غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]

Published 12/17/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

تقنية تسمى

Cite this Article

Copy Citation

Moller, I. E., Pettolino, F. A., Hart, C., Lampugnani, E. R., Willats, W. G., Bacic, A. Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays . J. Vis. Exp. (70), e4238, doi:10.3791/4238 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جدران الخلايا النباتية هي مصفوفات معقدة من glycans غير المتجانسة التي تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء وتطوير محطات وتوفير المواد الخام اللازمة للمجتمعات البشرية (مثل الخشب والورق والمنسوجات والصناعات الوقود الحيوي) 1،2. ومع ذلك، فهم الحيوي وظيفة هذه المكونات لا تزال صعبة.

glycans جدار الخلية هي كيميائيا ومتنوعة conformationally نظرا لتعقيد اللبنات الخاصة بهم، بقايا غليكوزيل. هذه الروابط على مواقع متعددة شكل وتختلف في هيكل حلقة، أو التكوين ايزوميريا المصاوغ الكربونيلي، وبالإضافة إلى ذلك، يتم استبدال مع مجموعة من غير السكر المخلفات. غليكان تكوين يختلف في الخلية مختلفة و / أو أنواع الأنسجة أو حتى الميادين الفرعية من خلية واحدة الجدار 3. وعلاوة على ذلك، يتم تعديل تكوينها أيضا خلال التنمية أو استجابة لمنبهات البيئة 4.

في السابقسيس من 2،000 الجينات لها جدران الخلايا النباتية هي مصفوفات معقدة من glycans غير متجانسة تم توقع أن تشارك في الخلية الحيوي غليكان الجدار وتعديل في 5 ل arabidopsis. ومع ذلك، فقد كانت قليلة نسبيا من الجينات السكروز تتميز وظيفيا 4،5. عكس النهج علم الوراثة يصعب في كثير من الأحيان بسبب الجينات وأعرب تفاضلي، في كثير من الأحيان عند مستويات منخفضة، وبين أنواع الخلايا 6. أيضا، في كثير من الأحيان يتم إعاقة دراسات الجينات الطافرة من التكرار أو آليات تعويضية لضمان الحفاظ على وظيفة مناسبة جدار الخلية 7. وبالتالي هناك حاجة إلى نهج جديدة لتوصيف بسرعة مجموعة متنوعة من الهياكل غليكان وتيسير النهج الجينوميات الوظيفية للخلية فهم الحيوي الجدار والتعديل.

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) ظهرت 8،9 كأداة هامة لتحديد هيكل غليكان والتوزيع في النباتات. هذه الاعتراف صالحواتم خاص بالمعهد الحالي ضمن فئات رئيسية من glycans جدار الخلية النباتية، بما في ذلك pectins وxyloglucans، xylans، mannans، وarabinogalactans جلوكان. مؤخرا تم تمديد استخدامها لفحص تجارب واسعة النطاق لتحديد الوفرة النسبية للglycans في مجموعة واسعة من النباتات وأنواع الأنسجة 9،10،11 في وقت واحد.

هنا نقدم لفحص غليكان ميكروأري على أساس طريقة تسمى البوليمرات ميكروأري الشامل التنميط (CoMPP) (الشكلان 1 و 2) 10،11 تمكن عينات متعددة (100 ثانية) ليتم عرضه باستخدام منصة ميكروأري مصغرة مع كاشف انخفاض حجم العينة و. ويمكن للإشارات بقعة على ميكروأري كميا رسميا لإعطاء نصف الكمية بيانات عن حدوث حاتمة غليكان. هي مناسبة تماما لهذا النهج تعقب التغييرات في النظم البيولوجية غليكان المعقدة 12 و تقديم نظرة عامة شاملة لتكوين جدار الخلية وخاصة عندما قبل س المعرفةو هذا غير متوفر.

Protocol

1. مجموعة الأنسجة وإعداد

  1. جمع 100 ملغ الوزن الطازج من الأنسجة النباتية (ما لا يقل عن 10 ملغ الوزن الجاف) في ما لا يقل عن ثلاث نسخ لكل الأنسجة من الاهتمام. تصف الخطوات التالية إعداد المواد جدار الخلية من الأنسجة النباتية. في حالة الأنسجة التخزين، تتم إزالة إنزيمي للامم المتحدة المطلوبين النشا قبل الشروع في استخراج البوليمرات جدار الخلية كما هو موضح سابقا 13.
  2. التجانس العينات إلى مسحوق ناعم مع النيتروجين السائل باستخدام TissueLyser QIAGEN II، مع 24 مجموعات محول أنبوب 3 مم والتنغستن الخرز كربيد (30 هرتز، 2 × 30 ثانية). وبدلا من ذلك يتم معالجتها إذا سوى بعض العينات، يتم استخدام هاون ومدقة.
  3. نقل الخليط إلى 10 مل أنابيب البلاستيك مخروطي.
  4. إعداد المواد جدار الخلية غسل الخليط في 10 مل ايثانول ت / ت 80٪ في RT vortexing وبقوة لمدة 2 دقيقة.
  5. أجهزة الطرد المركزي العينات في 3500 XG وتجاهل طاف. تكرار الايثانول 70٪ يغسل ثلاث مرات على الأقل أو حتى طاف هو واضح، ولا سيما بالنسبة للأنسجة التي تحتوي على الكلوروفيل.
  6. إجراء غسيل النهائي مع الأسيتون 100٪ وترك الكريات التي تحتوي على مخلفات غير القابلة للذوبان الكحول (AIR) في الهواء الجاف بين عشية وضحاها.
  7. غربال عينات الهواء مع شبكة 0.4 2 مم لتحقيق غرامة، ومسحوق متجانس وإزالة أكبر، سيئة الجسيمات الأرض التي لا تزال في وقت ما في جناسة.
  8. تزن 10 ملغ في عينة AIR microtubes، كل واحد منها الزجاج مم 3 حبة لمساعدة اختلاط العينات.

2. استخراج Glycans جدار الخلية

  1. يتم استخراج البكتين، والبوليمرات المرتبطة البكتين من عينات عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من CDTA ميكرومتر 50 (الرقم الهيدروجيني 7.5) لكل عينة.
  2. دوامة الأنابيب لفترة وجيزة لضمان المذيب على اتصال مع مادة العينة ثم تخلط باستخدام TissueLyser لمدة 3 ساعة في 8 هرتز.
  3. أجهزة الطرد المركزي العينات في 12000 XG، بعناية صemove في supernatants وتخزينها في C. ° 4
  4. غسل الكريات في 1 مل من غير المتأينة الماء لتخفيف وإزالة أي المتبقية المذيبات، وأجهزة الطرد المركزي في دوامة ز X 13،000. كرر هذه الخطوة من دون إزعاج بيليه وإزالة جميع السائل من الأنابيب قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  5. يتم استخراج بالتسلسل عبر ربط glycans من بيليه جدار الخلية المتبقية مع 500 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 4M بنسبة 0.1٪ وزن / حجم NaBH4، وذلك باستخدام نفس الإجراء موضح في الخطوات 2،1 حتي 2،4 لاستخراج CDTA. يضاف NABH 4 إلى الحد من ألدهيد (أو كيتوني) المجموعة في نهاية الحد من السكريات إلى الكحول وبالتالي منع تقشير قاعدة من السكريات.
  6. بعد الطرد المركزي، تتم إزالة supernatants مرة أخرى وتخزينها في 4 درجات مئوية، وغسلها مرتين في الكريات غير المتأينة المياه قبل الشروع في استخراج المقبل.
  7. وكخطوة اختيارية، يتم استخراج البوليمرات المتبقية، مثل السليلوز مع 500 ميكرولتر cadoxen (31٪ V / V 1،2-diaminoethane مع CDO M 0.78) باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوات 2،1 حتي 2،4. وبدلا من ذلك، يمكن تحديد محتوى السليلوزية المطلقة في الكريات المتبقية باستخدام فحوصات الخليك / النيتريك (انظر المناقشة).

3. الطباعة [ميكروأرس]

  1. تحتوي على استخراج supernatants الطرد المركزي البوليمرات جدار الخلية في 13000 XG لإزالة أي الجسيمات.
  2. تحميل 50 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة البولي بروبلين 384 عيار مكروي جيدا باستخدام تخطيط المصممة مسبقا حسب الطلب حيث يتم ترتيب العينات وفقا لنوع الأنسجة ونوع الاستخراج.
  3. تمييع العينة خلية البوليمر الجدار في سلسلة × 0، 5 و 25 مسلسل التخفيف بالماء منزوع الأيونات.
  4. يتم تعيين المعلمات مثل ارتفاع دبوس، جمع ويسكن الوقت، والخطوات الغسيل على البرنامج السيطرة على microarrayer.
  5. يتم التحكم في الرطوبة للغرفة الطباعة تصل إلى 60٪ لمنع تبخر العينة.
  6. بدء مهمة الطباعة باستخدام LabNEXT softwaوإعادة البرنامج الذي يتوافق مع تخطيط ميكروأري.
  7. يستخدم الروبوت الدبابيس الموجودة في القناة الشعرية لطباعة الحلول من لوحة عينة على 20 × 20 سم غشاء النيتروسليلوز التي يتم تركيبها على لوحة مسطحة في الجهاز. كل بقعة على مجموعة يحتوي على 15 NL من الحل وتطبع في ثلاث نسخ.
  8. تطبع ميكروأرس متطابقة بجانب بعضها البعض على الغشاء وقطع في صفائف الفردية بعد اكتمال مهمة الطباعة.
  9. في كل تجربة يمكن أن يتم تعديل صفائف من أجل استيعاب العينات أكثر أو أقل، أو التخفيفات مكررات.

4. التحقيق ميكروأرس غليكان

  1. بعد الطباعة، منع ميكروأرس الفردية في 5٪ ث / ت مسحوق الحليب منزوع الدسم الذائب في الفوسفات مخزنة المالحة (MPBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لتقليل غير محددة ملزمة.
  2. ميكروأرس التحقيق مع الاجسام المضادة المحددة لجدار الخلية الحواتم لمدة 2 ساعة غليكان في MPBS. غالبية antib وحيدة النسيلةodies ضد جدار الخلية glycans متاحة تجاريا من ثلاث شركات؛ Biosupplies ( www.biosupplies.com.au )، Carbosource خدمات ( www.carbosource.net ) وPlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. وتشمل المراقبة السلبية، وحضنت مع ميكروأري MPBS فقط وليس الأجسام المضادة الأولية.
  4. غسل ميكروأرس 3 مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 5 دقائق لإزالة غير محددة وملزمة.
  5. بحث في ميكروأرس مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق لالبيروكسيديز الفجل (HRP) في MPBS لمدة 2 ساعة. الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد معظم glycans جدار الخلية تتطلب الأجسام المضادة الثانوية مكافحة الفئران الفأر أو المضادة.
  6. كرر الخطوات 3 مرات مع غسل العازلة PBS لمدة 5 دقائق لإزالة غير محددة وملزمة.
  7. تطوير ميكروأرس باستخدام مولد اللون (3،3-Diaminobenzidine) أو chemiluminecent (كسيماترين) ركائز.

5. تحديد الكمية

  1. بعد التنمية، مسح ميكروأرس الفردية باستخدام عالية الدقة (1،200 نقطة في البوصة) الماسح الضوئي سطح المكتب وحفظ الصور والسلبية، وملفات TIFF 16 بت (الشكل 3).
  2. حساب كثافة لا يتجزأ من كل بقعة باستخدام برامج معالجة الصور إكسبلور (LabNEXT) مزودة أداة الشبكة الآلي. مشتق من كثافة بقعة لا يتجزأ من مجموع بكسل في المنطقة المحيطة الشبكة كل بقعة.
  3. يتم تصدير البيانات الشبكة لكل ميكروأري كملف TXT ويمكن استيراد يدويا في جدول بيانات Excel للتحليل. أداة على الإنترنت ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ وقد تم تطوير) لترجمة ومعالجة البيانات تلقائيا من ملفات TXT الفردية.
  4. وبلغ متوسط ​​كثافة بقعة لا يتجزأ عبر طباعة نسخ متماثلة والتخفيفات للحصول على بقعة 'يعنيشدة 'قيمة كل عينة (الشكل 2). بدلا من ذلك، تستخدم إشارات بقعة القيمة المقابلة لتخفيف واحد فقط على مجموعة لتحديد حاتمة غليكان النسبية وفرة لكل عينة.
  5. وتعرض النسبي بين متوسط ​​كثافة بقعة عينات مختلفة باعتبارها heatmap (الشكل 4) باستخدام التنسيق الشرطي في Excel أو أدوات heatmapper عبر الإنترنت ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). يتم تصحيح البيانات لكل نوع الأجسام المضادة إلى 100 وتفرض قيمة قطع 5٪ لإزالة إشارة الخلفية وايجابيات كاذبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تحديد الوفرة النسبية للأنواع الأنسجة في glycans ستة (خيوط العضو الذكري، وحبوب اللقاح، المبايض، بتلات، كأسية ووصمة العار) من الزهور المجنح نيكوتيانا باستخدام CoMPP. الرقم 3A يظهر ميكروأري ممثل الذي تم بحثها مع محددة JIM5 ماب لhomogalacturonan (منخفض) جزئيا methylesterified (HG)، والذي يحدث على حاتمة السكريات بكتينية 14. يتم الكشف عن حاتمة JIM5 في مقتطفات من CDTA جميع أنسجة زهرة ولكن هو أعلى وأدنى في حبوب اللقاح في الأنسجة بغيض (3A الشكل و4A). ومن المثير للاهتمام، يتم الكشف أيضا حاتمة JIM5 في مقتطفات هيدروكسيد الصوديوم في حبوب اللقاح ولكن ليس في الأنسجة الأخرى. (الشكل 3A)

