השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fibroblasts מחולים שנשאו מוטציות בגני פרקינסון גורמי מחלות לייצג נגיש

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Burbulla, L. F., Krüger, R. The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (68), e4228, doi:10.3791/4228 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

המחלה (PD) פרקינסון היא הפרעת תנועה השכיחה ביותר השנייה ומשפיעה על 1% מאנשים מעל גיל 60 1. בגלל הזדקנות היא גרם הסיכון החשוב ביותר, במקרים של פרקינסון יגדילו בעשרות השנים הבאות 2. בא לקיפול החלבונים פתולוגי ומסלולי פירוק חלבונים פגומים, שינויי התפקוד והמורפולוגיה המיטוכונדריה היו מצביעים כסימן היכר נוסף של ניוון מוחיה בפ"ד 3-11.

לאחר שנים של מחקר בתאי סרטן עכבריים ואנושיים כמו גם במודלים חוץ גופייה לנתח מסלולים מולקולריים של מחלת הפרקינסון, השימוש בfibroblasts אדם מחולים ובקרות מתאימות כמודלי vivo לשעבר הפך לכלי מחקר יקר, אם אזהרות פוטנציאליות יובאו בחשבון. מלבד הנציחו דגמים, תאים מלאכותיים למדי, fibroblasts העיקרי מחולים שנשאו מוטציות מחלה הקשורים ככל הנראה משקף תכונות פתולוגיים חשובות of המחלות האנושיות.

כאן אנו משרטטים את ההליך של לקיחת ביופסיות עור, פיברובלסטים culturing אדם ושימוש בפרוטוקולים מפורטים לטכניקות מיקרוסקופיות חיוניות להגדרת פנוטיפים המיטוכונדריה. אלה שמשו כדי לחקור תכונות שונות הקשורות לפ"ד שרלוונטיים לתפקוד ודינמיקה של המיטוכונדריה. Vivo לשעבר, המיטוכונדריה יכולה להיות מנותחת במונחים של תפקידם, המורפולוגיה, colocalization עם lysosomes (האברונים משפילים המיטוכונדריה מתפקדת) והשפלה דרך מסלול lysosomal . פנוטיפים אלה הם רלוונטיים ביותר לזיהוי הסימנים המוקדמים של מחלת הפרקינסון ועלולים להקדים את הסימפטומים מוטוריים קליניים בנישאי מחלה גנטית אנושיים. לפיכך, מבחנים שהוצגו כאן יכולים להיות מנוצלים ככלים חשובים לזהות מאפיינים פתולוגיים של ניוון מוחיה, ולעזור להגדיר אסטרטגיות טיפוליות חדשות בפרקינסון.

Protocol

1. עור ביופסיה וCulturing של Fibroblasts אדם

  1. עור הביופסיה צריכה להילקח על ידי רופא מנוסה. ההליך מתבצע בתנאים סטריליים ודורש הרדמה מקומית. אתרים טיפוסיים המשמשים לביופסיה הם בצד הפנימי של הזרוע העליונה, כתפיים או גב תחתון.
  2. אתה יכול לקחת דגימת הקוטר 4x4mm או 6x6mm ידי ביופסיה כדי לקבל מספיק רקמה לfibroblasts culturing אדם.
  3. חותך את עור ביופסיה לחתיכות קטנות שווות בתנאים סטריליים כדי להפריד אותם לתוך 2-4 T25 צלוחיות. כל בקבוק צריך להכיל 2-3 חתיכות של האפידרמיס. תרבות התקשורת מכילה 15% FCS, 1.1% פירובט נתרן ו% 1 / סטרפטומיצין פניצילין ברוזוול פרק הזכרון מכון (RPMI) 1640 בינוניים.
  4. דגירת התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2. זמן ההתפשטות הצפויה עד fibroblasts 1 לצמוח מתוך מדגם אפידרמיס הוא 1-2 שבועות. אם בעיות גדילה הם נתקלו, אתה יכול לעשות שימוש בfa צמיחת פיברובלסטיםctor (5-10 ng / ml FGF2) כדי לשפר את הצמיחה של תאים.
  5. ברגע confluency תא של 50-70% מגיע, fibroblasts האנושי הראשוני ניתן להקפיא. הזמן עד confluency 50-70% הוא הגיע, שונה בין שורות תאים. הקפא את fibroblasts ב90% sulfoxide FCS בתוספת 10% דימתיל (DMSO).

2. הכנת Fibroblasts אדם למיקרוסקופיה הדמית התא החייה

באופן כללי, ניסויים עם fibroblasts אדם צריכים לקיימה במעברים מתחת ל 10 כשינויים הקשורים הזדקנות-יוכלו לשנות מאפיינים של תאים אחרי מעברים מרובים. במקרה של ספק, מבחנים בטא גלקטוזידאז ניתן להשתמש כדי להעריך את האינדוקציה של תהליכי הזדקנות בתאי בהתאמה. באופן כללי, אין להשתמש בfibroblasts הגיל (ראה לעיל). יתר על כן, כדי להשוות מספר שורות תאים, לעבוד עם אותו מספר המעבר של כל שורת תאים. השוואה של חולים גנטיים הומוגניות שונים בהשוואה לנבדקים בריאים מומלצת. עם זאת, כמו שלפעמיםחולים שנשאו מוטציות מסוימות יכולים להיות נדיר, זה יכולים להיות שביופסיות עור מרק מטופל אחד עם מספר קטע מסוים וקווי בקרה שונים צריכות להיות כלולות - הנה זה הוא חיוני כדי להבטיח את אותו מספר המעבר של כל הקווים כלולים. אם confluency תא של 50-70% הוא הגיע אבל לא ניסוי מתוכנן, fibroblasts צריך להיות קפוא.

  1. ביום הראשון של הניסוי, לשטוף את fibroblasts המצורף פעם עם PBS. לאחר מכן שחרר אותם מתחתית הבקבוק באמצעות פתרון ניתוק תא של אנזימים פרוטאוליטים (כלומר DNase AccuMax).
  2. ספירת התאים ובין זרעך 50,000-70,000 תאים בכל באר של coverglass 4-קאמרי (1.8 2 סנטימטר לאזור התרבות היטב). בהתאם לכך, לcoverglas 8-הקאמרי, מחצית ממספר התאים או קצת פחות מתאימה (0.8 2 סנטימטר לאזור התרבות היטב). חשוב זרע ולא מספר קטן של תאים לבצע ניתוח אמיתי מתחיל מתא בודד. אין ציפוי ספציפי לתאייזה צורך.
  3. לאחר 24-48 שעות, ניסוי הדמית התא החי יכול להתבצע. ודא שמיקרוסקופ הדמית התא החי מצויד בחממה השולטת 2 רמות הטמפרטורה וCO. במהלך רכישת תמונה, אווירה של 37 CO 2 יש לשמור ° C ו 5%.
  4. כל מדידת הדמית תא חייה צריכה להתבצע בלפחות שלושה ניסויים עצמאיים. בסך הכל, מינימום של 50 תאים לכל קו סלולרי צריך להיות צלם. ניסויי חי תאי ההדמיה כמו גם ניתוחי off-line צריכות להתבצע בתנאים שהתעוורו כדי להבטיח נתונים בלתי משוחדים איסוף.

3. מדידה של מיטוכונדריה בחי Fibroblasts אדם

למדידה מקובלת של מיטוכונדריה באמצעות פוטנציאל הקרום המיטוכונדריה (MMP)-תלויים צבעים, ניאון מיון התא המופעל (FACS) הוא השיטה העיקרית. במקרה של fibroblasts אדם, הסלולרי autofluorescence לעתים קרובות נצפה ועלול לגרום לתוצאות חיוביות כוזבות על ידי הפרעה לאות המכתימה בפועל. Autofluorescence בדרך כלל הופכת בולטת יותר במספרים גבוהים יותר של מעבר fibroblasts. לכן, אנחנו מעדיפים להערכת תפקוד המיטוכונדריאלי של fibroblasts אדם על ידי מיקרוסקופ הדמית תא החי.

  1. 24-48 שעות לאחר זריעה, דגירת fibroblasts ב50 ננומטר של צבע tetramethylrodamine אתיל אסתר MMP התלויה (TMRE) במדיום RPMI. בינוני RPMI זו חסרה אדומה פנול כמו זה עלול להשפיע לרעה על איכות תמונה. 1.6 מיקרומטר של מכתים Hoechst יש להוסיף לדמיין גרעינים.
  2. דגירת תאים בפתרון מכתים מוכן מוגנים מפני אור למשך 15 דקות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
  3. החלף את הפתרון המכתים עם מדיום RPMI (בלי אדום פנול). המשך ללא צעד כביסה ומייד תמונת תאים. השתמש הגדלת 63x וטכניקת ליזר confocal סריקה מיקרוסקופית (מיקרוסקופי לחלופין פלואורסצנטי באמצעותטכניקת Apotome) להגדיר שכבות אחת של תאים. החל 37 ° C ו 5% CO 2 לתאים במהלך תהליך הדמיה.
  4. כאשר הדמיה את fibroblasts, לשים לב מרבי לזמן החשיפה מיושם של אור ניאון כמכתים TMRE יכול להלבין במהירות החוצה. הגדרת זמן החשיפה המתאימה בין 200 ל 300 ms ולא יעלה על פרק זמן זה. רכישת התמונה תחת הגדרות סטנדרטיות היא חשובה מאוד, כפי שניתן היה שלא תוכל לעשות השוואות מבוססות על עצמה אם ההגדרות שונות בין שורות תאים.
  5. כרדיוס מוגדר סביב תאי ההדמיה הוא דהוי מלאחר חשיפה לאור, לשמור על שדה הראייה מספקת הבא רחוק מסעיף photobleached.
  6. ניתוחי off-line מבוצעים באמצעות ImageJ תוכנה (וויין Rasband; המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב).
  7. בחר תא עניין שלך באמצעות כלי בחירה.
  8. המרת תמונה ל8-bit (תמונה <8-bit סוג <).
  9. הפחת ב רעש נוקבy באמצעות הפונקציה "despeckle" (תהליך <רעש <Despeckle).
  10. בחר את "לוחות Lookup - אש" מצב (תמונה <לוחות Lookup <אש).
  11. לעבור בפונקצית הסף ל" אובר / אנדר "פונקציה ולהתאים סף (<<סף תמונה התאם).
  12. בחר באפשרות "לנתח חלקיקים", אשר תיתן לך את הערך האפור ממוצע לכל חלקיק זיהוי המיטוכונדריה (Analyze <חלקיקי Analyze). שמור את רשימת תוצאות ניתן כגיליון Excel.
  13. פתח קובץ תוצאה בתכנית Excel ולחשב את הממוצע של הערך האפור הממוצע של מבני המיטוכונדריה (מסומנת כ 'ממוצע' ברשימה ניתן להצטיין התוצאה).
  14. כדי ליצור עלילת פני שטח, לבחור את התוסף "העלילה האינטראקטיבית 3D פני השטח" בסעיף התוסף "3D". כאן, תוכל להמשיך ולהתאים את העלילה באמצעות אפשרויות תצוגה שונות. שינוי הצבעים "המקוריים" כדי "הספקטרום LUT" נותן סרגל קנה מידת האינטנסיביות של העלילה המתאימה.
  15. לחלופיןלשימוש TMRE לניתוח התפקוד המיטוכונדריאלי של fibroblasts אדם באמצעות הדמיה חייה תא, שילוב של הצבע הירוק Mitotracker FM MMP-העצמאי וMitotracker לצבוע MMP התלוי ניתן להשתמש CM-H 2 XRos. שוב, לfibroblasts אדם לחיות מיקרוסקופיה הדמית התא עדיפה, אבל באופן כללי חלופה זו שמשה גם באמצעות ניתוח FACS בסוג אחר של תאים 12. בעת שימוש בגישה חלופית זו כדי למדוד את תפקוד המיטוכונדריה בfibroblasts אדם, צעד 3-7 לפרוטוקול הסעיף 5 "מדידת colocalization mitochondrio-lysosomal בחי fibroblasts אדם" צריכה להיות מיושם. לכך, הכיסוי של אותות, מחיובי למיטוכונדריה Mitotracker גרין FM וMitotracker CM-H 2 XRos הן מחושב ומציין את כמות המיטוכונדריה פונקציונלית כמו יחס לכל נוכחי המיטוכונדריה.

4. מדידה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלי בחי Fibroblasts אדם

  1. 24-48שעות לאחר זריעה, תאים מדגירים 200 ננומטר Mitotracker גרין FM בRPMI בינוני (לא אדום פנול) מוגנות מפני אור למשך 15 דקות ב 37 ° C ו-CO 2% 5. 1.6 מיקרומטר של מכתים Hoechst צריכים לשמש כדי להדגיש את הגרעינים. Mitotracker גרין FM הוא צבע MMP-עצמאי, שכתמים כל המבנים המיטוכונדרי להציג.
  2. לשטוף בעדינות את התאים פעם עם PBS.
  3. הוסף בינוני RPMI טרי (בלי אדום פנול) לתאים ומייד תמונת תאים. השתמש הגדלת 63x וטכניקת ליזר confocal סריקה מיקרוסקופית (מיקרוסקופי לחלופין פלואורסצנטי באמצעות טכניקת Apotome) להגדיר שכבות אחת של תאים.
  4. ניתוחי off-line נלקחים על ידי השימוש בתוכנת ImageJ.
  5. בחר תא עניין שלך באמצעות כלי בחירה.
  6. המרת תמונה ל8-bit (תמונה <8-bit סוג <).
  7. להפחית את הרעש נוקב באמצעות הפונקציה "despeckle" (תהליך רעש <<Despeckle).
  8. השתמש במסנן הקונבולוציה להדגיש mitochonמבני drial (תהליך <מסננים <שזירה).
  9. התאם את הסף, כך שיחס אות לרעש הוא מתאים (<<סף תמונה התאם).
  10. על ידי שימוש באפשרות "לנתח חלקיקים", זיהוי האוטומטי של מבני המיטוכונדריה הוא יזם המבוסס על גודל הפיקסל שנבחר (Analyze <חלקיקי Analyze). פרמטרים המיטוכונדרי כמה מחושבים לאחר מכן כגון שטח, מערכת, צירים גדולים וקטנים או מעגלי. מדידות אלה ניתן להגדיר בנפרד (ניתוח <מדידות Set). שמור את רשימת תוצאות ניתן כגיליון Excel.
  11. פתח את קובץ תוצאה בתכנית העבודה של Excel. עם שימוש בפרמטרים כאלה, ניתוחים של מורפולוגיה מיטוכונדריה יכולים להתבצע. זה כולל הגדרה של גורם הצורה המציין את מידת ההסתעפות של רשת המיטוכונדריה [נוסחה: (היקפי 2) / (4 * PI () * אזור)], כמו גם את יחס ממדים המגדיר את האורך (נוסחת מיטוכונדריה: גדול צירים / צירים קלים).

5. מדידה של Colocalization Mitochondrio-lysosomal בחי Fibroblasts אדם

  1. 24-48 שעות לאחר זריעה, תאים מדגירים 200 ננומטר Mitotracker גרין FM ו100 ננומטר Lyostracker האדום DND-99 במדיום RPMI (בלי אדום פנול) המוגנים מפני אור למשך 15 דקות בשעת 37 ° C CO, 5% 2. 1.6 מיקרומטר של מכתים Hoechst משמש כדי להדגיש גרעינים.
  2. החלף הבינוני עם בינוני RMPI טרי (בלי אדום פנול) המכיל 100 ננומטר Lyostracker האדום DND-99. צבע זה חייב להיות נוכח במהלך פגישת ההדמיה כולו. אין לשטוף את התאים לאחר תקופת דגירה. מייד תמונת התאים. השתמש הגדלת 63x וטכניקת confocal (טכניקה לחלופין Apotome) להגדיר שכבות אחת של תאים.
  3. ניתוחי off-line נלקחים על ידי השימוש בתוכנת ImageJ.
  4. פתח את שתי תמונות המתאימות שברצונך לנתח במונחים של מעמד colocalization.
  5. המרת תמונה ל8-bit (תמונה <8-bit סוג <). להפחית את הרעש נוקב באמצעות הפונקציה "despeckle" בשתי התמונות (תהליך <רעש <Despeckle).
  6. בחר את התוסף "JACoP" ככלי colocalization ניתוח, אשר נותנת לך ערכים עבור הערוצים המתאימים, ומחשב את המקדם של פירסון, חפיפה מקדמות ומקדם 'מאנדרס (Plugins <JACoP).

6. נציג תוצאות

מיטוכונדריה בחי fibroblasts אדם יכולה להיות מוערכת באמצעות טכניקת הדמית תא חייה. עבור מבחנים תפקודיים, אותות פלואורסצנטי TMRE קורלציה עם פוטנציאל קרום המיטוכונדריה (MMP). בתנאים נורמלים MMP, פלואורסצנטי TMRE הוא גבוה באופן משמעותי (איור 1 א, בשורה העליונה) מאשר במצבים פתולוגיים המתאפיינים בMMP מופחת (איור 1 א, שורה תחתונה). עוצמת קרינה זו נמדדת על ידי חישוב הממוצע של השווי האפור הממוצע של כל מבנה המיטוכונדריה ( (איור 1 א, בצד ימין).

בא להערכת תפקוד המיטוכונדריה בfibroblasts אדם, מיקרוסקופיה הדמית תא החייה יכולה לשמש כדי להגדיר פרמטרים שונים של המורפולוגיה של המיטוכונדריה. באמצעות Mitotracker גרין מבנים המיטוכונדרי FM לצבוע הם דמיינו עצמאיים של MMP, בהתאמה (איור 2). זה חשוב כדי להבטיח את הכללת כל המבנים הנוכחיים לניתוחי המיטוכונדריה. שימוש ImageJ תוכנה, המורפולוגיה מנותחת על בסיס נתונים בינאריים, כמו שרק פרמטרי מורפולוגיה כאן המיטוכונדרי ניתן להעריך (איור 2, "בינארי"). דוגמאות לניתוחי מורפולוגיה המיטוכונדרי במונחים של גורם צורה, כמו גם יחס התפרסמו 6, 1 לאחרונה3. תכונה חשובה נוספת שניתן למדוד בחי fibroblasts אדם היא השפלה של מבני המיטוכונדריה. הצעד הראשון בתהליך זה יכול להיות מוערך על ידי colocalization mitochondrio-lysosomal במיקרוסקופ הדמית תא חי. מצבים פתולוגיים מסוימים גורמים לcolocalization מוגבר של המיטוכונדריה עם lysosomes (איור 3 א). שוב, Mitotracker גרין FM משמש לכתם מבנים עצמאיים של MMP חוקי המיטוכונדריה. בנוסף, הכתים עם Lysotracker האדום DND-99 מאפשר המחשת מבני lysosomal. זה קריטי, כי הצבע האדום Lysotracker נוכח במהלך תהליך ההדמיה, כצעדי כביסה להפחית את האות שהופכת להיות נמוך מדי להדמיה. Colocalization מיוצג על ידי אותות קרינה צהובים ברורים עקב החפיפה של ירוק (Mitotracker הירוק FM) והאדומה (Lysotracker האדום DND-99) צביעה (חצים לבנים, האיור 3A) ונקבע על ידי חישוב של פירסון Coefficient (איור 3 ב ').

באופן כללי, עבור ניתוחי off-line עם ImageJ תוכנה, כדאי לדמיין תא אחד לכל תמונה, כך שההגדרה של אזור מסוים של עניין (ROI) ניתן להימנע מכך.

איור 1
איור 1. מדידה של אות פלואורסצנציה TMRE המציין את פוטנציאל קרום המיטוכונדריה (MMP) בחי fibroblasts אדם על ידי טכניקת הדמית תא חייה. () TMRE הוא צבע פלואורסצנטי MMP-תלוי, שפלואורסצנטי עוצמת קורלציה עם MMP. Hoechst צבע שמש לכתם גרעינים (כחול). בתנאים נורמלים MMP (בשורה העליונה), את קרינת TMRE היא גבוהה באופן משמעותי מאשר במצבים פתולוגיים המתאפיינים בMMP מופחת (שורה תחתונה). עוצמת קרינה מוצגת בנוסףכעלילת משטח עצמה. סרגל קנה מידה מציין 10 מיקרומטר. (ב) ניתוח סטטיסטי של fibroblasts המופת שמוצג ב(). תחת מצבים פתולוגיים, פלואורסצנטי TMRE ירידה של המיטוכונדריה נמדד בהשוואה למצב הנורמלי MMP. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. מדידת המורפולוגיה של המיטוכונדריה בחי fibroblasts אדם על ידי טכניקת הדמית תא חייה. Mitotracker גרין FM (ירוק) משמש לדמיין מבני המיטוכונדריה, שלזה הוא עצמאי של MMP. Hoechst צבע שמש לכתם גרעינים (כחול). שימוש ImageJ תוכנה, המורפולוגיה ניתן לנתח על דמויות בינאריות. סרגל קנה מידה מציין 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. מדידת colocalization של המיטוכונדריה עם lysosomes בחי fibroblasts אדם על ידי טכניקת הדמית תא חייה. () Mitotracker גרין FM (ירוק) משמש לכתם מבני המיטוכונדריה, Lyostracker האדום DND-99 (אדום) visualizes מבני lysosomal. Hoechst צבע שמש לכתם גרעינים (כחול). colocalization המוצלח תחת מצבים פתולוגיים מסומן באות צהובה בשל חפיפה של רד Lysotracker וכתמים ירוקים Mitotracker (חצים לבנים). סרגל קנה מידה מציין 10 מיקרומטר. (ב) ניתוח סטטיסטי של fibroblasts המופת שמוצג ב(). דרגה גבוהה יותר של תוצאות colocalization mitochondrio-lysosomal בערך מקדם פירסון מוגבה./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

fibroblasts עור מטופל כמודלי vivo לשעבר מייצג כלי חשוב לאפיין פגמים גנטיים למחלה נלווית. בנוסף, fibroblasts עור הנגזר נגיש בקלות וניתן להרחיב על culturing. לכן, תאים ראשוניים המתקבלים מחולים שנשאו מוטציות גנטיות הקשורים פ"ד עדיפים על השימוש בשורות תאים סרטניות כפי שהם מכילים לא רק את גן אנדוגני גורמי מחלות, אבל כל הרקע הגנטי של הפרט המושפע. יתר על כן, fibroblasts הוכח משקף תכונות פתולוגיים חשובות של תפקוד המיטוכונדריה במהלך ניוון מוחיה. הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה הם יעילים במיוחד לחקירת פנוטיפים המיטוכונדריה כולל פונקציה, מורפולוגיה, כמו גם הערכה של המיטוכונדריה colocalization עם lysosomes באמצעות טכניקת הדמית תא חייה. לכך, סימני ההיכר עיקריים של המחלה, כלומר תפקוד המיטוכונדריה וdegrad הבאation של אברונים הלא הפונקציונליים אלה, ניתן דמיין ונתח כראוי 6, 13. נראה כי שינויים בתפקוד ומורפולוגיה של המיטוכונדריה הם לעתים קרובות צעד ראשון של המחלה פתולוגיה. לדוגמה, הגדיל את מידת פיצול של רשת מיטוכונדריה יכול להיות תנאי מוקדם לתהליכים משופרים autophagic וmitophagic 6,12. לכן, colocalization של המיטוכונדריה עם lysosomes עשוי לעזור להעריך שפלת המיטוכונדריה (mitophagy) 6. חוסר colocalization זה, כמו גם הצטברות של המיטוכונדריה עם lysosomes יכול לשקף פגמים במסלול התדרדרות lysosomal וצריך להיות מאומת על ידי שטף autophagic ויסות 6. בהקשר זה, ImageJ תוכנה מייצגת כלי חשוב ליצירת ערכות נתונים מאומתים על ידי פונקציות חצי אוטומטיות שאינם מוטות-ניתוח.

אפשרות נוספת שמרחיבה את השימוש של fibroblasts אדם לדגמים נוספים הקשורים למחלה היא generat הפוטנציאליון של גזע תאים מושרים pluripotent (IPS), שיכול להיות מובחן לסוגי התאים שונים שהמטרה העיקרית של תהליך המחלה 14. במקרה של מחלת פרקינסון, הבידול של fibroblasts לנוירונים דופאמין גורם מודל סלולרי זה כלי מבטיח למחקר עתידי בהפרעת ניווניות זה 15,16. חשוב מכך, את כל המבחנים שתוארו בפרוטוקול כאן יכול להיות מתורגם בקלות לתוך setups הניסיוני לחקר שינויים בתוך המיטוכונדריה נוירונים דופאמין. כמובן, ניסויים אפילו יותר נוירון ספציפי חי תאי הדמיה ניתן גם להחיל,.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן תיסן (10.11.2.153 לר.ק.), המועצה למחקר הגרמניה (DFG, KR2119/3-2 וKR2119/8-1 לר.ק.), המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 לר.ק.) ועל ידי מלגת דוקטורט מHertie קרן הצדקה [לLFB]. אנו מודים קרולין Obermaier וג'וליה סטרמאייר על תמיכתם בזמן צילומי וידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red Invitrogen 11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
AccuMax (detachment solution) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Green FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
H–chst 33342 Invitrogen H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson's disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
  2. Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
  3. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
  4. Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
  5. Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson's disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
  6. Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson's disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
  7. Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
  8. Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge--the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson's disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
  9. Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
  10. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
  11. Dagda, R. K., Cherra, S. J. 3rd, Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. 284-13843 (2009).
  12. Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
  13. Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson's disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
  14. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  15. Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
  16. Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics