파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

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Summary

파킨슨 병을 일으키는 유전자에 변이를 가지고 환자의 섬유 아세포가 쉽게 접근 할 수를 나타냅니다

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Burbulla, L. F., Krüger, R. The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (68), e4228, doi:10.3791/4228 (2012).

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Abstract

파킨슨 병 (PD)는 두 번째 가장 일반적인 운동 장애입니다 60 1 세 이상 사람들의 1 %를 영향을 미칩니다. 노화의 가장 중요한 위험 인자이기 때문에, PD의 경우는 다음 수십 년이 동안 증가 할 것이다. 병적 인 단백질 폴딩과 장애인 단백질 열화 경로 옆에 mitochondrial 기능과 형태의 변경은 PD 3-11의 neurodegeneration의 추가 특징으로 지적되었다.

Parkinsonism의 분자 경로를 해부하는 체외 모델에서와 같이 손쥐과 인간의 암 세포의 연구의 년 후에, 전직 생체 모델로 환자와 적절한 컨트롤에서 인간 섬유 아세포의 사용은 잠재적 인 경고로 간주하는 경우, 가치있는 연구 도구가되었습니다. 불후 아니라 인공 세포 모델보다 다른 질병 관련 변이를 들고 환자에서 주요 섬유 아세포는 분명히 중요한 병적 인 기능 O를 반영F 인간의 질병.

여기, 피부 biopsies을 복용 배양 인간 섬유 아세포 및 mitochondrial phenotypes을 정의하기 위해 필수적인 현미경 기술에 대한 상세한 프로토콜을 사용하는 절차를 윤곽을 그리다. 이는 mitochondrial 기능과 역학 관련이있는 PD와 관련된 다양한 기능을 조사하는 데 사용되었습니다. 예 생체가 미토콘드리아는 lysosomal 경로를 통해 자신의 기능, 형태, 리소좀 (세포 소기관 굴욕 역기능 미토콘드리아)과 저하 colocalization의 관점에서 분석 될 수 . 이 phenotypes는 PD의 조기 징후의 식별을위한 관련성이 높은 인간의 질병 유전자 캐리어의 임상 모터 증상을 앞에 할 수 있습니다. 따라서 여기에 제시된 assays는 neurodegeneration의 병적 인 기능을 파악하고 PD의 새로운 치료 전략을 정의하는 데 도움이 중요한 도구로 활용 될 수있다.

Protocol

1. 피부 생검과 인간 섬유 아세포의 배양

  1. 피부 생검은 경험이 풍부한 의사의주의가 필요하다. 절차는 무균 조건 하에서 일어난 지역의 마취가 필요합니다. 생검에 사용되는 일반적인 사이트는 상단 팔, 어깨 또는 허리의 안쪽입니다.
  2. 당신은 배양 인간 섬유 아세포에 충분한 조직을 얻을 펀치 생검에 의해 4x4mm 또는 6x6mm 직경 표본이 소요될 수 있습니다.
  3. 피부 2 ~ 4 T25 플라스크에 넣어 분리하는 무균 조건 하에서 같은 작은 조각으로 생검을 자른다. 모든 병은 표피로부터 2-3 조각을 포함해야합니다. 문화 미디어는 15 % FCS, 1.1 %의 나트륨 pyruvate와 1% 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 미디어에서 페니실린 / 스트렙토 마이신이 포함되어 있습니다.
  4. 37 세포를 배양 ° C 5 % CO 2. 첫번째 섬유 아세포는 표피 샘플에서 성장까지 예상 전파 시간은 1-2 주입니다. 성장 문제가 발생할 경우, 섬유 아세포 성장 FA를 이용하실 수 있습니다ctor는 (5-10 NG / ML FGF2) 세포의 성장을 강화합니다.
  5. 50-70%의 셀 confluency에 도달하면 기본 인간 섬유 아세포를 동결 할 수 있습니다. 50-70%의 confluency까지 시간에 도달, 세포 라인 사이에 다릅니다. 90% FCS 플러스 10% 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 섬유 아세포를 동결.

2. 라이브 셀 이미징 현미경에 대한 인간 섬유 아세포의 작성

노화 - 관련 변경이 여러 통로 후 셀의 속성을 변경할 수 있으므로 일반적으로 인간의 섬유 아세포로 실험은 10 아래 구절을 수행해야합니다. 의심의 경우, 베타 갈 락토의 assays는 각 셀에 노화 과정의 유도를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로 노인 섬유 아세포를 (위 참조)를 사용하지 않습니다. 또한, 여러 세포 라인을 비교하기 위해 각 셀 라인의 동일한 통로 번호로 작동합니다. 건강한 컨트롤에 비해 다른 유전자 동질 환자의 비교하는 것이 좋습니다. 그러나, 때때로특정 변이를 들고 환자가 드문이 될이 특정 구절 번호와 다른 제어 라인 만 한 환자에서 피부 biopsies 포함해야한다는 의미 할 수 있습니다 - 여기 포함 된 모든 행의 동일한 통로 번호를 보장하기 위해 필수적입니다. 50-70%의 셀 confluency에 도달하지만 실험을 계획하지 않으면, 섬유 아세포는 냉동해야합니다.

  1. 실험의 첫 날, PBS로 한 번에 첨부 된 섬유 아세포을 씻는다. 그런 다음 proteolytic DNase 효소 (예 AccuMax)의 세포 손상이 솔루션을 사용하여 플라스크 바닥에서 그들을 놓습니다.
  2. 4 챔버 coverglass (물론 당 1.8 cm 문화 영역)의 각 잘에 세포와 씨앗 50,000-70,000 세포를 계산합니다. 따라서, 8 챔버 coverglas를 들어, 전화 번호 이하 약간의 절반은 (물론 당 0.8 cm 문화 영역) 적합합니다. 그것은 종자보다는 실제 단일 셀 분석을 수행 할 셀의 소수 중요합니다. 챔버에 대한 구체적인 코팅 없습니다 전s은 (는)이 필요했습니다.
  3. 24-48 시간 후, 라이브 셀 이미징 실험을 수행 할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 현미경은 온도와 CO 2 수준을 제어하는 보육가 장착되어 있는지 확인하십시오. 이미지 수집하는 동안, 37의 분위기는 ° C와 5 % CO 2는 유지되어야합니다.
  4. 각 라이브 셀 이미징 측정은 적어도 세 독립적 인 실험에서 수행해야합니다. 총, 셀 라인 당 50 셀의 최소 이미징해야합니다. 라이브 셀 이미징 실험뿐만 아니라 오프라인 분석은 수집 편견 데이터를 보장하기 위해 눈을 멀게 조건 하에서 수행해야합니다.

3. 인간 섬유 아세포 생활에 Mitochondrial 기능의 측정

mitochondrial 막 전위 (MMP)에 따라 달라 염료를 통해 mitochondrial 기능의 종래의 측정을 위해, 형광등 활성화 셀 정렬 (FACS)는 기본 방법입니다. 인간 섬유 아세포의 경우, 휴대 autofluore에서카메라는이 자주 관찰되고 실제 착색 신호와 간섭에 의해 거짓 긍정적 인 결과가 발생할 수 있습니다. Autofluorescence은 일반적으로 섬유 아세포의 높은 통로 번호를 강조된다. 따라서, 우리는 라이브 세포 이미징 현미경에 의해 인간 섬유 아세포의 mitochondrial 기능을 평가하는 것을 선호합니다.

  1. 24-48 시간 시딩 후 RPMI 매체에서 MMP에 의존 염료 tetramethylrodamine 에틸 에스테르 (TMRE)의 50 나노 미터에서 섬유 아세포를 품다. 이 부정적인 이미지 품질에 영향을 미칠 수 있으므로이 RPMI 매체 페놀 빨간색 부족합니다. Hoechst의 착색의 1.6 μM이 핵을 시각화에 추가해야합니다.
  2. 37 ° C 5 % CO 2에서 15 분을 위해 빛으로부터 보호 준비 착색 솔루션에 세포를 배양.
  3. RPMI 매체 (페놀 레드 제외)으로 착색 솔루션을 교체합니다. 세탁 단계 즉시 이미지 셀하지 않고 계속합니다. 63x 배율 및 사용 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 기술 (또는 형광 현미경을 사용하여Apotome 기술)는 세포의 단일 레이어를 정의합니다. 37 적용 ° C, 5 %가 이미징 과정에서 셀에 2 CO.
  4. 이미징 섬유 아세포가 TMRE의 얼룩을 신속하게 표백 아웃 할 수있는 한 형광 빛의 적용 노출 시간에 최대주의를 지불합니다. 200 300 밀리 초 사이에 적절한 노출 시간을 정의하고이 간격을 초과하지 않습니다. 설정이 세포 라인 사이에 다를 경우 하나가 강도에 따라 비교 할 수없는 것 같은 표준화 된 설정 아래에있는 이미지 수집은 매우 중요합니다.
  5. 이미징 세포 주변에 정의 된 반경이 빛 노출 후에 표백에 따라, 충분히 멀리 photobleached 섹션에서 다음 시야를 유지.
  6. 오프라인 분석은 ImageJ 소프트웨어 (, 보건 국립 연구소, 미국 웨인 Rasband)를 사용하여 수행됩니다.
  7. 선택 도구를 사용하여 관심 셀을 선택합니다.
  8. 8 비트에 이미지 변환 (이미지 <유형 <8 비트).
  9. 불특정 노이즈 B를 감소y는 "despeckle"기능 (프로세스 <소음은 <Despeckle)를 사용하여.
  10. 조건 (이미지 <조회 테이블 <화재) - "불 조회 테이블"을 선택하십시오.
  11. "오버 / 언더"기능으로 임계 값 기능에 전환 (이미지 <조정 <임계 값) 임계 값을 조정합니다.
  12. 당신에게 감지 각 mitochondrial 입자 (분석 <분석 입자)의 평균 회색 값을 제공합니다 "입자를 분석"옵션을 선택합니다. Excel 스프레드 시트로 주어진 결과 목록을 저장합니다.
  13. 오픈 결과 엑셀 프로그램의 파일과 mitochondrial 구조의 평균 회색 값의 평균 (주어진 엑셀 검색 결과 목록에서 '평균'으로 표시됨) 계산합니다.
  14. 표면 플롯을 만들려면 "3D"플러그인 섹션에서 플러그인 "대화 형 3D 표면 플롯 '을 선택합니다. 여기, 당신은 더 다양한 디스플레이 옵션을 사용하여 줄거리를 조정할 수 있습니다. "스펙트럼 LUT"로 "원본 색상"을 변경하면 해당 플롯의 강도 스케일 바 있습니다.
  15. 양자 택일로라이브 셀 이미징, MMP 독립적 인 염료 Mitotracker 그린 FM의 조합 CM-H 2 XRos를 사용할 수 있습니다 MMP에 의존 염료 Mitotracker을 통해 인간 섬유 아세포의 mitochondrial 기능을 분석하는 TMRE를 사용합니다. 다시, 인간 섬유 아세포에 대한 세포 이미징 현미경 선호 살고 있지만, 일반적으로이 방법은 세포 12의 다른 종류의 FACS 분석을 사용하여 사용되었습니다. 인간 섬유 아세포의 mitochondrial 기능, 프로토콜 섹션 5 단계 3-7 측정이 대체 방법을 사용하여 "인간 섬유 아세포 생활에 mitochondrio-lysosomal colocalization의 측정은"적용되어야합니다. 이와, Mitotracker 그린 FM 및 Mitotracker CM-H 2 XRos에 대한 미토콘드리아 긍정적에서 두 신호의 오버레이는 계산 및 모든 미토콘드리아 현재까지의 비율로 기능 미토콘드리아의 양을 나타냅니다.

4. 인간 섬유 아세포 생활에 Mitochondrial 형태론의 측정

  1. 24-48시간은 심는 후, RPMI 배지 200 NM Mitotracker 그린 FM (NO 페놀 적색)의 배양 세포는 37 15 분에 빛으로부터 보호 ° C 5 % CO 2. Hoechst의 착색의 1.6 μM이 핵을 강조하기 위해 사용되어야합니다. Mitotracker 그린 FM은 모든 mitochondrial 구조 제시 얼룩 MMP 독립적 인 염료입니다.
  2. 부드럽게 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오.
  3. 세포 즉시 이미지 셀에 신선한 RPMI 매체를 (페놀 레드없이)를 추가합니다. 셀의 단일 레이어를 정의하는 63x 배율과 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 기술을 (Apotome 기술을 사용하여 대안 형광 현미경)을 사용합니다.
  4. 오프라인 분석은 ImageJ 소프트웨어의 사용에 의해 촬영되어 있습니다.
  5. 선택 도구를 사용하여 관심 셀을 선택합니다.
  6. 8 비트에 이미지 변환 (이미지 <유형 <8 비트).
  7. (프로세스가 <노이즈 <Despeckle)를 "despeckle"기능을 사용하여 불특정 노이즈를 줄일 수 있습니다.
  8. mitochon을 강조하기 위해 회선 필터를 사용하여drial 구조 (<필터 <말다를 처리).
  9. 신호 대 잡음 비율이 적절하도록 임계 값을 조정합니다 (이미지 <조정 <임계 값).
  10. "입자를 분석"옵션을 사용하여 mitochondrial 구조의 자동 식별은 (분석 <분석 입자) 선택한 픽셀 크기에 따라 시작됩니다. 여러 mitochondrial 매개 변수는 이후 같은 지역, 둘레, 미성년자 주요 축 또는 둥글 원형으로 계산됩니다. 이러한 측정 (<설정 측정 분석) 개별적으로 설정할 수 있습니다. Excel 스프레드 시트로 주어진 결과 목록을 저장합니다.
  11. 엑셀 프로그램에서 결과 파일을 엽니 다. 이러한 매개 변수의 사용과, mitochondrial 형태의 분석이 수행 할 수 있습니다. 이 mitochondrial 네트워크 분기의 정도를 나타내는 폼 팩터의 정의 포함 [공식 : (경계 2) / (4 * PI () * 지역)]뿐만 아니라 가로 세로 비율은 미토콘드리아 (수식의 길이를 정의 : 주요 축 / 작은 축).

5. 인간 섬유 아세포 생활에 Mitochondrio-lysosomal Colocalization 측정

  1. 24-48 시간 시딩 후, 200 nm의 Mitotracker 그린 FM과의 배양 세포를 100 nm의 Lyostracker 레드 37 ° C 5 % CO 2에서 15 분을 위해 빛으로부터 보호 RPMI 매체 (페놀 레드없이)에서 DND-99. Hoechst의 착색의 1.6 μM이 핵을 강조하는 데 사용됩니다.
  2. 신선한 RMPI 매체 (페놀 레드없이) 100 NM Lyostracker 레드 DND-99을 포함하는으로 매체를 교체하십시오. 이 염료는 전체 이미징 세션 중에 존재합니다. 잠복기 후 세포를 씻어하지 마십시오. 즉시 이미지 셀을. 셀의 단일 레이어를 정의하는 63x 배율과 공 촛점 기술을 (또는 Apotome 기술)을 사용합니다.
  3. 오프라인 분석은 ImageJ 소프트웨어의 사용에 의해 촬영되어 있습니다.
  4. 당신이 colocalization 상태의 관점에서 분석하고자하는 두 각각의 이미지를 엽니 다.
  5. 8 비트에 이미지 변환 (이미지 <유형 <8 비트). 두 이미지의 "despeckle"기능을 (프로세스가 <노이즈 <Despeckle)를 사용하여 불특정 노이즈를 줄일 수 있습니다.
  6. 플러그인 당신에게 해당 채널에 대한 값을 제공하고 피어슨의 계수를 계산 colocalization 분석 도구로 "JACoP", 계수를 중복 Manders '계수 (플러그인 <JACoP)을 선택합니다.

6. 대표 결과

인간 섬유 아세포 생활의 Mitochondrial 기능은 라이브 세포 이미징 기술을 통해 평가 될 수있다. 기능 assays를 들어, TMRE 형광 신호는 mitochondrial 막 전위 (MMP)에 연결합니다. 일반 MMP 조건에서 TMRE의 형광이 감소 MMP (그림 1A, 낮은 행)을 특징으로 병적 인 조건에서보다 (그림 1A, 상단 행) 상당히 높다. 이 형광 강도는 모든 mitochondrial 구조의 평균 회색 값의 평균을 계산하여 측정됩니다 ( (그림 1A, 오른쪽)의 그림 할 수 있습니다.

인간 섬유 아세포의 mitochondrial 기능의 평가 옆에, 라이브 셀 이미징 현미경은 mitochondrial 형태의 다른 매개 변수를 정의하는 데 사용할 수 있습니다. Mitotracker를 사용하여 그린 FM 염료 mitochondrial 구조는 각각의 MMP (그림 2)의 독립적 인 시각화 수 있습니다. 이 분석에 현재 모든 mitochondrial 구조의 포함을 보장하기 위해 중요합니다. ImageJ 소프트웨어 사용 형태는으로 만 여기 mitochondrial 형태의 매개 변수 (그림 2, "바이너리") 평가 할 수 바이너리 수치에 기초하여 분석하고 있습니다. 폼 팩터뿐만 아니라 가로 세로 비율의 측면에서 mitochondrial 형태 분석에 대한 예는 최근 6, 1을 발표했다3. 인간 섬유 아세포 생활로 측정 할 수 있습니다 또 다른 중요한 기능은 mitochondrial 구조의 저하입니다. 이 진행의 첫 번째 단계는 라이브 셀 이미징 현미경의 mitochondrio-lysosomal colocalization에 의해 평가 될 수있다. 일부 병적 인 조건 리소좀 (그림 3A)과 미토콘드리아의 증가 colocalization하는 결과를 가져올 수도 있습니다. 다시 Mitotracker 그린 FM은 해당 MMP의 독립적 인 mitochondrial 구조를 착색하는 데 사용됩니다. 또한, Lysotracker 레드 DND-99와 얼룩은 lysosomal 구조를 시각화 할 수 있습니다. 그것은 세척 단계가 시각화를 위해 너무 낮은집니다 신호를 감소 Lysotracker 빨간 염색약이 이미징 과정에서 존재하는 것이 중요합니다. Colocalization은 녹색 (Mitotracker 그린 FM)과 빨간색 (Lysotracker 레드 DND-99) 착색 (흰색 화살표, 그림 3A)의 중복으로 인해 맑은 노란색 형광 신호로 표시되고 피어슨 COE의 계산에 따라 결정됩니다fficient (그림 3B).

일반적으로, ImageJ 소프트웨어와 오프라인 분석을 위해, 그것은 관심의 특정 지역 (ROI)의 정의가 피할 수 있도록, 이미지 당 하나의 셀을 시각화하기 위해 도움이 될 것입니다.

그림 1
그림 1. 라이브 세포 이미징 기술로 인간의 섬유 아세포 생활의 mitochondrial 막 전위 (MMP)를 나타내는 TMRE 형광 신호의 측정. (A) TMRE 누구의 형광 강도 MMP와 상관 관계 형광등 MMP에 따라 달라 염료입니다. Hoechst 염색은 핵 (파란색)를 착색하는 데 사용되었다. 일반 MMP 조건에서 (상단 행), TMRE의 형광이 감소 MMP (하단 행)을 특징으로 병적 인 조건에서보다 훨씬 높다. 형광 강도가 추가로 표시됩니다강도 표면 플롯 있습니다. 스케일 바는 10 μm을 나타냅니다. (B) 모범적 인 섬유 아세포의 통계적 분석 (A)에 표시. 병적 인 조건에서 미토콘드리아의 감소 TMRE의 형광은 일반 MMP 조건에 비해 측정됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 라이브 세포 이미징 기술로 인간의 섬유 아세포 생활에서 mitochondrial 형태의 측정. Mitotracker 그린 FM (녹색)이 mitochondrial 구조를 시각화하는 데 사용됩니다, 그것은 MMP의 독립적입니다. Hoechst 염색은 핵 (파란색)를 착색하는 데 사용되었다. ImageJ 소프트웨어 사용 형태는 이진 숫자에 분석 할 수 있습니다. 스케일 바는 10 μm을 나타냅니다. 클릭하십시오 여기에 큰 그림을 볼 수 있습니다.

그림 3
그림 3. 라이브 세포 이미징 기술로 인간의 섬유 아세포 생활에서 리소좀과 미토콘드리아의 colocalization 측정. (A) Mitotracker 그린 FM (녹색)이 mitochondrial 구조를 착색하는 데 사용됩니다, Lyostracker 레드 DND-99 (빨간색)은 lysosomal 구조를 시각화. Hoechst 염색은 핵 (파란색)를 착색하는 데 사용되었다. 병적 인 조건에서 성공적으로 colocalization는 Lysotracker의 레드와 Mitotracker의 녹색 착색 (흰색 화살표)로 중복으로 인해 노란색 신호로 표시됩니다. 스케일 바는 10 μm을 나타냅니다. (B) 모범적 인 섬유 아세포의 통계적 분석 (A)에 표시. 높은 피어슨 계수 값에 mitochondrio-lysosomal colocalization 결과의 높은 학위를 취득했습니다./ 4228/4228fig3large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

예 생체 모델과 같은 환자 피부 섬유 아세포는 질병 관련 유전자 결함을 특징하는 중요한 도구를 나타냅니다. 또한, 피부 파생 섬유 아세포가 쉽게 접근 할 수 있으며, 배양에 확장 할 수 있습니다. 그들은 내생 질병을 일으키는 유전자 있지만, 영향을받는 개인의 전체 유전자 배경뿐만 아니라이 포함되어 그러므로, PD-관련 유전자 변이를 들고 환자에서 얻은 주요 세포는 종양 세포 라인의 사용으로 바람직합니다. 또한, 섬유 아세포는 neurodegeneration 동안 mitochondrial 장애의 중요한 병리학 기능을 반영하기 위해 표시되었습니다. 이 프로토콜에 설명 된 실험 기능, 형태뿐만 아니라 라이브 세포 이미징 기술을 통해 리소좀과 미토콘드리아의 평가 colocalization 등의 mitochondrial phenotypes을 공부에 특히 유용합니다. 이와,이 병의 주요 특징, 즉 mitochondrial 장애 및 이후 degrad이러한 비 기능적인 세포 소기관의 ation은 시각화 할 수 있으며, 제대로 6 13를 분석했다. mitochondrial 기능과 형태의 변경은 종종 질병 병리학의 첫 번째 단계입니다. 예를 들어, mitochondrial 네트워크의 분열이 강화 autophagic 및 mitophagic 프로세스 6,12의 전제 조건이 될 수 증가했습니다. 따라서, 리소좀과 미토콘드리아의 colocalization는 mitochondrial 저하 (mitophagy) 6을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 colocalization의 부족뿐만 아니라 리소좀과 미토콘드리아의 축적은 lysosomal 저하 경로의 결함을 반영하고 변조 autophagic 유동적 6 검증 할 수 있습니다 수 있습니다. 이러한 맥락에서, ImageJ 소프트웨어는 반 자동이 아닌 바이어스 분석 기능에 의해 검증 된 데이터 세트를 생성 할 수있는 중요한 도구를 나타냅니다.

더 질병 관련 모델에 인간 섬유 아세포의 사용을 확장 추가 옵션은 잠재적 인 generat입니다질병 과정 14 주 대상 아르 별개의 세포 유형으로 차별화 할 수 유도 만능 줄기 (IPS) 세포의 이온. 파킨슨 병의 경우, dopaminergic 뉴런의 섬유 아세포로의 분화는 세포 모델이 neurodegenerative 장애 15,16 향후 연구 유망 도구합니다. 중요한 것은 여기 프로토콜의 설명 assays 모두 쉽게 dopaminergic 뉴런 내에서 mitochondrial 변경에 대해 조사를 위해 실험 설정로 번역 할 수 있습니다. 물론, 더 많은 뉴런 별 라이브 셀 이미징 실험도 적용 할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 프리츠 티센 (Thyssen) 재단 (RK에 10.11.2.153), 독일 연구 협회 (DFG, KR2119/3-2 및 RK에 KR2119/8-1), 교육 연방 교육부 및 연구 (BMBF에서 보조금에 의해 지원되었다 , NGFNplus, RK에 01GS08134)과 [LFB로] 자선 Hertie 재단의 박사 장학금으로. 우리는 비디오 촬영시의 지원 캐롤라인 Obermaier와 줄리아 Westermeier 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red Invitrogen 11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
AccuMax (detachment solution) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Green FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
H–chst 33342 Invitrogen H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.

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References

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