Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir temsil

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Burbulla, L. F., Krüger, R. The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (68), e4228, doi:10.3791/4228 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Parkinson hastalığı (PH) en sık görülen ikinci hareket bozukluğudur ve 60 1 yaşın üzerindeki insanların% 1 etkiler. Yaşlanma en önemli risk faktörü olduğundan, PD vakaları önümüzdeki yıllarda 2 sırasında artacaktır. Patolojik protein katlanması ve yetersiz protein parçalanma yolları yanında, mitokondriyal fonksiyon ve morfolojisi değişiklikler PD 3-11 nörodejenerasyon daha ayırt edici niteliği olarak işaret edilmiştir.

Parkinsonizm moleküler yolaklar incelemek için in vitro modellerde olduğu gibi fare ve insan kanser hücrelerinde araştırma yıl sonra, ex vivo modelleri olarak hasta ve uygun kontrollerin insan fibroblastlar kullanım potansiyeli uyarılar olarak kabul edilir ise, değerli bir araştırma aracı haline gelmiştir. Ölümsüzleştirdiği, oldukça yapay hücre modelleri dışında, hastalıkla ilişkili mutasyonları taşıyan hastaların primer fibroblast görünüşte önemli patolojik özellikler o yansıtacakf insan hastalığı.

Burada, cilt biyopsi alınarak kültür insan fibroblastlar ve mitokondriyal fenotipleri tanımlamak için gerekli mikroskobik teknikler ayrıntılı protokolleri kullanarak prosedürü tasvir. Bunlar mitokondriyal fonksiyon ve dinamikleri ile ilgili olan PD ile ilişkili farklı özelliklerini incelemek amacıyla kullanılmıştır. Ex vivo, mitokondri lizozom yolağı yoluyla fonksiyonu, morfolojisi, lizozomlar (organeller aşağılayıcı işlevsiz mitokondri) ve bozulması ile ko açısından analiz edilebilir . Bunlar fenotipleri PD erken belirtileri belirlenmesi için son derece önemli olan ve insan hastalığı-gen taşıyıcılarında klinik motor semptomlar öncesinde olabilir. Dolayısıyla, burada sunulan testlerin nörodejenerasyon patolojik özelliklerini belirlemek ve PD yeni tedavi stratejileri tanımlamak için yardımcı olacak değerli bir araç olarak kullanılabilir.

Protocol

1. Cilt Biyopsi ve İnsan Fibroblast ekimi

  1. Deri biyopsisi deneyimli bir hekim tarafından alınmalıdır. Prosedür steril koşullar altında yer alır ve lokal anestezi gerektirir. Biyopsi için kullanılan tipik siteleri üst kol, omuz veya bel iç tarafı vardır.
  2. Siz kültür insan fibroblastlar için yeterli doku almak için punch biyopsi ile 4x4mm veya 6x6mm çaplı numune alabilir.
  3. Cilt 2-4 T25 matara onları ayırmak için steril koşullar altında eşit küçük parçalara biyopsisi kesin. Her şişenin Epidermisin 2-3 adet içermelidir. Kültür ortamı% 15 FCS,% 1.1 sodyum piruvat ve% 1 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı içinde penisilin / streptomisin içerir.
  4. 37 hücreleri inkübe ° C ve% 5 CO2. İlk fibroblastlar epidermal örnek dışında büyümek kadar beklenen yayılma süresi 1-2 haftadır. Büyüme sorunla karşılaşmadım varsa, fibroblast büyüme fa yararlanabilirctor (5-10 ng / ml FGF2) hücrelerinin büyümesini geliştirmek için.
  5. % 50-70 bir hücre konfluense erişildikten sonra, primer insan fibroblastları dondurulabilir. 50-70% konfluent kadar saati geldiğinde, hücre hatları arasında farklılık gösterir. % 90 FCS artı% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde fibroblastlar dondurun.

2. Canlı Hücre Görüntüleme Mikroskobu için İnsan Fibroblastlar hazırlanması

Yaşlanması ile ilişkili değişiklikler birden fazla geçit sonra hücrelerin özelliklerini değiştirebilirsiniz Genel olarak, insan fibroblastları ile deneyler 10 Aşağıdaki pasajlar ile yapılmalıdır. Şüphe durumunda, beta-galaktosidaz deneyleri, ilgili hücreler içinde yaşlanma sürecinin indüksiyon değerlendirmek için de kullanılabilir. Genellikle yaşlı fibroblastlar (yukarıya bakınız) kullanmayın. Dahası, çeşitli hücre çizgileri karşılaştırmak için, her bir hücre hattı da aynı kanal adedi ile çalışır. Sağlıklı kontrollere göre farklı genetik olarak homojen hastaların karşılaştırılması tavsiye edilir. Ancak, bazenspesifik mutasyonları taşıyan hastalarda nadir olarak, bu belli bir pasaj sayısı ve farklı kontrol hatları ile sadece bir hastada alınan cilt biyopsilerinde eklenmek zorunda anlamına gelebilir olabilir - burada dahil tüm hatlar aynı pasajda sayısını sağlamak esastır. % 50-70 bir hücre konfluense ulaştığı ancak hiç bir deney planlanmış ise, fibroblastlar dondurulmuş olmalıdır.

  1. Denemenin ilk gününde, bir kez PBS ile ekli fibroblastlar yıkayın. Sonra proteolitik DNaz enzimler (yani Accumax) bir hücre dekolmanı çözüm kullanarak şişeyi alttan onları serbest bırakın.
  2. 4 odacıklı coverglass (kuyu başına 1,8 cm 2 kültür alanı) her bir kuyunun içinde hücreler ve tohum 50,000-70,000 hücreleri saymak. Buna göre, 8-haznesi coverglas için, hücre sayısı ya da daha az bir küçük yarısı (çukur başına 0.8 cm 2 kültür alanı) uygundur. Bu, tohum yerine gerçek tek hücreli bir analiz gerçekleştirmek için küçük bir hücre sayısı önemlidir. Odaları için spesifik bir kaplama is gerekli.
  3. 24-48 saat sonra, canlı hücre görüntüleme deney gerçekleştirilebilir. Canlı hücre görüntüleme mikroskobu sıcaklık ve CO 2 seviyeleri kontrol küvöz ile donatılmış olduğundan emin olun. Görüntü elde etme sırasında, 37 bir atmosfer ° C ve% 5 CO2 tutulmalıdır.
  4. Her canlı hücre görüntüleme ölçümü en az üç bağımsız deneyler yapılmalıdır. Toplam olarak, hücre hattı 50 hücreleri en az bir görüntülü olmalıdır. Canlı hücre görüntüleme deneyleri hem de off-line analiz toplama tarafsız veri sağlamak için kör koşulları altında yapılmak zorundadır.

3. İnsan Fibroblastlar Oturma Mitokondriyal Fonksiyon Ölçümü

Mitokondrial membran potansiyeli (MMP) bağımlı boyalar ile mitokondriyal fonksiyon geleneksel ölçüm için, floresan aktive hücre sıralama (FACS) birincil yöntemidir. Insan fibroblastları durumunda, hücresel autofluore olarakscence sıklıkla rastlanır ve gerçek boyama sinyal parazit ile yalancı pozitif sonuçlara neden olabilir. Otofloresansı tipik olarak fibroblastlar daha yüksek geçiş numarası ile daha belirgin hale gelir. Bu nedenle, canlı hücre görüntüleme mikroskopisi ile insan fibroblastlar mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için tercih ediyor.

  1. 24-48 saat sonra, tohum, RPMI ortamı içinde MMP-bağımlı boya tetramethylrodamine etil ester (TMRE) 50 nM olarak fibroblastlar inkübe edilir. Bu olumsuz görüntü kalitesini etkileyebilir gibi bu RPMI medyum fenol kırmızısı yoksun olmalıdır. Hoechst boyanma 1.6 uM çekirdekleri görselleştirmek için ilave edilmelidir.
  2. 37 ° C ve% 5 CO2 'de 15 dakika için ışıktan korunmuş boyanma hazırlanan çözelti içinde hücreler inkübe edin.
  3. RPMI medyum (fenol kırmızısı olmadan) ile boyama çözüm değiştirin. Yıkama adımlı ve hemen görüntü hücreleri olmadan devam edin. 63x büyütme ve kullanma konfokal lazer tarama mikroskopi tekniği (alternatif floresan mikroskobu kullanınApotome tekniği) hücrelerinin tek katmanlarını tanımlamak için kullanılır. 37 uygulanır ° C ve% 5 görüntüleme işlemi sırasında hücreler 2 CO.
  4. Görüntüleme fibroblastlar, TMRE boyama hızlı çamaşır suyu dışarı olabildiğince floresan ışık uygulanan pozlama süresi azami dikkat zaman. 200 ve 300 ms arasındaki uygun pozlama süresini tanımlayın ve bu aralık aşmamaktadır. Ayarları hücre hatları arasında farklı ise bir yoğunluğuna dayalı karşılaştırmalar yapmak mümkün olacak gibi standart ayarları altında görüntü elde etme, çok önemlidir.
  5. Görüntülü hücrelerinin etrafında belirli bir yarıçap ışığa maruz kaldıktan sonra dışarı ağartılmış gibi, yeteri kadar photobleached bölümünden sonraki görme alanı tutmak.
  6. Off-line analizler ImageJ Yazılım (; Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD Wayne Rasband) kullanılarak yapılmaktadır.
  7. Bir seçim aracını kullanarak ilgi hücreyi seçin.
  8. 8-bit görüntü dönüştürme (Görüntü <Tip <8-bit).
  9. Belirsiz gürültü b azaltıny "Benek" fonksiyonu (Süreç <Gürültü <Benek) kullanarak.
  10. Durumu (Resim <Arama Tabloları <Fire) - "Yangın Arama Tabloları" seçin.
  11. "Over / Under" işlevi eşik fonksiyonu açın ve (Resim <ayarlayın <Eşiği) eşik ayarlayın.
  12. Eğer algılanabilir her mitokondriyal partikül (Analiz <Analiz Parçacıklar) için ortalama gri değeri verecektir "parçacıklar analiz" seçeneğini seçin. Bir Excel elektronik olarak verilen sonuç listesini kaydedin.
  13. Açık sonuç Excel programında dosya ve mitokondriyal yapıların ortalama gri değeri ortalaması (Verilen excel sonuç listesinde 'ortalama' olarak gösterilir) hesaplamak.
  14. Bir yüzey komplo oluşturmak için, "3D" eklentisi bölümünde eklenti "Etkileşimli 3D yüzey komplo" seçin. Burada daha farklı görüntü seçenekleri kullanarak komplo ayarlayabilirsiniz. "Spectrum LUT" için "Orijinal Renkler" değiştirilmesi uygun arsa için yoğunluk ölçek çubuğu verir.
  15. Alternatif olarakcanlı hücre görüntüleme, MMP-bağımsız boya Mitotracker Green FM bir kombinasyonu ve CM-H 2 XRos kullanılabilecek MMP-bağımlı boya Mitotracker ile insan fibroblastları mitokondriyal işlev analiz etmek için TMRE kullanarak. Yine, insan fibroblastlar için hücre görüntüleme mikroskopisi tercih edilir yaşamak, ama genel olarak bu alternatif de hücrelerin 12 diğer tür FACS analizi kullanılarak kullanılır olmuştur. İnsan fibroblastlarındaki mitokondriyal fonksiyon, protokol bölümünde 5 adım 3-7 ölçmek için bu alternatif yaklaşımı kullanarak "insan fibroblastlar yaşayan mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon Ölçümü" uygulanmalıdır. Bununla, Mitotracker Yeşil FM ve Mitotracker CM-H 2 XRos için mitokondri pozitif hem sinyallerin bindirme, hesaplanmış ve tüm mitokondri mevcut oran olarak fonksiyonel mitokondri miktarını belirtir.

4. İnsan Fibroblastlar Oturma Mitokondriyal Morfolojisi Ölçümü

  1. 24-48hr tohumlama sonra, RPMI medyum içinde 200 nM Mitotracker Green FM (fenol kırmızısı yok) içinde inkübe hücreleri 37 'de 15 dakika için ışıktan korunmuş ° C ve% 5 CO2. Hoechst boyanma 1.6 uM çekirdekleri vurgulamak için kullanılır. Mitotracker Yeşil FM Tüm mitokondrial yapılar günümüze lekeleri bir MMP-bağımsız bir boya olduğunu.
  2. Hafifçe bir kez PBS ile yıkayın hücrelerini.
  3. Hücreleri ve hemen görüntü hücrelere taze RPMI medyum (fenol kırmızısı olmadan) ekleyin. Hücre tabakaları tek tek tanımlamak için 63x büyütme ve konfokal lazer tarama mikroskopi tekniği (Apotome tekniği kullanılarak alternatif floresan mikroskobu) kullanın.
  4. Off-line analizler ImageJ Yazılım kullanımı ile dışarı alınır.
  5. Bir seçim aracını kullanarak ilgi hücreyi seçin.
  6. 8-bit görüntü dönüştürme (Görüntü <Tip <8-bit).
  7. (Süreç <Gürültü <Benek) "Benek" işlevini kullanarak belirsiz gürültüyü azaltın.
  8. Mitokondriyal vurgulamak için evrişim filtresi kullanındrial yapılar (<Filtreler <Convolve işleyin).
  9. Sinyal-gürültü oranı uygun şekilde eşik ayarlayın (Resim <ayarlayın <Eşiği).
  10. "Parçacıklar analiz" seçeneğini kullanarak, mitokondriyal yapıların otomatik tanımlama (Analiz <Analiz Parçacıklar) Seçilen bir piksel boyutuna göre başlatılır. Çeşitli mitokondriyal parametreleri sonradan, alan, çevre, küçük ve büyük balta ya dairesellik olarak hesaplanır. Bu ölçümler (<Set Ölçümler Analizi) ayrı ayrı ayarlanabilir. Bir Excel elektronik olarak verilen sonuç listesini kaydedin.
  11. Excel programında sonuç dosyasını açın. Bu tür parametrelerin kullanılması ile mitokondriyal morfoloji analizi yapılabilir. Bu, bir mitokondriyal ağ dallanma derecesini belirten biçim faktörü tanımı, [formül: (2 çevre uzunluğu) / (4 * PI () * bölge)] gibi en-boy oranı mitokondri (formül uzunluğunun belirlenmesine: Majör eksenleri / küçük eksenleri).

5. İnsan Fibroblastlar Oturma Mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon Ölçümü

  1. 24-48 saat sonra, tohum, 200 nM Mitotracker Green ve FM içinde inkübe hücreler 100 nM Lyostracker Red 37 ° C ve% 5 CO2, 15 dakika süreyle ışıktan korunmuş RPMI ortamı (fenol kırmızısı olmadan) içinde DND-99. Hoechst boyanma 1.6 uM çekirdekleri vurgulamak için kullanılır.
  2. Taze RMPI orta (fenol kırmızısı olmadan) 100 nM Lyostracker Kırmızı DND-99 içeren ile orta değiştirin. Bu boya tüm görüntüleme oturumu sırasında mevcut olması gerekir. Kuluçka döneminden sonra hücreler yıkamayın. Hemen görüntü hücreleri. Hücre tabakaları tek tek tanımlamak için 63x büyütme ve konfokal tekniği (alternatif Apotome tekniği) kullanın.
  3. Off-line analizler ImageJ Yazılım kullanımı ile dışarı alınır.
  4. Eğer kolokalizasyon statü açısından analiz etmek istiyorum, iki ayrı görüntü açın.
  5. 8-bit görüntü dönüştürme (Görüntü <Tip <8-bit). Her iki görüntüde de "Benek" fonksiyonu (Süreç <Gürültü <Benek) kullanarak belirsiz gürültüyü azaltın.
  6. Eklenti ilgili kanallar için değerleri verir ve Pearson katsayısı hesaplar kolokalizasyon analiz aracı olarak "Jacop", katsayısı örtüşen ve Manders 'katsayısı (Eklentiler <Jacop) seçin.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Insan fibroblastlar yaşayan Mitokondriyal fonksiyon canlı hücre görüntüleme tekniği yoluyla değerlendirilebilir. Fonksiyonel testlerde, TMRE floresans sinyalinin mitokondrial membran potansiyeli (MMP) ile ilişkilidir. Normal MMP koşullar altında, TMRE floresans azalması MMP (Şekil 1A, alt sıra) ile karakterize patolojik şartlar altında daha (Şekil 1A, üst satır) anlamlı olarak yüksektir. Bu floresan yoğunluğu her mitokondriyal yapısının ortalama gri değerinin ortalamaları hesaplanarak ölçülür ( (Şekil 1A, sağ tarafı) resimde sağlar.

Insan fibroblastlar mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi yanında, canlı hücre görüntüleme mikroskopi mitokondriyal morfolojisi farklı parametreler tanımlamak için kullanılabilir. Mitotracker kullanarak yeşil FM boya mitokondriyal yapı kendi MMP (Şekil 2) bağımsız olarak görselleştirilebilir. Bu analiz içine mevcut tüm mitokondriyal yapıların eklenmesi sağlamak önemlidir. ImageJ Yazılımı kullanılarak, morfoloji gibi tek burada mitokondriyal morfoloji parametreleri (Şekil 2, bir "ikili") tespit edilebilir, ikili şekiller esas alınarak analiz edilir. Form faktörü gibi en-boy oranı bakımından mitokondriyal morfoloji analiz için son zamanlarda örnekler 6, 1 yayınlanan3. Insan fibroblastlar yaşayan ölçülebilir bir diğer önemli özelliği mitokondriyal yapılarının bozulması olduğunu. Bu ilerlemenin ilk adımı canlı hücre görüntüleme mikroskopi mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon değerlendirilebilir. Bazı patolojik koşullar lizozomlar (Şekil 3A) ile mitokondri artan bir ko ile sonuçlanır. Yine, Mitotracker Green FM kendi MMP bağımsız olarak mitokondriyal leke yapılar için kullanılır. Buna ek olarak, Lysotracker Kırmızı DND-99 ile boyanma lizozomal yapılar görüntülenmesi izin verir. Bu yıkama adımları görselleştirme için çok düşük olur sinyal azaltmak gibi Lysotracker Kırmızı boya, görüntüleme işlemi sırasında mevcut olduğunu önemlidir. Kolokalizasyon yeşil (Mitotracker Yeşil FM) ve kırmızı (Lysotracker Kırmızı DND-99) boyama (beyaz oklar, Şekil 3A) örtüşme nedeniyle net sarı floresan sinyalleri tarafından temsil edilir ve Pearson coe hesaplanması ile belirlenirfficient (Şekil 3B).

Genel olarak, ImageJ yazılım ile off-line analizler için, bu ilgi, belirli bir bölge (ROI) tanımı önlenebilir, böylece resim başına bir hücre görselleştirmek için yardımcı olur.

Şekil 1
Şekil 1. Canlı hücre görüntüleme tekniği ile insan fibroblastlar yaşayan mitokondrial membran potansiyeli (MMP) belirten TMRE floresans sinyal ölçümü. (A) TMRE olan floresan yoğunluğu MMP ile ilişkilendiren bir floresan MMP-bağımlı boya vardır. Hoechst boyalı çekirdekleri (mavi) leke kullanılmıştır. Normal MMP koşullar altında (üst sıra), TMRE floresans azalması MMP (alt sıra) ile karakterize patolojik şartlar altında daha yüksektir. Floresan yoğunluğunun ayrıca gösteriliryoğunluğu yüzey arsa gibi. Ölçek çubuğu 10 mikron gösterir. (B), örnek fibroblastların İstatistiksel analizler (A) 'da gösterilmektedir. Patolojik koşullar altında, mitokondri bir azalma TMRE floresans normal MMP durumuna göre ölçülür. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Canlı hücre görüntüleme tekniği ile insan fibroblastlar canlı mitokondri morfolojisindeki ölçümü. Mitotracker Yeşil FM (yeşil) mitokondriyal yapıları göstermek için kullanılır, bunun için de MMP bağımsızdır. Hoechst boyalı çekirdekleri (mavi) leke kullanılmıştır. ImageJ Yazılımı kullanarak, morfolojisi ikili rakamlar üzerinde analiz edilebilir. Ölçek çubuğu 10 mikron gösterir. tıklayınız Burada büyük bir rakam görmek için.

Şekil 3
Şekil 3. Canlı hücre görüntüleme tekniği ile insan fibroblastlar yaşayan lizozomlar ile mitokondri kolokalizasyon ölçümü. (A) Mitotracker Yeşil FM (yeşil) mitokondrial yapılar leke için kullanılan, Lyostracker Kırmızı DND-99 (kırmızı) lizozomal yapılar görselleştirir. Hoechst boyalı çekirdekleri (mavi) leke kullanılmıştır. Patolojik koşullar altında başarılı bir şekilde ko Lysotracker kırmızı ve yeşil Mitotracker boyama (beyaz oklar) üst üste dolayı sarı bir sinyal ile gösterilir. Ölçek çubuğu 10 mikron gösterir. (B), örnek fibroblastların İstatistiksel analizler (A) 'da gösterilmektedir. Yükseltilmiş Pearson katsayısı değeri mitochondrio-lizozomal kolokalizasyon sonuçların bir yüksek derecede./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ex vivo modeller olarak Hasta deri fibroblast hastalıkla ilişkili genetik bozukluklar karakterize etmek için önemli bir araç haline gelir. Buna ek olarak, deri türevi fibroblastlar kolayca erişilebilir ve kültür üzerine genişletilmiş olabilir. Bunlar endojen gen hastalığa neden olan, ancak etkilenen bireyin tüm genetik arka plan da içerir nedenle, PD ile ilişkili genetik mutasyonu taşıyan hastadan elde edilen birincil hücreler tümör hücre hatları üzerinde kullanılması tercih edilir. Bundan başka, fibroblastlar nörodejenerasyon sırasında mitokondriyal işlev bozukluğu arasında önemli patolojik özellikler yansıtacak şekilde gösterilmiştir. Bu protokolde tarif edilen deneyler fonksiyonu, şekil hem de canlı hücre görüntüleme tekniği ile birlikte lizozomlar mitokondri değerlendirmek ko içeren mitokondriyal fenotipleri çalışmak için özellikle yararlıdır. Bunun sonucu olarak, hastalığın ana diğerlerinden ayıran, yani mitokondriyal işlev bozukluğu ve daha sonraki degradBu fonksiyonel olmayan organellerin ation, göz önünde canlandırılabilir ve düzgün 6 13 analiz. Mitokondriyal fonksiyon ve morfolojisi değişiklikler genellikle hastalığın patolojik bir ilk adımdır. Örneğin, mitokondriyal ağ parçalanma geliştirilmiş Otofajik ve mitophagic süreçlerin 6,12 arasında bir ön olabilir artmıştır. Bu nedenle, lizozomlar ile mitokondri kolokalizasyon mitokondriyal bozulması (mitophagy) 6 değerlendirmek için yardımcı olabilir. Bu ko eksikliği yanı sıra lizozomlar ile mitokondri birikimi lizozomal degradasyon yolu kusurları yansıtan ve oransal Otofajik akı 6 valide edilmelidir olabilir. Bu bağlamda, ImageJ Yazılım yarı-otomatik olmayan önyargılı analiz fonksiyonları tarafından onaylanmış veri kümesi oluşturmak için önemli bir aracı ifade eder.

Daha hastalıkla ilişkili modeller insan fibroblastlar kullanımını genişleten ek bir seçenek potansiyeli generat olduğunuhastalık sürecinin 14 temel hedefi olan farklı hücre tiplerine ayrılabilirler indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreleri, iyon. Parkinson hastalığı durumunda, dopaminerjik nöronların içine fibroblast farklılaşmasını bu hücresel modeli bu nörodejeneratif bir hastalık 15,16 gelecekte araştırması için umut verici bir araçtır. Önemlisi, burada protokol tanımlanan testlerin tümünü kolaylıkla dopaminerjik nöronların içinde mitokondriyal değişiklikler araştırmak için deney düzeneklerini tercüme edilebilir. Tabii ki, daha da özel nöron, canlı hücre görüntüleme deneyler de uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (RK 10.11.2.153), Alman Araştırma Kurumu (DFG, KR2119/3-2 ve RK KR2119/8-1), Eğitim Federal ve Araştırma Bakanlığı (BMBF hibeleri tarafından desteklenen , NGFNplus; RK 01GS08134) ve [LFB için] hayırsever Hertie Vakfı Doktora Bursu. Biz video çekimi sırasında verdikleri destek nedeniyle Carolin Obermaier ve Julia Westermeier ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red Invitrogen 11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
AccuMax (detachment solution) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Green FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
H–chst 33342 Invitrogen H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson's disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
  2. Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
  3. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
  4. Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
  5. Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson's disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
  6. Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson's disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
  7. Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
  8. Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge--the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson's disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
  9. Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
  10. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
  11. Dagda, R. K., Cherra, S. J. 3rd, Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. 284-13843 (2009).
  12. Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
  13. Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson's disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
  14. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  15. Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
  16. Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics