ultra-som da bexiga, achamos desnecessário a realização de cateterismo uretralantemão. Enquanto o animal não tinha sido submetido a aflição significativa para causar a micção antes de ser submetido a anestesia, a bexiga ratinho foi distendido fiável durante o exame para permitir a visualização do tumor excelente. Sem dúvida, o cateterismo uretral foi a etapa menos confiável do protocolo. Em nossa experiência, cateterismo de atímicos camundongos nude é mais difícil do que em camundongos C57. No entanto, com a técnica descrita neste protocolo e vídeo, mais de 90% dos animais foram repetidamente cateterizada com sucesso para ambos instilação tumor e tratamento.

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Disclosures

LCL é um inventor chamado em pedidos de patentes pendentes relacionadas com a sarna que foram arquivados pela Universidade da Califórnia em San Francisco e licenciada para Alnylam Pharmaceuticals.

Acknowledgements

Esta pesquisa é financiada pelo Henry AACR Bexiga Shepard Cancer Research Grant (09-60-30-LI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KU-7-luc-GFP cells Caliper Life Sciences 128091
thymic nude mice ( nu/nu) Simonsen Laboratories 6-7 weeks old Sim:(NCr) nu/nu fisol
Ultrasound unit VisualSonics, inc. Vevo 770 RMV-704 probe
Bioluminescence unit Caliper Life Sciences IVIS Spectrum
Exel safelet catheter Fisher Scientific 14-841-21 24G X ¾"
Silver nitrate Sigma-Aldrich S8157
Hamilton syringe Hamilton Co 80301
LNP-saRNA Alnylam Pharmaceuticals
Table 1. Specific reagents and equipment.

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References

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Comments

1 Comment

  1. KU7 has been shown to be HeLa - this is not a bladder cancer cell line. The model may still be relevant to testing intravesical delivery of novel drugs, but the authors and the readers should recognize that the cancer is derived from poorly differentiated cervical carcinoma and not urothelial carcinoma of the bladder.
    Reference: PMID 23500642

    Reply
    Posted by: Peter B.
    October 2, 2017 - 12:00 AM

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