يتم الحصول على معلومات كمية عن وقوع غليكان الاهتمام من جانب بما في ذلك سلسلة من تنقية السكريات والمعايير الداخلية على ميكروأري (الشكل 3B). لا يتجزأ من كثافة بقعة مقتطفات من ر مختلفة يتم مطابقة القضايا وضعوا ماب JIM5 للإشارات بقعة مستمدة من التخفيف من المسلسل homogalacturonan (25٪ من درجة الأسترة الميثيل، DE). في أنسجة المبيض، كان قرابة 157 ميكروغرام من homogalacturonan يحتوي على حاتمة JIM5 موجودة في كل عينة، وهو ما يمثل حوالي 1.5٪ (بالوزن) من إجمالي المخلفات جدار الخلية (الشكل 3C). في حين كان 625 ميكروغرام homogalacturonan يحتوي على حاتمة JIM5 موجودة في الأنسجة حبوب اللقاح، وهو ما يمثل حوالي 6.25٪ (بالوزن) من إجمالي خلية بقايا الجدار.

وتتلخص الوفرة النسبية للالحواتم غليكان 15 بوصفه heatmap في الشكل 4 حيث كثافة لون القضبان يتناسب مع كثافة بقعة متوسط ​​المعدل لكل عينة. ويتضح أيضا من تمثيل التصويرية هذه البيانات في الشكل (5) ويسمح لنا بسرعة لتفسير الاختلافات في حدوث حاتمة غليكان بين الأنسجة زهرة مختلفة.

ontent "> نتائجنا تشير الى ان يتم توزيع فريد الفردية الحواتم غليكان بين الأنسجة N. زهرة المجنح. على سبيل المثال، حاتمة LM13 (linearised (1-5)-α-L-arabinan 15) هو الأكثر وفرة في خيوط وأنسجة العضو الذكري سيبال مقارنة الأنسجة الأخرى (الشكل 5D)، وهذا النمط هو على النقيض تماما من أن أقصر من سلسلة (1-5)-α-L-arabinan الحواتم الكشف عن تفضيلي من قبل ماب LM6 (الشكل 5E) 15. عبر ربط glycans أيضا متميزة أنماط الحدوث في الزهور المجنح N.. وحاتمة LM10 (منخفضة استبداله (1-4)-β-D-الزيلان) هو وفرة في الأنسجة صمة العار مقارنة الأنسجة الأخرى، ولكن غائب عن الأنسجة المبيض (الشكل 5G). LM15 الحواتم xyloglycan هي الأعلى في البتلة والعضو الذكري خيوط مقارنة الأنسجة الأخرى (الشكل 5H)، في حين heteromannans هي الأعلى في خيوط العضو الذكري (الشكل 5J).

: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. A مخطط تدفق مبسطة تمثل الخطوات الخمس الرئيسية لبوليمر ميكروأري الشامل التنميط (CoMPP).

