Extraction des antigènes tissulaires de tests fonctionnels

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Un protocole simple de préparation d'extraits de tissus humains pour être utilisées comme source d'antigènes à des cellules T fonctionnelles des essais est décrit. Cette méthode permet réponses des cellules T à des antigènes dérivés de tissus à mesurer

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Necula, A., Chand, R., Albatat, B., Mannering, S. I. Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays. J. Vis. Exp. (67), e4230, doi:10.3791/4230 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La plupart des antigènes cibles de la réponse immunitaire adaptative, reconnus par les cellules B et T, n'ont pas été définis 1. Cela est particulièrement vrai dans les maladies auto-immunes et le cancer 2. Notre objectif est d'étudier les antigènes reconnus par les lymphocytes T humains dans le type 1, diabète maladie auto-immune 1,3,4,5. Pour analyser des cellules T humaines réponses contre les tissus où les antigènes reconnus par les lymphocytes T ne sont pas identifiés, nous avons développé une méthode pour extraire les antigènes protéiques de tissus humains dans un format qui est compatible avec les analyses fonctionnelles 6. Réponses précédemment, des cellules T à des extraits de tissus non purifiés n'a pas pu être mesurée, car les méthodes d'extraction donner un lysat contenant des détergents qui étaient toxiques pour les cellules mononucléées du sang périphérique. Ici, nous décrivons un protocole d'extraction de protéines à partir de tissus humains dans un format qui n'est pas toxique pour les cellules T humaines. Le tissu est homogénéisé dans un mélange de butan-1-ol, l'acétonitrile et water (BAW). La concentration en protéines dans l'extrait de tissu est mesurée et une masse connue de protéine est mise dans des tubes. Après extraction, les solvants organiques sont éliminés par lyophilisation. Extraits de tissus lyophilisés peuvent être conservés jusqu'à leur utilisation. Pour une utilisation dans des tests de la fonction immunitaire, une suspension de cellules du système immunitaire, dans les milieux de culture appropriés, peuvent être ajoutés directement à l'extrait lyophilisé. La production de cytokines et la prolifération des PBMC par, en réponse à des extraits préparés en utilisant cette méthode, ont été faciles à mesurer. Par conséquent, notre méthode permet la préparation rapide des lysats de tissus humains qui peuvent être utilisés comme source d'antigènes dans l'analyse des réponses des cellules T. Nous suggérons que cette méthode va faciliter l'analyse des réponses immunitaires adaptatives des tissus de greffe, le cancer et l'auto-immunité.

Protocol

1. Préparation de tissu de la rate

  1. Remarque-tout le matériel humain doit être traité comme potentiellement infectieux et toutes les procédures doivent être menées dans un cabinet à flux laminaire de classe II. Avec des ciseaux et des pinces stériles, retirer les tissus adipeux et fibreux issus de sections rate (~ 1-2 cm) et coupez autant de matériel que possible capsule externe.
  2. Coupez un petit morceau (1-2 cm 3) de tissu de la rate et placer chaque morceau dans un tube stérile Falcon de 50 ml.
  3. Snap-congeler les morceaux de tissu par immersion dans l'azote liquide 2.
  4. Conserver à -80 ° C. Un protocole analogue est adapté à un autre tissu (s).

2. Préparation Islet humaines pour le stockage

  1. Îlots de culture dans les médias cmLC. Recueillir des îlots dans un tube de 10 ml à fond conique et laver deux fois dans du PBS par centrifugation à 1500 rpm pendant 5 min. Verser le PBS et vider le tampon résiduel en plaçant le tube inversé brièvement sur une serviette en papier. Veillez à ne paspour déloger les îlots.
  2. Une fois égoutté, replacez le capuchon du tube et snap-gel dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

3. Préparation Extrait

  1. Préparer BAW mélange (10:30:60% v / v) et conserver à 4 ° C.
  2. Retirer le tube de -80 ° C. Décongeler à température ambiante.
  3. Ajouter suffisamment glacée BAW à couvrir la pièce de tissu. Pour utiliser îlots 3-5 ml. Pour tissu de la rate utiliser 10-20 ml en fonction de la taille de la pièce de tissu.
  4. Assemblez l'homogénéisateur tissulaire. Nettoyer par «homogénéisation» 10-20 ml d'éthanol à 70% / eau.
  5. Homogénéiser le tissu en salves multiples, après avoir placé la sonde dans le tube homogénéisateur avec le tissu et la solution BAW. Garder le tube dans un seau à glace par la suite.
  6. Nettoyer soigneusement l'homogénéisateur entre les échantillons, en homogénéisant 10-20 ml d'éthanol à 70% / eau, puis tampon BAW. Cela permet d'éviter la contamination croisée du tissu entre samples.Dismantleand propre avec 70% d'éthanol / eau après nouse.
  7. Si un extrait contenant uniquement des matières solubles est nécessaire, centrifuger l'extrait de tissu homogénéisé à 4.000 tours par minute à température ambiante pendant 10 min. Si un extrait brut est plus nécessaire, tourner à 1000 tours par minute à température ambiante pendant 5 min. La technique la plus appropriée pour l'extraction des protéines insolubles dans l'BAW dépend de l'analyse des protéines en aval. Pour une utilisation dans des dosages immunologiques fonctionnels nous vous suggérons de tenter de dissoudre la fraction insoluble dans l'urée 8 M comme nous l'avons déjà constaté que cela soit bien toléré 6.
  8. Transférer le surnageant dans un tube propre et le mettre sur la glace.
  9. Déterminer la concentration de protéines dans l'extrait en utilisant un dosage BCA ou similaire.

4. Congelez Extraits de séchage

  1. En fonction de la masse de la protéine souhaitée (par exemple, 100 mg par tube), diluer l'homogénat en conséquence et distribuer des aliquotes dans étiqueté stérile 5,0 ml, Falcon (12x75 mm) des tubes. Nous utilisons fréquemment 100 pg / tube.
  2. Utilisez un 18-20 aiguille de seringue stérile de calibre pour faire 3 trous dans le couvercle de chaque tube.
  3. Geler les tubes soit en les plaçant sur de la glace sèche pendant environ 10 min ou dans un congélateur à -80 ° C pendant> 1 heure. Conserver à -80 ° C jusqu'au moment de mettre sur le lyophilisateur.
  4. Allumez le lyophilisateur et ramener la température (-100 ° C). Cela prend environ 30 minutes.
  5. Selon le volume, la lyophilisation peut être accompli dans les 3 heures, mais nous avons l'habitude laisser nos échantillons durant la nuit.
  6. Après la fin du cycle de séchage, éteindre la pompe à vide et permettre lentement la pression dans la chambre. Enlever la grille.
  7. Dans une hotte stérile, enlever les bouchons des tubes perforés et les remplacer par des piles neuves (Falcon 352 032).
  8. Conserver les tubes à -20 ° C. Les échantillons peuvent être reconstitués dans des milieux de culture, ou des tampons d'autres, et utilisés en fonction ou des essais biochimiques.

5. Les résultats représentatifs

La figure 1 montre la coloration d'une protéinegel chargé avec de l'extrait de la rate et du tissu des îlots pancréatiques appauvri (étiqueté acineuse) et purifié îlots humains (îlots étiquetés). Les résultats montrent une bonne représentation de protéines de poids moléculaire différent pour chaque tissu.

La capacité de stimuler les extraits de tissus humains prolifération des cellules T a été testée en utilisant un test de prolifération CFSE base 7 (figure 2). Les PBMC utilisé dans cet essai ont été isolés à partir d'une personne avec diabète de type 1. L'ampleur de la réaction est exprimée comme un rapport entre le nombre de cellules CFSE sombres pour 5000 cellules CD4 + CFSE, lumineux sans antigène: des cellules CFSE sombres pour 5000 CD4 +, des cellules CFSE lumineuses avec un antigène provenant d'échantillons en triple 7. Les résultats montrent une faible, mais détectable, en réponse à la prolifération des cellules acineuses (CD1 = 3,5) et une plus forte réponse à l'extrait îlot (6,8). Virus de la grippe inactivé (CDI = 142,6) est inclus en tant quecontrôle positif.

Figure 1
Figure 1. Gel de protéines.

Figure 2
Résultats Figure 2. D'un test de prolifération CFSE à base de contre acineuses et extrait îlot. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce protocole a été développé parce que nous voulions produire un extrait de tissu humain qui est exempt de produits chimiques toxiques tels que les détergents. Plus précisément, nous avons utilisé pour préparer des extraits de tissus humains qui peuvent être utilisés dans des tests de la fonction immunitaire humain in vitro. Les extraits préparés en utilisant ce protocole peut également être reconstitué dans une solution tampon et utilisé pour de nombreuses analyses biochimiques, telles que la chromatographie western blot ou liquide. Cela rend cette technique applicable à de nombreuses applications en aval.

En utilisant notre protocole de la réponse à des extraits de tissus ne sont pas forts. Cela devrait parce que nous sommes à la recherche de réponses aux antigènes «soi», dans notre cas réponses des lymphocytes T contre les antigènes des îlots sont souvent faibles 1. Précédemment, nous avons constaté que les CD4 + humains réponses des lymphocytes T à recombinante proinsuline et l'acide glutamique décarboxylase (GAD), auto-antigènes diabète de type 1, peut être détectée à l'aide de notre base de CFSEtest de prolifération 7,8. Nous avons choisi d'utiliser des extraits de tissus pour éviter les problèmes associés à l'utilisation de peptides synthétiques 9 et protéines recombinantes 10.

Nous n'avons pas l'habitude ajouter des inhibiteurs de protéase à notre extractions. La présence d'inhibiteurs de protéase peut inhiber le traitement et la présentation d'antigène 11 et par conséquent inhiber la réponse lymphocytaire T. Au lieu de cela on réalise l'extraction sur la glace dans une tentative d'empêcher la dégradation par la protéase. Pour d'autres applications de l'inclusion des inhibiteurs de protéase peut être bénéfique si la dégradation des protéines est un problème.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par des subventions de l'Australian National de Santé et Medical Research Council (NHMRC # 559007) et la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) et le Programme d'infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria. Nous remercions les membres du Tom Mandel Islet programme de l'équipe de transplantation d'isolement des îlots de fournir les tissus humains. Tissus humains ont été recueillis et utilisés avec l'approbation éthique local (Hôpital Saint-Vincent-de-HREC A 011/04 et de santé St. Vincent HREC-A 135/08).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes BD Falcon 352054
Caps for tubes polystyrene tubes (above) BD Falcon 352032
50ml sterile tubes Becton Dickinson 352070
Acetonitrile Mallinckradt Chemicals 2856-10
Butan-1-ol Sigma Aldrich 537993-IL
Homogenizer: PRO200 Bio-strategy 01-01200 10 x 115 mm saw-tooth generator
Lyophilizer Virtis, Benchtop 4K
Sterile Needle 18-20 gauge Becton Dickinson REF 302032
CMRL-1066 Medium Sigma C0422
PBS Sigma D8537

Table 1. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
  2. Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
  3. Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
  4. Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
  5. Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
  6. Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
  7. Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
  8. Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
  9. Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
  10. Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
  11. Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics