Extracción de los antígenos tisulares para Ensayos funcionales

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Un protocolo simple de preparar los extractos de tejido humano para ser utilizado como una fuente de antígenos funcionales en ensayos de células T se describe. Este método permite respuestas de células T a los antígenos derivadas de tejido a medir

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Necula, A., Chand, R., Albatat, B., Mannering, S. I. Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays. J. Vis. Exp. (67), e4230, doi:10.3791/4230 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Muchos de los objetivos de antígeno de la respuesta inmune adaptativa, reconocidos por células B y T, no se han definido 1. Esto es particularmente cierto en las enfermedades autoinmunes y el cáncer 2. Nuestro objetivo es investigar los antígenos reconocidos por las células T en la enfermedad de tipo 1 autoinmune diabetes 1,3,4,5. Para analizar humanos respuestas de células T contra el tejido en el que los antígenos reconocidos por las células T no se identifican hemos desarrollado un método para extraer antígenos de proteínas a partir de tejido humano en un formato que es compatible con los ensayos funcionales 6. Respuestas previamente, las células T a los extractos de tejido no purificados no se pudo medir debido a que los métodos de extracción de producir un lisado que contiene detergentes que eran tóxicas para las células humanas mononucleares de sangre periférica. Aquí se describe un protocolo para la extracción de proteínas de los tejidos humanos en un formato que no es tóxico para las células T humanas. El tejido se homogeneizó en una mezcla de butan-1-ol, acetonitrilo y water (BAW). La concentración de proteína en el extracto de tejido se mide y una masa conocida de la proteína se dividió en alícuotas en tubos. Después de la extracción, los disolventes orgánicos se eliminan por liofilización. Extractos de tejidos liofilizadas pueden almacenarse hasta que se necesite. Para uso en ensayos de la función inmunitaria, una suspensión de células inmunes, en medios de cultivo apropiados, se puede añadir directamente al extracto liofilizado. La producción de citocinas y la proliferación de PBMC, en respuesta a los extractos preparados con este método, se mide fácilmente. Por lo tanto, nuestro método permite la rápida preparación de lisados ​​de tejidos humanos que se pueden utilizar como fuente de antígenos en el análisis de las respuestas de células T. Se sugiere que este método facilitará el análisis de la respuesta inmune adaptativa a los tejidos en el trasplante, el cáncer y la autoinmunidad.

Protocol

1. Preparación de tejido de bazo

  1. Nota-todo el material humano debe ser tratado como potencialmente infeccioso y todos los procedimientos deben llevarse a cabo en un gabinete de flujo laminar clase II. El uso de tijeras y pinzas estériles, quitar grasa y tejido fibroso a partir de secciones de bazo (~ 1-2 cm de tamaño) y recortar la mayor cantidad de material de la cápsula exterior como sea posible.
  2. Cortar un trozo pequeño (1-2 cm 3) de tejido de bazo y colocar cada pieza en un tubo estéril Falcon de 50 ml.
  3. Snap-congelar los trozos de tejido por inmersión en N 2 líquido.
  4. Conservar a -80 ° C. Un protocolo similar es adecuado para otros tejidos (s).

2. Preparación de islotes humanos para almacenamiento

  1. Islotes Cultura CMRL medios de comunicación. Recoger islotes en un tubo de fondo cónico de 10 ml y lavar dos veces en PBS mediante centrifugación a 1.500 rpm durante 5 min. Retirar el PBS y drenar el buffer residual colocando el tubo invertido brevemente sobre una toalla de papel. Tenga cuidado de nopara desalojar a los islotes.
  2. Una vez escurrido, vuelva a tapar el tubo y la presión por congelación en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.

3. Preparación de Extracto

  1. Preparar BAW mix (10:30:60% v / v) y se almacena a 4 ° C.
  2. Retire el tubo de -80 ° C. Descongelar a temperatura ambiente.
  3. Añadir suficiente helado BAW para cubrir la pieza de tejido. Para usar islotes 3-5 ml. Para utilizar el tejido de bazo 10-20 ml, dependiendo del tamaño de la pieza de tejido.
  4. Montar el homogeneizador de tejidos. Limpiar por 'homogeneizar' 10-20 ml de 70% etanol / agua.
  5. Homogeneizar el tejido en múltiples ráfagas, después de colocar la sonda en el tubo homogeneizador con el tejido y la solución BAW. Mantenga el tubo en un cubo de hielo a partir de entonces.
  6. Limpiar a fondo el homogeneizador entre las muestras, por homogeneización de 10-20 ml de 70% de etanol / agua y luego tampón BAW. Esto evita la contaminación cruzada de tejido entre samples.Dismantleand limpia con 70% de etanol / agua después de nosotrose.
  7. Si un extracto que contiene sólo el material soluble se requiere, centrifugar extracto de tejido homogeneizado a 4.000 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Si un extracto crudo se requiere más, centrifugar a 1.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 min. La técnica más adecuada para la extracción de las proteínas insolubles en BAW depende del análisis de aguas abajo de las proteínas. Para uso en ensayos inmunológicos funcionales que sugeriría intentar disolver la fracción insoluble en urea 8 M como previamente hemos encontrado que esto se tolera bien 6.
  8. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y ponerlo en hielo.
  9. Determinar la concentración de proteína en el extracto usando un ensayo de BCA o similar.

4. Congelar los extractos de secado

  1. Dependiendo de la masa de proteína requerida (es decir, 100 g por tubo), se diluye el homogeneizado en consecuencia y dispensar alícuotas en un recipiente etiquetado estéril 5,0 ml, Falcon (12x75 mm) tubos. Con frecuencia se utilizan 100 mg / tubo.
  2. Utilice un 18-20 aguja jeringa estéril para hacer 3 agujeros en la tapa de cada tubo.
  3. Congelar los tubos ya sea colocándolas en hielo seco durante ~ 10 min o en un congelador -80 ° C durante> 1 h. Conservar a -80 ° C hasta el momento de poner en el liofilizador.
  4. Conectar el liofilizador y permitir que se equilibre (-100 ° C). Esto tarda aproximadamente 30 min.
  5. Dependiendo del volumen, el secado por congelación puede ser completado dentro de 3 horas, pero de manera rutinaria dejar las muestras durante la noche.
  6. Después de la terminación del ciclo de secado, desconectar la bomba de vacío y lentamente permitir que la presión en la cámara. Quite la parrilla.
  7. En una campana estéril, retire los tapones de los tubos perforados y sustituirlos por otros nuevos (Falcon 352.032).
  8. Tienda de tubos a -20 ° C. Las muestras se pueden reconstituir en medios de cultivo, o tampones otros, y se utiliza en la función o ensayos bioquímicos.

5. Los resultados representativos

La Figura 1 muestra la tinción de una proteínagel cargado con extracto de bazo y de islotes empobrecido tejido pancreático (etiquetado acinar) y se purificó islotes humanos (islotes marcados). Los resultados muestran una buena representación de las proteínas de peso molecular diferente para cada tejido.

La capacidad de los extractos de tejido humano para estimular la proliferación de células T se ensayó usando un ensayo de proliferación de CFSE basado en 7 (Figura 2). El PBMC utilizado en este ensayo fueron aisladas de un individuo con diabetes tipo 1. La magnitud de la respuesta se expresa como una relación del número de células CFSE dim por 5.000 CD4 +, células CFSE brillantes sin antígeno: de células CFSE dim por 5.000 CD4 +, células CFSE luminosas con antígeno de 7 muestras por triplicado. Los resultados muestran una débil, pero la proliferación detectable, en respuesta a acinar (CD1 = 3,5) y una respuesta más fuerte con el extracto de islote (6,8). Virus de la influenza inactivado (CDI = 142,6) se incluye como unacontrol positivo.

Figura 1
Figura 1. Gel de proteína.

Figura 2
Resultados de la figura 2. De un ensayo de proliferación CFSE basado contra acinar y extracto de islotes. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo fue desarrollado porque queríamos generar un extracto de tejido humano que estaba libre de productos químicos tóxicos como detergentes. Específicamente, se han utilizado para preparar los extractos de tejido humano que se pueden utilizar en ensayos de la función inmune humano in vitro. Los extractos preparados usando este protocolo también se puede reconstituir en cualquier tampón y se utiliza para muchos análisis bioquímicos, tales como la cromatografía de Western Blot o líquido. Esto hace que esta técnica aplicable a muchas aplicaciones posteriores.

Utilizando el protocolo de la respuesta a los extractos de tejidos no son fuertes. Esto es normal, ya que estamos buscando respuestas a los antígenos de "yo", en nuestro caso respuestas de células T contra antígenos de los islotes son frecuentemente débiles 1. Anteriormente hemos encontrado que las células CD4 + humanas respuestas de las células T a la proinsulina recombinante y la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), autoantígenos en la diabetes tipo 1, puede ser detectado utilizando nuestro CFSE basadaEnsayo de proliferación de 7,8. Hemos elegido utilizar extractos de tejidos para evitar los problemas asociados con el uso de péptidos sintéticos y proteínas recombinantes 9 10.

Nosotros no suelen añadir inhibidores de la proteasa en nuestro extracciones. La presencia de inhibidores de la proteasa pueden inhibir el procesamiento y presentación de antígenos 11 y, en consecuencia inhibir respuestas de células T. En lugar de eso realizar la extracción en hielo en un intento de prevenir la degradación mediada por proteasa. Para otras aplicaciones, la inclusión de inhibidores de la proteasa puede ser beneficioso si la degradación de proteínas es un problema.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado por becas de la Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) y la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) y el Plan de Infraestructuras de Operaciones del Gobierno de Victoria. Damos las gracias a los miembros del equipo Tom Mandel Islet Programa de Trasplante de aislamiento de islotes para la prestación de los tejidos humanos. Los tejidos humanos fueron recogidos y utilizados con la aprobación ética local (Hospital de San Vicente HREC-A 011/04 y de la Salud de San Vicente HREC-A 135/08).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes BD Falcon 352054
Caps for tubes polystyrene tubes (above) BD Falcon 352032
50ml sterile tubes Becton Dickinson 352070
Acetonitrile Mallinckradt Chemicals 2856-10
Butan-1-ol Sigma Aldrich 537993-IL
Homogenizer: PRO200 Bio-strategy 01-01200 10 x 115 mm saw-tooth generator
Lyophilizer Virtis, Benchtop 4K
Sterile Needle 18-20 gauge Becton Dickinson REF 302032
CMRL-1066 Medium Sigma C0422
PBS Sigma D8537

Table 1. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
  2. Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
  3. Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
  4. Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
  5. Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
  6. Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
  7. Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
  8. Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
  9. Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
  10. Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
  11. Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics