पार्किंसंस रोग के क्षेत्र में Mitochondrial phenotypes की निगरानी के लिए प्राथमिक मानव fibroblasts का प्रयोग करें

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Summary

पार्किंसंस रोग के कारण जीन में उत्परिवर्तन ले रोगियों से Fibroblasts एक आसानी से सुलभ प्रतिनिधित्व करते हैं

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Burbulla, L. F., Krüger, R. The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (68), e4228, doi:10.3791/4228 (2012).

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Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) दूसरा सबसे आम आंदोलन विकार और 60 1 साल की उम्र से अधिक लोगों की 1% को प्रभावित करता है. क्योंकि उम्र बढ़ने के सबसे महत्वपूर्ण जोखिम कारक है, पीडी के मामलों में अगले दो दशकों के दौरान वृद्धि होगी. रोग प्रोटीन तह और बिगड़ा प्रोटीन गिरावट रास्ते, mitochondrial समारोह और आकारिकी परिवर्तन 3-11 पीडी में neurodegeneration की पहचान के रूप में आगे बताया गया है.

इन विट्रो मॉडल में पार्किंसनिज़्म के आणविक मार्ग काटना murine और मानव कैंसर कोशिकाओं में अनुसंधान के वर्षों के बाद, और पूर्व vivo मॉडल के रूप में रोगियों को उचित नियंत्रण से मानव fibroblasts के उपयोग के एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण बन गया है, अगर संभावित निरंतर माना जाता है. अमर, बल्कि कृत्रिम कोशिका मॉडल की तुलना में अन्य, रोग जुड़े म्यूटेशन ले रोगियों से प्राथमिक fibroblasts जाहिरा तौर पर महत्वपूर्ण रोग सुविधाओं ओ प्रतिबिंबितच मानव रोग.

यहाँ हम त्वचा बायोप्सी लेने, संवर्धन मानव fibroblasts और आवश्यक सूक्ष्म तकनीक के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग mitochondrial phenotypes को परिभाषित करने की प्रक्रिया को चित्रित करना. ये अलग पीडी के साथ जुड़े सुविधाओं कि mitochondrial समारोह और गतिशीलता के लिए प्रासंगिक हैं की जाँच करने के लिए इस्तेमाल किया गया. पूर्व vivo, lysosomal मार्ग के माध्यम से mitochondria उनके समारोह में, आकारिकी (organelles अपमानजनक बेकार mitochondria) lysosomes और गिरावट के साथ colocalization के संदर्भ में विश्लेषण किया जा सकता है . इन phenotypes अत्यधिक पीडी के प्रारंभिक लक्षण की पहचान के लिए प्रासंगिक हैं और मानव रोग जीन वाहकों में नैदानिक ​​मोटर लक्षण पूर्व में होना हो सकता है. इसलिए, यहाँ प्रस्तुत assays मूल्यवान उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है neurodegeneration के रोग की पहचान और पीडी में नए चिकित्सीय रणनीतियों को परिभाषित करने में मदद.

Protocol

1. त्वचा बायोप्सी और मानव fibroblasts के संवर्धन

  1. त्वचा बायोप्सी के लिए एक अनुभवी चिकित्सक द्वारा लिया जाना है. प्रक्रिया बाँझ शर्तों के तहत जगह लेता है और स्थानीय संज्ञाहरण की आवश्यकता है. ठेठ बायोप्सी के लिए इस्तेमाल किया साइटों ऊपरी बांह, कंधे या पीठ के निचले हिस्से के भीतर की ओर हैं.
  2. आप पंच बायोप्सी द्वारा 4x4mm या 6x6mm व्यास नमूना लेने के लिए पर्याप्त ऊतक संवर्धन मानव fibroblasts के लिए मिल सकता है.
  3. कट त्वचा बाँझ शर्तों के तहत बराबर छोटे टुकड़ों में बायोप्सी के लिए उन्हें 2-4 T25 बोतल में अलग. हर फ्लास्क epidermis के 2-3 टुकड़े शामिल करना चाहिए. संस्कृति मीडिया FCS 15%, 1.1% सोडियम पाइरूवेट और 1% पेनिसिलिन Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) मध्यम 1640 में स्ट्रेप्टोमाइसिन / शामिल हैं.
  4. 37 में कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. उम्मीद है 1 fibroblasts epidermal नमूना से बाहर हो जाना जब तक प्रचार समय 1-2 सप्ताह है. यदि विकास की समस्याओं का सामना कर रहे हैं, तो आप fibroblast वृद्धि पिता का उपयोग कर सकते हैंctor (5-10 एनजी / FGF2 मिलीलीटर) कोशिकाओं के विकास को बढ़ाने के लिए.
  5. एक बार 50-70% की एक सेल confluency तक पहुँच जाता है, प्राथमिक मानव fibroblasts जमे हुए किया जा सकता है. confluency समय तक 50-70% तक पहुँच जाता है, सेल लाइनों के बीच अलग है. 90% FCS प्लस 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में fibroblasts रुक.

2. लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी के लिए मानव fibroblasts की तैयारी

सामान्य में, 10 के नीचे मानव fibroblasts के साथ प्रयोग मार्ग के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए senescence से जुड़े परिवर्तन के रूप में कई मार्ग के बाद कोशिकाओं के गुणों को बदल सकते हैं. संदेह के मामले में, बीटा galactosidase assays संबंधित कोशिकाओं में उम्र बढ़ने की प्रक्रिया का प्रेरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आम तौर पर, वृद्ध fibroblasts (ऊपर देखें) का उपयोग नहीं करते. इसके अलावा, कई सेल लाइनों की तुलना करने के लिए, प्रत्येक कोशिका लाइन के एक ही मार्ग संख्या के साथ काम करते हैं. विभिन्न आनुवंशिक समरूप स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में मरीजों की तुलना की सिफारिश की है. हालांकि, जैसा कि कभी - कभीविशिष्ट परिवर्तन ले रोगियों दुर्लभ हो, इसका मतलब यह नहीं कर सकते हैं कि केवल एक निश्चित मार्ग संख्या और अलग नियंत्रण रेखा के साथ एक रोगी से त्वचा बायोप्सी को शामिल किया जाना है - यहाँ यह सब शामिल लाइनों के एक ही मार्ग संख्या सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. यदि 50-70% की एक सेल confluency पहुंचे लेकिन कोई प्रयोग की योजना बनाई है, fibroblasts जमे हुए किया जाना चाहिए.

  1. प्रयोग के पहले दिन पर, संलग्न fibroblasts एक बार धो पीबीएस के साथ. कुप्पी नीचे से proteolytic एंजाइमों DNase (यानी Accumax) की एक सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग करके फिर उन्हें रिहा.
  2. एक coverglass 4 कक्ष (1.8 सेमी 2 प्रति संस्कृति के क्षेत्र में अच्छी तरह से) के प्रत्येक अच्छी तरह से में अपने कोशिकाओं और बीज 50,000-70,000 कोशिकाओं गिनो. तदनुसार, 8 कक्ष coverglas के लिए सेल नंबर या एक छोटे से कम के आधे से उपयुक्त है (0.8 सेमी 2 प्रति संस्कृति के क्षेत्र में अच्छी तरह से). यह बल्कि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या बीज वास्तविक एकल कोशिका विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है. मैं कक्षों के लिए कोई विशेष कोटिंगआवश्यक है.
  3. 24-48 घंटे के बाद, जीना सेल इमेजिंग प्रयोग किया जा सकता है. सुनिश्चित करें कि जीना सेल इमेजिंग खुर्दबीन एक मशीन है कि तापमान और सीओ 2 के स्तर को नियंत्रित के साथ सुसज्जित है. छवि अधिग्रहण के दौरान 37 के एक वातावरण डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 बनाए रखा जाना चाहिए.
  4. प्रत्येक जीना सेल इमेजिंग माप से कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों में बाहर किया जाना चाहिए. कुल में, सेल प्रति पंक्ति 50 कोशिकाओं के एक न्यूनतम imaged किया जाना चाहिए. जीना सेल इमेजिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रयोग बंद लाइन विश्लेषण अंधा निष्पक्ष डेटा संग्रह की गारंटी की शर्तों के तहत किया जाना है.

3. Mitochondrial समारोह के मापन मानव fibroblasts में रहने वाले

Mitochondrial समारोह के mitochondrial झिल्ली (एमएमपी) संभावित निर्भर रंगों के माध्यम से परंपरागत माप के लिए, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) प्राथमिक तरीका है. मानव fibroblasts के मामले में, सेलुलर autofluorescence अक्सर मनाया जाता है और वास्तविक धुंधला हो जाना संकेत के साथ हस्तक्षेप से झूठी सकारात्मक परिणाम का कारण हो सकता है. Autofluorescence आम तौर पर उच्च fibroblasts के पारित होने की संख्या के साथ और अधिक स्पष्ट हो जाता है. इसलिए, हम जीना सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा मानव fibroblasts की mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए पसंद करते हैं.

  1. बोने के बाद 24-48 घंटा, एमएमपी निर्भर डाई RPMI मध्यम में tetramethylrodamine एथिल एस्टर (TMRE) 50 एनएम fibroblasts सेते हैं. यह RPMI मध्यम phenol लाल की कमी के रूप में यह नकारात्मक छवि गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं करना चाहिए. Hoechst धुंधला हो जाना 1.6 सुक्ष्ममापी करने के नाभिक कल्पना करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
  2. तैयार धुंधला हो जाना प्रकाश से 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रक्षा समाधान में कोशिकाओं सेते हैं.
  3. RPMI मध्यम (phenol लाल के बिना) के साथ धुंधला हो समाधान बदलें. एक धोने कदम और तुरंत छवि कोशिकाओं के बिना आगे बढ़ें. 63x बढ़ाई और लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (वैकल्पिक रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर का उपयोग करेंApotome तकनीक) कोशिकाओं की परतों को परिभाषित करने के लिए. 37 लागू डिग्री सेल्सियस और 5% इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को सीओ 2.
  4. जब fibroblasts इमेजिंग, TMRE धुंधला हो जाना कर सकते हैं जल्दी बाहर ब्लीच फ्लोरोसेंट रोशनी के जोखिम समय लागू करने के लिए अधिक से अधिक ध्यान देना. 200 और 300 MS के बीच अपने उपयुक्त जोखिम समय को परिभाषित करने और इस अंतराल से अधिक नहीं है. मानकीकृत सेटिंग्स के तहत छवि अधिग्रहण बहुत महत्वपूर्ण है, के रूप में एक तीव्रता के आधार पर तुलना करने में असमर्थ हो सकता है अगर सेटिंग सेल लाइनों के बीच अलग कर रहे हैं.
  5. Imaged कोशिकाओं के आसपास एक परिभाषित त्रिज्या के रूप में प्रदर्शन के बाद प्रकाश प्रक्षालित है, photobleached अनुभाग से पर्याप्त रूप से दूर रखने के अगले दृश्य क्षेत्र.
  6. ऑफ लाइन विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, संयुक्त राज्य अमरीका वेन Rasband) का उपयोग किया जाता है.
  7. ब्याज की एक चयन उपकरण का उपयोग करके अपने सेल का चयन करें.
  8. 8-bit छवि बदलें (<प्रकार छवि <8 बिट).
  9. Unspecific शोर ख कमy "डेस्पेकल" समारोह (प्रक्रिया <शोर despeckle <) का उपयोग करते हुए.
  10. हालत (छवि <लुकअप टेबल्स <आग) - "आग देखने सारणी" चुनें.
  11. दहलीज समारोह में "ओवर / के तहत" समारोह के लिए स्विच और सीमा समायोजित (छवि <समायोजित <थ्रेसहोल्ड).
  12. "कणों का विश्लेषण" विकल्प का चयन करें, जो आप प्रत्येक mitochondrial detectable कण (विश्लेषण <कण विश्लेषण) के लिए मतलब ग्रे मूल्य देना होगा. एक एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में दिए गए परिणाम सूची सहेजें.
  13. एक्सेल प्रोग्राम में खोलें परिणाम फ़ाइल और mitochondrial संरचनाओं का मतलब ग्रे मूल्य के औसत की गणना (दिया एक्सेल परिणाम सूची में 'मतलब' के रूप में संकेत दिया).
  14. एक सतह साजिश बनाने के लिए, प्लगइन "3 डी" प्लगइन अनुभाग में "3 डी इंटरएक्टिव सतह साजिश" का चयन करें. यहाँ, आप विभिन्न विकल्पों का उपयोग कर प्रदर्शन साजिश समायोजित कर सकते हैं. "स्पेक्ट्रम LUT" "मूल रंग को बदलना उचित साजिश के लिए तीव्रता पैमाने बार देता है.
  15. वैकल्पिक रूप सेजीना सेल इमेजिंग, एमएमपी स्वतंत्र डाई Mitotracker ग्रीन एफएम का एक संयोजन और एमएमपी निर्भर डाई Mitotracker मुख्यमंत्री एच 2 XRos इस्तेमाल किया जा सकता है के माध्यम से मानव fibroblasts की mitochondrial समारोह का विश्लेषण करने के लिए TMRE का उपयोग करने के लिए. फिर, मानव fibroblasts के लिए रहते सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी पसंद किया जाता है, लेकिन सामान्य तौर पर इस विकल्प को भी 12 कोशिकाओं के अन्य प्रकार में FACS विश्लेषण का उपयोग कर इस्तेमाल किया गया है. "मानव fibroblasts में रहने वाले colocalization mitochondrio lysosomal मापन" जब इस वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए मानव fibroblasts में mitochondrial समारोह, प्रोटोकॉल धारा 5 के 3-7 कदम उपाय लागू किया जाना चाहिए. सिवा, दोनों और Mitotracker ग्रीन एफएम और Mitotracker मुख्यमंत्री एच 2 XRos के लिए mitochondria सकारात्मक संकेतों के से, उपरिशायी गणना है और कार्यात्मक सभी mitochondria वर्तमान में अनुपात के रूप में mitochondria की मात्रा इंगित करता है.

4. Mitochondrial आकृति विज्ञान मानव fibroblasts में रहने वाले मापन

  1. 24-48बोने के बाद घंटा, 200 एनएम RPMI मध्यम में Mitotracker ग्रीन एफएम (कोई phenol लाल) में सेते कोशिकाओं प्रकाश से 15 मिनट के लिए 37 में संरक्षित डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. Hoechst धुंधला हो जाना 1.6 सुक्ष्ममापी करने के नाभिक को उजागर करने के लिए किया जाना चाहिए. Mitotracker ग्रीन एफएम एक एमएमपी स्वतंत्र डाई, दाग जो सभी mitochondrial संरचनाओं मौजूद है.
  2. धीरे कोशिकाओं को एक बार धो पीबीएस के साथ.
  3. कोशिकाओं और तुरंत छवि कोशिकाओं को ताजा RPMI मध्यम (phenol लाल के बिना) जोड़ें. 63x बढ़ाई और लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी तकनीक (वैकल्पिक रूप से प्रतिदीप्ति Apotome तकनीक का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी) का उपयोग कोशिकाओं की परतों को परिभाषित करने के लिए.
  4. ऑफ लाइन विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर के उपयोग के द्वारा लिया जाता है.
  5. ब्याज की एक चयन उपकरण का उपयोग करके अपने सेल का चयन करें.
  6. 8-bit छवि बदलें (<प्रकार छवि <8 बिट).
  7. (प्रोसेस <despeckle शोर) "डेस्पेकल" समारोह का उपयोग करके unspecific शोर को कम.
  8. कनवल्शनफ़िल्टर्स फिल्टर का उपयोग करने के लिए mitochon पर प्रकाश डालाdrial संरचनाओं (<फ़िल्टर <convolve प्रक्रिया).
  9. सीमा संकेत करने वाली शोर अनुपात इतना है कि उपयुक्त है समायोजित (छवि <समायोजित <थ्रेसहोल्ड).
  10. "कणों का विश्लेषण" विकल्प का उपयोग करके, mitochondrial संरचनाओं के स्वत: पहचान एक चुना पिक्सेल के आकार के आधार पर शुरू की है (विश्लेषण <कण विश्लेषण). कई mitochondrial मापदंडों बाद क्षेत्र, परिधि, छोटे और बड़े कुल्हाड़ियों या घेरा के रूप में गणना कर रहे हैं. इन मापों व्यक्तिगत रूप से सेट किया जा सकता है (<सेट माप विश्लेषण). एक एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में दिए गए परिणाम सूची सहेजें.
  11. एक्सेल प्रोग्राम में परिणाम फ़ाइल खोलें. इस तरह के मापदंडों के उपयोग के साथ, mitochondrial morphology के विश्लेषण किया जा सकता है. यह फार्म एक mitochondrial नेटवर्क की शाखाओं में बंटी की डिग्री का संकेत कारक की परिभाषा में शामिल [सूत्र: (2 परिधि) / (4 * PI () क्षेत्र *)] के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पहलू अनुपात mitochondria (सूत्र की लंबाई को परिभाषित: प्रमुख axes छोटे / axes).

5. मानव fibroblasts में रहने वाले Mitochondrio lysosomal colocalization के मापन

  1. 24-48 घंटा बोने के बाद, 200 एनएम Mitotracker ग्रीन एफएम में सेते कोशिकाओं 100 एनएम Lyostracker लाल DND-99 RPMI (phenol लाल के बिना) मध्यम प्रकाश से 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रक्षा में. Hoechst धुंधला हो जाना 1.6 सुक्ष्ममापी करने के नाभिक को उजागर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. ताजा RMPI मध्यम (phenol लाल के बिना) 100 एनएम Lyostracker DND-99 Red युक्त मध्यम बदलें. इस डाई करने के लिए पूरे इमेजिंग सत्र के दौरान उपस्थित हो गया है. ऊष्मायन अवधि के बाद धो कोशिकाओं मत करो. तुरंत कोशिकाओं छवि. 63x बढ़ाई और confocal तकनीक (वैकल्पिक रूप Apotome तकनीक) का उपयोग कोशिकाओं की परतों को परिभाषित करने के लिए.
  3. ऑफ लाइन विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर के उपयोग के द्वारा लिया जाता है.
  4. दो संबंधित छवियों खोलें आप colocalization की स्थिति के संदर्भ में विश्लेषण करना चाहते हैं.
  5. 8-bit छवि बदलें (<प्रकार छवि <8 बिट). दोनों छवियों में despeckle "समारोह (प्रोसेस <शोर despeckle <) का उपयोग करके unspecific शोर को कम.
  6. चुनें प्लगइन colocalization विश्लेषण उपकरण के रूप में "JACoP, जो आपको देता संबंधित चैनल के लिए मूल्यों और Pearson गुणांक गणना गुणांक ओवरलैप और Manders गुणांक (प्लगिन्स <JACoP).

6. प्रतिनिधि परिणाम

मानव fibroblasts में रहने वाले mitochondrial समारोह जीना सेल इमेजिंग तकनीक के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है. कार्यात्मक assays के लिए, TMRE प्रतिदीप्ति संकेत mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी) के साथ संबद्ध है. सामान्य एमएमपी शर्तों के तहत, TMRE प्रतिदीप्ति रोग एक कम एमएमपी (चित्रा 1 ए, कम पंक्ति) द्वारा विशेषता शर्तों के तहत की तुलना में काफी अधिक है (चित्रा 1 ए, ऊपरी पंक्ति). इस प्रतिदीप्ति तीव्रता हर mitochondrial संरचना का मतलब ग्रे मूल्य के औसत की गणना के द्वारा मापा जाता है ( (चित्रा 1 ए, सही पक्ष) के चित्रण के लिए विकल्प "इंटरेक्टिव सतह साजिश" के उपयोग की अनुमति देता है.

मानव fibroblasts में mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए अगले, जीना सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी mitochondrial morphology के विभिन्न मापदंडों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ग्रीन एफएम डाई mitochondrial संरचनाओं Mitotracker का उपयोग करके उनके संबंधित एमएमपी (2 चित्रा) के स्वतंत्र कल्पना कर रहे हैं. यह सभी mitochondrial विश्लेषण में मौजूद ढांचे के शामिल किए जाने को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग, morphology द्विआधारी आंकड़े के आधार पर विश्लेषण किया जाता है, के रूप में ही यहाँ mitochondrial morphology मानकों (2 चित्रा, "बाइनरी") का मूल्यांकन किया जा सकता है. पहलू अनुपात के फार्म के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कारक के रूप में mitochondrial morphology विश्लेषण के लिए उदाहरण हाल ही में प्रकाशित किए गए थे 1 6,3. एक अन्य महत्वपूर्ण विशेषता है कि मानव fibroblasts में रहने वाले मापा जा सकता है mitochondrial संरचनाओं की गिरावट है. इस प्रगति में पहला कदम जीना सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी colocalization mitochondrio lysosomal द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. कुछ रोग lysosomes (चित्रा 3A) के साथ mitochondria का एक बढ़ा colocalization में परिणाम की शर्तें. फिर, Mitotracker ग्रीन एफएम mitochondrial उनके संबंधित एमएमपी के स्वतंत्र संरचनाओं दाग के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, Lysotracker DND-99 लाल के साथ धुंधला lysosomal संरचनाओं visualizing की अनुमति देता है. यह महत्वपूर्ण है कि Lysotracker लाल रंग इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान मौजूद है, के रूप में धोने कदम संकेत है कि दृश्य के लिए बहुत कम हो जाता है कम है. Colocalization हरे (Mitotracker ग्रीन एफएम) और लाल (Lysotracker लाल DND 99) धुंधला हो जाना (सफेद तीर, चित्रा 3A) ओवरलैप के कारण स्पष्ट पीले प्रतिदीप्ति संकेतों द्वारा प्रतिनिधित्व किया है और Pearson coe के हिसाब से निर्धारित कर रहे हैंfficient (3B चित्रा).

सामान्य में, ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ बंद लाइन के विश्लेषण के लिए, यह मददगार है छवि प्रति एक सेल कल्पना, इतना है कि ब्याज की एक विशेष क्षेत्र (आरओआई) की परिभाषा से बचा जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 TMRE प्रतिदीप्ति जीना सेल इमेजिंग तकनीक से मानव fibroblasts में रहने वाले mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी) का संकेत संकेत के मापन. (ए) TMRE एक फ्लोरोसेंट रंजक एमएमपी निर्भर करता है, जिसका प्रतिदीप्ति तीव्रता एमएमपी के साथ इसे संबद्ध है. Hoechst डाई दाग नाभिक (नीला) के लिए इस्तेमाल किया गया था. सामान्य एमएमपी शर्तों के तहत (ऊपरी पंक्ति), TMRE प्रतिदीप्ति रोग एक कम एमएमपी (कम पंक्ति) द्वारा विशेषता शर्तों के तहत की तुलना में काफी अधिक है. प्रतिदीप्ति तीव्रता अतिरिक्त दिखाया हैतीव्रता सतह साजिश के रूप में. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी इंगित करता है. (बी) अनुकरणीय fibroblasts के सांख्यिकीय विश्लेषण (ए) में दिखाया गया है. रोग की स्थिति के तहत, एक कम mitochondria की TMRE प्रतिदीप्ति सामान्य एमएमपी हालत की तुलना में मापा जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 जीना सेल इमेजिंग तकनीक से मानव fibroblasts में रहने वाले mitochondrial morphology के मापन. Mitotracker ग्रीन एफएम (हरा) mitochondrial संरचनाओं कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, के लिए है कि यह मिशन मोड परियोजना के स्वतंत्र है. Hoechst डाई दाग नाभिक (नीला) के लिए इस्तेमाल किया गया था. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग, morphology द्विआधारी आंकड़े पर विश्लेषण किया जा सकता है. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी इंगित करता है. क्लिक करें यहाँ बड़ा आंकड़ा देखने के लिए.

चित्रा 3
चित्रा 3 जीना सेल इमेजिंग तकनीक के द्वारा मानव fibroblasts में रहने वाले lysosomes साथ mitochondria की colocalization के मापन. (ए) Mitotracker ग्रीन एफएम (हरा) mitochondrial संरचनाओं दाग के लिए प्रयोग किया जाता है, Lyostracker DND-99 रेड (लाल) lysosomal संरचनाओं visualizes. Hoechst डाई दाग नाभिक (नीला) के लिए इस्तेमाल किया गया था. रोग की शर्तों के तहत सफल colocalization एक पीले रंग के लिए Lysotracker लाल और Mitotracker ग्रीन धुंधला हो जाना (सफेद तीर) के ओवरलैप के कारण संकेत द्वारा संकेत दिया है. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी इंगित करता है. (बी) अनुकरणीय fibroblasts के सांख्यिकीय विश्लेषण (ए) में दिखाया गया है. Mitochondrio lysosomal एक ऊंचा Pearson गुणांक मूल्य में colocalization परिणामों के एक उच्च डिग्री./ 4228/4228fig3large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पूर्व vivo मॉडल के रूप में रोगी त्वचा fibroblasts रोग जुड़े आनुवंशिक दोष विशेषताएँ एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, त्वचा व्युत्पन्न fibroblasts आसानी से सुलभ हैं और संवर्धन पर विस्तार किया जा सकता है. इसलिए, प्राथमिक पी.डी. जुड़े आनुवंशिक परिवर्तन को लेकर रोगियों से प्राप्त कोशिकाओं ट्यूमर सेल लाइनों के उपयोग पर बेहतर कर रहे हैं के रूप में वे न केवल अंतर्जात जीन रोग के कारण, लेकिन प्रभावित व्यक्ति के पूरे आनुवंशिक पृष्ठभूमि के होते हैं. इसके अलावा, fibroblasts neurodegeneration दौरान mitochondrial रोग की महत्वपूर्ण रोग सुविधाओं को प्रतिबिंबित करने के लिए दिखाया गया है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों समारोह, आकृति विज्ञान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीना सेल इमेजिंग तकनीक के माध्यम lysosomes साथ mitochondria की colocalization का आकलन सहित mitochondrial phenotypes का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं. सिवा, रोग का मुख्य पहचान, अर्थात् mitochondrial रोग और बाद degradइन गैर कार्यात्मक ओर्गानेल्स समझना, और visualized किया जा सकता है 6 ठीक से विश्लेषण किया है, 13. Mitochondrial समारोह और आकारिकी बदलाव अक्सर रोग विकृति का एक पहला कदम हैं. उदाहरण के लिए वृद्धि हुई है, mitochondrial नेटवर्क के विखंडन बढ़ाया autophagic और mitophagic 6,12 प्रक्रियाओं की एक शर्त के किया जा सकता है. इसलिए, lysosomes साथ mitochondria की colocalization mitochondrial गिरावट (mitophagy) 6 का आकलन करने के लिए मदद मिल सकती है. इस colocalization की कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lysosomes साथ mitochondria की एक संचय lysosomal गिरावट मार्ग में दोष को प्रतिबिंबित और modulating autophagic 6 प्रवाह के द्वारा मान्य किया जा सकता है. इस संदर्भ में, ImageJ सॉफ्टवेयर आधा स्वचालित गैर पक्षपाती कार्यों का विश्लेषण द्वारा मान्य डेटा सेट उत्पन्न करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.

एक अतिरिक्त विकल्प है कि अधिक रोग से संबंधित मॉडल के लिए मानव fibroblasts के उपयोग का विस्तार संभावित generat हैआयन प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (आईपीएस), जो अलग सेल प्रकार है कि रोग का मुख्य लक्ष्य 14 प्रक्रिया में भेदभाव किया जा सकता है. पार्किंसंस रोग के मामले में, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में fibroblasts के भेदभाव इस सेलुलर मॉडल इस neurodegenerative 15,16 विकार में भविष्य के अनुसंधान के लिए एक आशाजनक उपकरण बनाता है. महत्वपूर्ण बात है, यहाँ प्रोटोकॉल में वर्णित assays के सभी आसानी से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के भीतर mitochondrial परिवर्तन की जांच करने के लिए किया जा सकता है प्रयोगात्मक setups में अनुवाद. बेशक, और भी अधिक न्यूरॉन विशेष जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों भी लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम फ्रिट्ज Thyssen फाउंडेशन (10.11.2.153 आर), जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG, KR2119/3-2 और KR2119/8-1 आर), शिक्षा के लिए संघीय मंत्रालय और अनुसंधान (BMBF से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया NGFNplus, 01GS08134 आर) और धर्मार्थ Hertie फाउंडेशन से एक डॉक्टरेट [LFB] छात्रवृत्ति द्वारा. हम वीडियो शूटिंग के दौरान उनके समर्थन के लिए Carolin OBERMAIER और जूलिया Westermeier धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red Invitrogen 11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
AccuMax (detachment solution) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Green FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
H–chst 33342 Invitrogen H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.

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References

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