الشكل 2
الشكل 2. مثال على الخطوات الرئيسية للبوليمر ميكروأري الشامل التنميط (CoMPP). (A) يتم جمع الأنسجة النباتية إلى ثلاثة مكررات، وغسلها المتجانس في EtOH 70٪ والأسيتون لجعل مخلفات غير قابلة للذوبان الكحول (AIR). (B) يتم استخراج بالتسلسل glycans جدار الخلية من عينات الهواء مع CDTA 50 مم و 4 هيدروكسيد الصوديوم M. (C) يتم طباعة المستخلصة glycans جدار الخلية على النيتروسليلوز باستخدام الروبوت ميكروأري. يتم تمثيل كل عينة في ثلاث تركيزات وعلى شكل سلسلة من طبق الطباعة 4قسم التدريب والامتحانات. (D) والمصفوفات وبحث مطبوعة على حدة مع MABS الموجهة إلى الخلية الحواتم glycans الجدار. (E) وكميا باستخدام الإشارات بقعة ميكروأري التصوير البرامج وتصديرها كملفات TXT والنسبية كثافة بقعة القيم المتوسطة وتحسب تلقائيا باستخدام معالجة البيانات عبر الإنترنت أداة.

الشكل 3
التنميط الرقم غليكان 3. من الأنسجة نيكوتيانا زهرة المجنح. يشار إلى (A) A ميكروأري ممثل وضعوا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MAB) JIM5 محددة لhomogalacturonan (جزئيا، methylesterification الأقل) يعتبر شيئا سلبيا، TIFF ملف 16 بت. يمكن (B) أن يحدد حجم السكاريد يحتوي على حاتمة غليكان من الفائدة عن طريق طباعة سلسلة من المعايير السكاريد. (C) بحث إمكانات متكاملة كثافة بقعة من عينة من الفائدة بمقدار ماب يتم احتساب JIM5 ومطابقة لمنحنى القياسية لتقدير كمية (ميكروغرام) من السكاريد تحتوي على هذا حاتمة في العينة.

الشكل 4
الشكل 4. يمثل غليكان التنميط من الأنسجة نيكوتيانا زهرة المجنح كما heatmap. كثافة اللون يتناسب مع نسبة متوسط ​​قيمة بقعة الهوية (شريط القياس). تم تحليل الوفرة النسبية للالحواتم 15 غليكان الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (المذكورة في الأعلى) لأنواع الأنسجة 6 استخراج مع هيدروكسيد الصوديوم وCDTA (يسار الجانب). والحواتم غليكان تقع في ثلاث فئات واسعة من السكريات؛ pectins وعبر ربط glycans والبروتينات arabinogalactan (AGPS). لي، ميثيل الأسترة؛ DP، ودرجة البلمرة؛ ماب، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة، AGP، arabinogalactan البروتين.

SS = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 5
يمثل الشكل 5. غليكان التنميط من الأنسجة نيكوتيانا زهرة المجنح بالصور. AL يمثل الوفرة النسبية للالحواتم 12 غليكان الكشف عنها بواسطة زهرة MABS في الأنسجة المختلفة. لون شريط مقياس كثافة يتناسب مع نسبة متوسط ​​قيمة بقعة الهوية المستمدة من هيدروكسيد الصوديوم أو مقتطفات CDTA أو مبلغ من كليهما. لي، ميثيل الأسترة؛ DP، ودرجة البلمرة؛ ماب، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة؛ AGP، arabinogalactan البروتين اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CoMPP هو وسيلة سريعة وحساسة للالتنميط تكوين غليكان مئات من العينات المستمدة من النباتات في غضون أيام. هذا الأسلوب يكمل المتاحة بالفعل البكتيرية أو الثدييات منصات لمجموعة غليكان الفرز الفائق الإنتاجية للتفاعلات الكربوهيدرات مع البروتينات غليكان ملزم مثل يكتينس، والمستقبلات، والأجسام المضادة 16. مع تنوع كبير من تحقيقات المتاحة للكشف عن glycans جدار الخلية، فمن الممكن الحصول على معلومات مفصلة حول الحواتم غليكان ينتمون إلى جميع فئات رئيسية من السكريات في جدار الخلية النباتية 8،9. ولكن هذه تشمل سوى نسبة صغيرة من الهياكل غليكان التي تم تحديدها 8،9، وفي بعض الظروف تحد من الشمول من CoMPP. ومع ذلك، تم مؤخرا تمديد هذه القدرة عن طريق استخدام وحدات الكربوهيدرات ملزم (تدابير بناء الثقة) ضد glycans مصنع 17، وأيضا ضد الحواتم تتميز غير غليكوزيل الدقةidues مثل الفينول 18 و 19 التي الاسيتيل بقايا مخلفات تعديل غليكوزيل وتلعب دورا هاما في وظيفة غليكان.

على الرغم من CoMPP يحدد المستويات النسبية للglycans عبر مجموعة من العينات، فمن الممكن لتحديد مستويات حاتمة في مقتطفات متتابعة من خلال مقارنة إشارة ملزمة في عينات محددة لهذا المعايير المعروفة (الشكل 3B وC). على الرغم من مزايا حجم العينة انخفاض في منصة ميكروأري القائم، يمكن أن تعوق القدرة على تحديد بدقة حدوث غليكان الاختلافات في بقعة التشكل أو تشبع إشارة الفور. هذه المشاكل (وكذلك ايجابيات كاذبة) يتم تجنبها عن طريق الاستفادة المثلى من مبلغ جدار الخلية مواد مستخلصة حجم الآيات، وذلك قبل التحليل، وبما في ذلك سلسلة من التخفيفات ويعيد على النحو المبين في الثدييات وهنا طرق مجموعة غليكان 16. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلافات في بقعة مورفولوجيا (الناجمة عن نشر عيناتويمكن التغلب على بمعدلات مختلفة من نقطة اتصال) باستخدام تكنولوجيا الاتصال غير ميكروأري الحبر النفاث 16.

ويستخدم في تركيبة CoMPP للإجراءات المعمول بها لعزل وإعداد جدران الخلايا 20. ويمكن أيضا أن تستخدم جنبا إلى جنب مع الأساليب القائمة، والكيمياء الحيوية الأنزيمية والمادية للحصول على مزيد من المعلومات حول محتوى غليكان في عينات من الفائدة. يمكن على سبيل المثال بدلا من استخراج البوليمرات السليلوزية، الخليك / المقايسات حامض النيتريك يمكن استخدام قياس 20 إلى المحتوى السليلوز (ملغ) المتبقية بعد استخراج متتابعة من البكتين وعبر ربط glycans مع هيدروكسيد الصوديوم وCDTA. يمكن العلاج الانزيم من 21 ميكروأرس غليكان تكشف أيضا اختلافات أخرى في توزيع حاتمة غليكان بين العينات، أو تأكيد خصوصية الهياكل الحواتم الكشف على ميكروأري. تحديد تكوين غليكان من التقنيات التحليلية مستقلة، مثل تلك التي وصفها مؤخرا

علينا أن نبرهن التي يتم توزيعها في glycans جهاز أو الأنسجة بطريقة محددة في N. الزهور المجنح. يمكن إعطاء هذه المعلومات التبصر في الوظيفة البيولوجية للغليكان الحواتم أو تجميع أو تعديل غليكان الانزيمات الموجودة في هذه أنواع مختلفة من الخلايا. قدمت سابقا CoMPP نظرة ثاقبة التعديلات جدار الخلية التي تحدث فيما يتعلق بزراعة نوع 22 خلال التنمية 23،24 أو استجابة لطفرة 10،25. وخلاصة القول، CoMPP هو أداة قيمة ل. دراسة دور ومتنوعة من glycans غليكان تجميع وتعديل الجينات في جدار الخلية النباتية

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وIEM يود أن يقر مجلس البحوث الدانمركية (FTP وFNU) للحصول على التمويل. ERL تعترف بدعم منحة DP ARC. AB يعترف بدعم من مركز التميز في ARC خلية النبات الجدران المنحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Tungsten Carbide beads Qiagen 69997
Collection microtubes (1.2 mm) Qiagen 19560 1.5 ml microfuge tubes can also be used
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85300
3 mm glass beads Sigma Aldrich Z143928
CDTA Sigma Aldrich 34588
Cadmium oxide Sigma Aldrich 202894
1,2-diamin–thane Sigma Aldrich 03550
Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) GE-water process technologies EP2HY00010 different pore sized membranes are suitable for different pin types
Xact II microarrayer robot Labnext 001A the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached
Xtend RM microarray pins Labnext 0037-350 pins must be suitable for spotting on membranes
384 well microtiter plates (polypropylene) Greiner 781207
Anti-glycan monoclonal antibodies Plant Probes/
CarboSource/Biosupplies
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au).
Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. Sigma A9037 the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc).
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets Sigma D4293 the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent).
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermoscientific 34080 see above
Xplore Image Processing Software LabNext 008 many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots.
Plant polysaccharides Sigma/Megazyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. Blackwell. 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6, (3), e17506 (2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. In Press (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54, (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats