L'utilisation de fibroblastes humains primaires pour la surveillance des phénotypes mitochondriales dans le domaine de la maladie de Parkinson

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Summary

Les fibroblastes de patients porteurs de mutations dans la maladie de Parkinson pathogènes gènes représentent une forme accessible facilement

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Burbulla, L. F., Krüger, R. The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (68), e4228, doi:10.3791/4228 (2012).

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Abstract

La maladie de Parkinson (MP) est le trouble du mouvement le plus fréquent et touche 1% de la population âgée de plus de 60 1. Parce que le vieillissement est le facteur de risque le plus important, les cas de PD augmentera au cours des prochaines décennies 2. A côté de repliement des protéines pathologiques et dépréciés voies de dégradation des protéines, des altérations de la fonction mitochondriale et la morphologie ont été signalées comme caractéristique supplémentaire de la neurodégénérescence dans la MP 3-11.

Après des années de recherche dans les cellules cancéreuses murines et humaines comme dans les modèles in vitro pour disséquer les voies moléculaires de Parkinson, l'utilisation de fibroblastes humains provenant de patients et les contrôles appropriés que les modèles ex vivo est devenu un outil de recherche précieux, si mises en garde potentiels sont pris en compte. Autre que immortalisées, des modèles cellulaires plutôt artificielles, des fibroblastes primaires de patients porteurs de mutations associées à la maladie reflètent apparemment importantes caractéristiques pathologiques of la maladie humaine.

Ici, nous délimiter la procédure de prise de biopsies de la peau, les fibroblastes humains en culture et l'utilisation de protocoles détaillés pour des techniques de microscopie essentielles pour définir des phénotypes mitochondriales. Ceux-ci ont été utilisés pour étudier les différentes caractéristiques associés à la MP qui sont pertinents pour la fonction mitochondriale et dynamique. Ex vivo, les mitochondries peuvent être analysés en termes de leur fonction, la morphologie, la colocalisation avec les lysosomes (les organites dégradants dysfonction mitochondriale) et la dégradation via la voie lysosomale . Ces phénotypes sont très pertinents pour l'identification des signes précoces de maladie de Parkinson et peuvent précéder les symptômes moteurs cliniques dans la maladie de l'homme et les gènes transporteurs. Par conséquent, les analyses présentées ici peuvent être utilisés comme des outils précieux pour identifier les caractéristiques pathologiques de la neurodégénérescence et de contribuer à définir de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la maladie de Parkinson.

Protocol

1. La biopsie de peau et culture des fibroblastes humains

  1. La biopsie cutanée doit être prise par un médecin expérimenté. La procédure se déroule dans des conditions stériles et nécessite une anesthésie locale. Des sites typiques utilisés pour la biopsie sont la face interne du bras, l'épaule ou le bas du dos.
  2. Vous pouvez prendre des échantillons de diamètre 4x4mm 6x6mm ou par biopsie pour obtenir assez de tissu pour les fibroblastes humains en culture.
  3. Couper la biopsie de peau en petits morceaux égaux dans des conditions stériles de les séparer en 2-4 T25 flacons. Chaque flacon doit contenir 2-3 morceaux de l'épiderme. Le milieu de culture contient 15% de FCS, le pyruvate de sodium 1,1% et 1% de pénicilline / streptomycine à Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
  4. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. Le temps de propagation attendue avant fibroblastes première se développer hors de l'échantillon épidermique est de 1-2 semaines. Si des problèmes de croissance sont rencontrés, vous pouvez faire usage de fa croissance des fibroblastesctor (5-10 ng / ml de FGF2) pour favoriser la croissance des cellules.
  5. Une fois une confluence cellulaire de 50-70% est atteint, les fibroblastes primaires humains peuvent être congelés. Le temps jusqu'à 50-70% de confluence est atteinte, se distingue parmi les lignées cellulaires. Geler les fibroblastes dans 90% de SVF, plus de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO).

2. Préparation des fibroblastes humains pour la microscopie cellulaire Imagerie en direct

En général, les expériences avec des fibroblastes humains doivent être effectuées avec des passages en dessous de 10 en sénescence associés altérations peuvent modifier les propriétés des cellules après de multiples passages. En cas de doute, la bêta-galactosidase dosages peuvent être utilisés pour évaluer l'induction des processus de vieillissement dans les cellules respectives. En règle générale, ne pas utiliser fibroblastes âgés (voir ci-dessus). Par ailleurs, de comparer plusieurs lignées cellulaires, travailler avec le nombre même passage de chaque lignée cellulaire. Comparaison de différents patients génétiquement homogènes par rapport aux témoins sains est recommandé. Cependant, comme c'est parfoispatients porteurs de mutations spécifiques peuvent être rares, cela peut signifier que des biopsies de peau provenant d'un seul patient avec un nombre certain passage et les lignes de commande différents doivent être inclus - ici il est essentiel de s'assurer que le nombre même passage de toutes les lignes comprises. Si une confluence cellulaire de 50-70% est atteint, mais aucune expérience prévue, les fibroblastes doivent être gelés.

  1. Le premier jour de l'expérience, se laver les fibroblastes attachés fois avec du PBS. Puis les libérer de la ballon à fond en utilisant une solution de détachement cellulaire des enzymes protéolytiques DNase (c.-à AccuMax).
  2. Comptez vos cellules et de semences 50,000-70,000 cellules dans chaque puits d'une lamelle 4-chambre (1,8 cm 2 zones de culture par puits). En conséquence, pour les coverglas 8-chambre, la moitié du nombre de cellules ou d'un peu moins est approprié (0,8 cm 2 surface de culture par puits). Il est important de graines plutôt un petit nombre de cellules pour effectuer véritable analyse unicellulaire. Pas de revêtement spécifique pour les chambres à is nécessaire.
  3. Après 24-48 heures, l'expérience d'imagerie de cellules vivantes peuvent être effectuées. Faire en sorte que le microscope d'imagerie de cellules vivantes est équipé d'un incubateur qui contrôle la température et de niveaux de CO 2. Lors de l'acquisition d'image, une atmosphère de 37 ° C et 5% de CO 2 devrait être maintenu.
  4. Chaque cellule de mesure en direct imagerie doit être effectuée au moins trois expériences indépendantes. Au total, un minimum de 50 cellules par lignée cellulaire doit être imagé. Les expériences d'imagerie des cellules vivantes ainsi que les analyses hors ligne doivent être effectuées dans des conditions aveuglés pour garantir la collecte des données non biaisées.

3. Mesure de la fonction mitochondriale dans Vivre fibroblastes humains

Pour la mesure conventionnelle de la fonction mitochondriale via potentiel de membrane mitochondriale (MMP)-dépendantes colorants, fluorescent tri cellulaire (FACS) est la principale méthode. Dans le cas de fibroblastes humains, cellulaire autofluorescence est fréquemment observé et peut entraîner des résultats faussement positifs par interférence avec le signal de coloration réelle. Autofluorescence devient généralement plus prononcé avec des numéros de passage plus élevés de fibroblastes. Par conséquent, nous préférons évaluer la fonction mitochondriale des fibroblastes humains par microscopie cellulaire imagerie en temps réel.

  1. 24-48 h après l'ensemencement, incuber les fibroblastes dans 50 nM de la MMP-dépendante colorant tetramethylrodamine éthyle (TMRE) dans du milieu RPMI. Ce milieu RPMI devrait manquent de rouge de phénol, car cela peut nuire à la qualité d'image. 1,6 M de coloration de Hoechst doit être ajouté à visualiser les noyaux.
  2. Incuber les cellules dans une solution de coloration préparé abri de la lumière pendant 15 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
  3. Remplacer la solution de coloration avec du milieu RPMI (sans rouge de phénol). Procéder sans étape de lavage et les cellules d'image immédiatement. Utilisez un grossissement 63x et technique de microscopie confocale à balayage laser (microscopie à fluorescence en utilisant alternativementApoTome technique) pour définir une seule couche de cellules. Appliquer 37 ° C et 5% de CO 2 dans les cellules au cours du processus d'imagerie.
  4. Quand l'imagerie des fibroblastes, une attention maximale à la durée d'exposition appliquée de lumière fluorescente que la coloration TMRE peut blanchir rapidement. Définissez votre temps d'exposition approprié entre 200 et 300 ms et ne pas dépasser cet intervalle. L'acquisition des images dans les paramètres standards est très important, comme on serait incapable de faire des comparaisons basées sur l'intensité si les paramètres sont différents entre les lignées cellulaires.
  5. Comme un rayon défini autour des cellules imagées est blanchie après exposition à la lumière, garder le champ visuel de façon adéquate à côté de la section de mesure photobleached.
  6. Off-line analyses sont effectuées à l'aide du logiciel ImageJ (Wayne Rasband; National Institutes of Health, USA).
  7. Sélectionnez votre cellule d'intérêt en utilisant un outil de sélection.
  8. Convertir l'image en 8 bits (<Image <Type 8-bit).
  9. Réduire le bruit b imprécisy en utilisant le mode "Dépoussiérer" fonction (Process <sonore <Dépoussiérer).
  10. Choisissez le menu "Tables de recherche - Fire" état (Image <tables de correspondance incendie <).
  11. Mettez dans la fonction de seuil à la «Over / Under" et régler la fonction de seuil (Image <Réglez <Seuil).
  12. Sélectionnez l'option "analyser des particules" option, qui vous donnera la valeur de gris moyenne pour chaque particule détectable mitochondrial (<Analyser analyser des particules). Enregistrer la liste résultat donné comme feuille de calcul Excel.
  13. Ouvrir fichier résultat dans le programme Excel et calculer la moyenne de la valeur moyenne de gris des structures mitochondriales (indiqué comme «moyenne» dans la liste des résultats excel donnée).
  14. Pour créer un tracé de surface, choisissez le plugin "complot Interactive surface 3D" dans la section plugin "3D". Ici, vous pouvez aussi régler le graphe en utilisant les différentes options d'affichage. Modification des couleurs du document original "" à "spectre LUT» donne la barre d'échelle d'intensité de la parcelle appropriée.
  15. Sinonà l'aide TMRE pour analyser la fonction mitochondriale de fibroblastes humains par imagerie des cellules vivantes, une combinaison de la MMP-indépendant colorant vert Mitotracker FM et la MMP-dépendante Mitotracker colorant CM-H 2 Xros peuvent être utilisées. Encore une fois, pour les fibroblastes humains vivent microscopie imagerie cellulaire est préférable, mais en général, cette alternative a également été utilisé en utilisant une analyse FACS dans d'autres types de cellules 12. Lorsque vous utilisez cette approche visant à mesurer la fonction mitochondriale dans des fibroblastes humains, étape 3-7 du protocole de la section 5 "Mesure de mitochondrio-lysosomale colocalisation de vie des fibroblastes humains" doit être appliquée. Celui-ci, la superposition des signaux, à la fois du positif mitochondries pour Mitotracker Green FM et Mitotracker CM-H 2 Xros est calculé et indique la quantité de mitochondries fonctionnelles comme le rapport à toutes les personnes présentes mitochondries.

4. Mesure de la morphologie mitochondriale in Living fibroblastes humains

  1. 24-48h après l'ensemencement, les cellules incuber à 200 nM Mitotracker Green FM dans un milieu RPMI (sans rouge de phénol) abri de la lumière pendant 15 min à 37 ° C et 5% de CO 2. 1,6 M de coloration de Hoechst doit être utilisé pour mettre en évidence les noyaux. Mitotracker Green FM est un colorant MMP-indépendant, qui colore toutes les structures mitochondriales présenter.
  2. Lavez délicatement les cellules une fois avec du PBS.
  3. Ajouter fraîches milieu RPMI (sans rouge de phénol) dans les cellules et les cellules d'image immédiatement. Utilisez un grossissement 63x et technique de microscopie confocale à balayage laser (microscopie de fluorescence en utilisant une technique alternative Apotome) pour définir une seule couche de cellules.
  4. Off-line analyses sont prises par l'utilisation du logiciel ImageJ.
  5. Sélectionnez votre cellule d'intérêt en utilisant un outil de sélection.
  6. Convertir l'image en 8 bits (<Image <Type 8-bit).
  7. Réduire le bruit non spécifique en utilisant le mode "Dépoussiérer" fonction (Process <sonore <Dépoussiérer).
  8. Utilisez le filtre de convolution de mettre en évidence mitochondriesdrial structures (processus <Filtres <Convolve).
  9. Ajuster le seuil de telle sorte que le rapport signal-à-bruit est correct (image <réglage <Seuil).
  10. En utilisant le «analyser des particules" option, l'identification automatique des structures mitochondriales est initiée sur la base d'une taille de pixel choisi (<Analyser analyser des particules). Plusieurs paramètres mitochondriaux sont ensuite calculées comme la superficie, le périmètre, les axes mineurs et majeurs ou de circularité. Ces mesures peuvent être réglés individuellement (Analyser mesures Set <). Enregistrer la liste résultat donné comme feuille de calcul Excel.
  11. Ouvrez le fichier résultat dans le programme Excel. Avec l'utilisation de ces paramètres, les analyses de morphologie mitochondriale peut être réalisée. Cela comprend la définition du facteur de forme indiquant le degré de ramification d'un réseau mitochondrial [formule: (périmètre 2) / (4 * PI () * Zone)] ainsi que le rapport d'aspect de définir la longueur de la mitochondrie (formule: major axes / axes mineurs).

5. Mesure de Mitochondrio-lysosomale colocalisation dans Vivre fibroblastes humains

  1. 24-48 heures après l'ensemencement, les cellules incuber à 200 nM Mitotracker Green FM et 100 nM Lyostracker Rouge MDN-99 dans du milieu RPMI (sans rouge de phénol) abri de la lumière pendant 15 min à 37 ° C et 5% de CO 2. 1,6 uM de coloration de Hoechst est utilisé pour mettre en évidence les noyaux.
  2. Remplacez le support avec IPMB milieu frais (sans rouge de phénol) contenant 100 nM Lyostracker Rouge MDN-99. Ce colorant doit être présent lors de la séance d'imagerie. Ne pas laver les cellules après la période d'incubation. Immédiatement image des cellules. Utilisez un grossissement 63x et technique confocale (technique alternative Apotome) pour définir une seule couche de cellules.
  3. Off-line analyses sont prises par l'utilisation du logiciel ImageJ.
  4. Ouvrez les deux images respectives que vous souhaitez analyser en termes de statut colocalisation.
  5. Convertir l'image en 8 bits (<Image <Type 8-bit). Réduire le bruit non spécifique en utilisant le mode "Dépoussiérer" fonctionner dans les deux images (Process <sonore <Dépoussiérer).
  6. Choisissez le plugin "JACOP» comme outil d'analyse colocalisation, ce qui vous donne des valeurs pour les canaux respectifs et calcule le coefficient de Pearson, coefficient de recouvrement et le coefficient Manders (Plugins <JACOP).

6. Les résultats représentatifs

La fonction mitochondriale de vie des fibroblastes humains peuvent être évaluées par la technique d'imagerie cellulaire en direct. Pour les tests fonctionnels, le signal de fluorescence TMRE en corrélation avec le potentiel de membrane mitochondriale (MMP). Dans des conditions normales de MMP, la fluorescence TMRE est significativement plus élevé (figure 1A, rangée du haut) que dans des conditions pathologiques caractérisées par une réduction de MMP (figure 1A, rangée du bas). Cette intensité de fluorescence est mesurée en calculant la moyenne de la valeur de gris moyen de chaque structure mitochondriale ( (figure 1A, à droite).

A côté de l'évaluation de la fonction mitochondriale dans des fibroblastes humains, en direct microscopie imagerie cellulaire peut être utilisé pour définir les différents paramètres de la morphologie mitochondriale. En utilisant le Mitotracker Green FM structures colorant mitochondrial sont visualisés indépendamment de leur MMP respectif (figure 2). Ceci est important pour assurer l'inclusion de toutes les structures mitochondriales présentes dans les analyses. Utilisation du logiciel ImageJ, la morphologie est analysée sur la base des chiffres binaires, car seuls les paramètres de la morphologie ici mitochondriales peuvent être évaluées (Figure 2, "binaire"). Exemples d'analyses de morphologie mitochondriale en termes de facteur de forme ainsi que ratio d'aspect ont été récemment publiés 6, 13. Une autre caractéristique importante qui peut être mesuré dans la vie des fibroblastes humains est la dégradation des structures mitochondriales. La première étape de ce progrès peut être évalué par mitochondrio-lysosomale colocalisation cellulaire en microscopie imagerie en temps réel. Certains états pathologiques entraînent une augmentation des mitochondries colocalisation avec les lysosomes (figure 3A). Encore une fois, Mitotracker Green FM est utilisé pour colorer les structures mitochondriales indépendantes de leur MMP respectif. En outre, la coloration rouge avec Lysotracker MDN-99 permet de visualiser les structures lysosomales. Il est essentiel que le colorant rouge Lysotracker est présent pendant le processus d'imagerie, comme les étapes de lavage de réduire le signal devient trop faible pour la visualisation. La colocalisation est représentée par des signaux de fluorescence jaune clair en raison du chevauchement de la verte (Green FM Mitotracker) et rouge (Red Lysotracker MDN-99) coloration (flèches blanches, Figure 3A) et sont déterminés par le calcul du coe Pearsonfficient (figure 3B).

En général, pour des analyses hors ligne avec logiciel ImageJ, il est utile de visualiser une cellule par l'image, de sorte que la définition d'une région d'intérêt (ROI) peut être évitée.

Figure 1
Figure 1. Mesure du signal de fluorescence indiquant TMRE le potentiel de membrane mitochondriale (MMP) dans la salle de fibroblastes humains par la technique d'imagerie cellulaire en direct. (A) est un marqueur fluorescent TMRE MMP-dépendante colorant, dont la fluorescence d'intensité est corrélée avec la MMP. Colorant Hoechst a été utilisé pour colorer les noyaux (bleu). Dans des conditions normales de MMP (rangée du haut), la fluorescence TMRE est significativement plus élevé que dans des conditions pathologiques caractérisées par une réduction de MMP (rangée du bas). L'intensité de fluorescence est en outre montrécomme tracé de la surface intensité. La barre d'échelle indique 10 um. (B) Des analyses statistiques des fibroblastes exemplaires illustré en (A). Dans des conditions pathologiques, une fluorescence TMRE diminué des mitochondries est mesurée par rapport à la condition normale de MMP. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Mesure de la morphologie mitochondriale de vie des fibroblastes humains par la technique d'imagerie cellulaire en direct. Mitotracker Green FM (vert) est utilisé pour visualiser les structures mitochondriales, pour cela, il est indépendant de la MMP. Colorant Hoechst a été utilisé pour colorer les noyaux (bleu). Utilisation du logiciel ImageJ, la morphologie peut être analysé sur des chiffres binaires. La barre d'échelle indique 10 um. Cliquez sur ici pour agrandir la figure.

Figure 3
Figure 3. Mesure de la co-localisation des mitochondries avec les lysosomes du niveau de vie des fibroblastes humains par la technique d'imagerie cellulaire en direct. (A) Mitotracker Green FM (vert) est utilisé pour colorer les structures mitochondriales, Lyostracker Rouge MDN-99 (rouge) permet de visualiser les structures lysosomales. Colorant Hoechst a été utilisé pour colorer les noyaux (bleu). Colocalisation avec succès dans des conditions pathologiques est indiquée par un signal jaune en raison du chevauchement de Red Lysotracker et coloration vert Mitotracker (flèches blanches). La barre d'échelle indique 10 um. (B) Des analyses statistiques des fibroblastes exemplaires illustré en (A). Un degré plus élevé de résultats de colocalisation mitochondrio-lysosomales dans une valeur coefficient de Pearson élevée./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

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Discussion

Fibroblastes de peau de patients comme des modèles ex vivo représentent un outil important pour caractériser les maladies associées à des anomalies génétiques. En outre, la peau dérivés de fibroblastes sont facilement accessibles et peuvent être développées en culture. Par conséquent, les cellules primaires obtenues à partir de patients porteurs de mutations associées à PD génétiques sont préférables à l'utilisation de lignées cellulaires tumorales, car ils contiennent non seulement endogène gène pathologique, mais tout le fond génétique de l'individu concerné. En outre, les fibroblastes ont été montré pour refléter importantes caractéristiques pathologiques de la dysfonction mitochondriale au cours de la neurodégénérescence. Les expériences décrites dans ce protocole sont particulièrement utiles pour l'étude des phénotypes y compris la fonction mitochondriale, la morphologie ainsi que l'évaluation de colocalisation des mitochondries avec les lysosomes via la technique d'imagerie cellulaire en direct. Celui-ci, caractéristiques principales de la maladie, à savoir la dysfonction mitochondriale et dégradants ultérieuretion de ces organites non fonctionnels, peuvent être visualisées et analysées correctement 6, 13. Des altérations de la fonction mitochondriale et la morphologie sont souvent une première étape de la pathologie. Par exemple, l'augmentation de la fragmentation du réseau mitochondrial peut être une condition sine qua non de l'amélioration des processus et autophagiques mitophagic 6,12. Par conséquent, la co-localisation des mitochondries avec les lysosomes peut aider à évaluer la dégradation de l'ADN mitochondrial (mitophagy) 6. Un manque de cette colocalisation ainsi que l'accumulation de mitochondries avec les lysosomes pourrait refléter les défauts de la voie de dégradation lysosomale et doit être validé par le flux autophagique modulant 6. Dans ce contexte, ImageJ logiciel constitue un outil important pour générer des ensembles de données validées par demi-automatiques de non-biaisées fonctions d'analyse.

Une option supplémentaire qui étend l'utilisation de fibroblastes humains à plus de maladies liées à des modèles est le potentiel génération des cellules souches pluripotentes induites (iPS), qui peuvent être différenciées en des types cellulaires distincts qui sont la cible principale de la maladie de processus 14. Dans le cas de la maladie de Parkinson, la différenciation des fibroblastes en neurones dopaminergiques rend ce modèle cellulaire un outil prometteur pour la recherche future dans ce trouble neurodégénératif 15,16. Surtout, tous les essais décrits dans le protocole ici peuvent être facilement convertis en montages expérimentaux pour l'étude des altérations mitochondriales dans les neurones dopaminergiques. Bien sûr, encore plus spécifiques des neurones vivants des expériences d'imagerie cellulaire peut être appliqué aussi.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Fritz Thyssen (10.11.2.153 à RK), le Conseil de recherches en allemand (DFG, KR2119/3-2 et KR2119/8-1 à RK), le ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 à RK) et par une bourse doctorale de la Fondation de bienfaisance Hertie [au LFB]. Nous remercions Carolin Obermaier et Julia Westermeier pour leur soutien pendant le tournage du clip.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red Invitrogen 11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
AccuMax (detachment solution) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Green FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
H–chst 33342 Invitrogen H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.

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References

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