कपाल mesenchyme की सेलुलर व्यवहार का आकलन के लिए एक Explant परख

Biology
 

Summary

कपाल mesenchyme प्रक्रिया नाटकीय morphogenic आंदोलनों की संभावना है कि तंत्रिका परतों के उन्नयन के लिए एक प्रेरणा शक्ति प्रदान करता है

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Sarkar, A. A., Zohn, I. E. An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme. J. Vis. Exp. (71), e4245, doi:10.3791/4245 (2013).

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Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र तंत्रिका प्लेट कि जटिल morphogenetic न्यूरल ट्यूब के एक neurulation के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में गठन में जिसके परिणामस्वरूप आंदोलनों की एक श्रृंखला की प्रक्रिया से ली गई है. Neurulation दौरान, mesenchyme कि तंत्रिका प्लेट underlies morphogenesis के लिए तंत्रिका गुना ऊंचाई ड्राइव करने के लिए माना जाता है. कपाल mesenchyme paraxial mesoderm और तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के शामिल है. कपाल mesenchyme प्रपत्र की कोशिकाओं एक pourous तारामय आकार की कोशिकाओं से बना है और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) किस्में है कि तंत्रिका परतों का समर्थन खुलेपन meshwork. Neurulation दौरान, कपाल mesenchyme टकसाली इसके विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप rearrangements आए और इन आंदोलनों के लिए तंत्रिका गुना ऊंचाई के लिए एक प्रेरणा शक्ति प्रदान करने के लिए माना जाता है. हालांकि, रास्ते और सेलुलर व्यवहार है कि कपाल mesenchyme morphogenesis ड्राइव खराब अध्ययन रहते हैं. ECM और कपाल mesenchyme underly thes की कोशिकाओं के बीच सहभागिताई सेल व्यवहार. यहाँ हम इन कोशिकाओं के व्यवहार को चिह्नित करने के लिए तैयार एक साधारण पूर्व vivo explant परख का वर्णन. इस परख औषधीय जोड़तोड़ संशोधनीय संकेत दे रास्ते शामिल हैं और रहते इमेजिंग विश्लेषण काटना करने के लिए आगे इन कोशिकाओं के व्यवहार की विशेषताएँ हैं. हम एक प्रतिनिधि ईसीएम घटकों की एक किस्म पर कपाल mesenchyme के प्रवासी गुण निस्र्पक में इस परख की उपयोगिता का प्रदर्शन प्रयोग उपस्थित थे.

Introduction

कपाल क्षेत्र में न्यूरल ट्यूब बंद भ्रूण दिन (E8.5) 8.5 और 9.5 माउस भ्रूण के बीच होता है. विफलता ठीक से सिर परिणामों में anencephaly, एक आम मानव में संरचनात्मक जन्म दोष में न्यूरल ट्यूब और करीब जीवन के साथ असंगत है. बलों है कि मस्तक न्यूरल ट्यूब बंद ड्राइव दोनों ही तंत्रिका ऊतक और आसपास के epidermis और 3 mesenchyme से उत्पन्न कर रहे हैं. कपाल mesenchyme की विशेष विस्तार में कपाल तंत्रिका सिलवटों 1,2 के उन्नयन के लिए आवश्यक माना जाता है. कपाल mesenchyme हेपरिन सल्फेट proteoglycans, chondroitin sulfates और Hyaluronate 4-8 के रूप में विशेष ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन में ECM प्रोटीन में समृद्ध है.

चिकन भ्रूण जहां तंत्रिका शिखा कोशिकाओं न्यूरल ट्यूब बंद होने के बाद पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से बसने में विपरीत, माउस भ्रूण में तंत्रिका शिखा एक ही समय में migrates है कि तंत्रिका सिलवटों अनुसंधान करने के लिए शुरूise (5 कायखंड चरण के बाद). इस प्रकार माउस भ्रूण में neurulation के दौरान, कपाल mesenchyme तंत्रिका शिखा और paraxial mesoderm से निकाली गई कोशिकाओं से बना है. तंत्रिका शिखा और paraxial mesoderm आबादी विकास में अलग अलग समय पर प्रेरित कर रहे हैं, भ्रूण में विभिन्न स्थानों में स्थानीय और अलग 9,10 संरचनाओं में विकसित करना. paraxial mesoderm आदिम लकीर से निकलती है और भ्रूण के पूर्वकाल क्षेत्र प्रकल्पित तंत्रिका प्लेट आबाद करने के लिए migrates. तंत्रिका शिखा तंत्रिका प्लेट और epidermal बाहरी झिल्ली के जंक्शन पर प्रेरित किया जाता है, एक संक्रमण mesenchyme उपकला आए और सिर्फ कृंतक भ्रूण में तंत्रिका गुना ऊंचाई से पहले delaminates. तंत्रिका शिखा कोशिकाओं गिल चाप, ललाटनासास्थिक और periocular mesenchyme subectodermal paraxial mesoderm में stereotypic रास्तों साथ विस्थापित. paraxial mesoderm खोपड़ी वॉल्ट और चेहरे की मांसपेशियों की हड्डियों में से कुछ के लिए योगदान देगा, जबकि वेंई तंत्रिका शिखा कपाल 9-11 नसों के अलावा खोपड़ी और चेहरे के अन्य हड्डियों के लिए योगदान देगा. paraxial mesoderm और तंत्रिका शिखा प्रजातियों विभिन्न Mesp1 - रचनात्मक और Wnt1 रचनात्मक ट्रांसजेनिक माउस लाइनों, क्रमशः 9 द्वारा चिह्नित किया जा सकता है.

न्यूरल ट्यूब बंद करने में कपाल mesenchyme की अनिवार्य भूमिका प्रयोगों से inferred किया गया है जहां ईसीएम में खलल न डालें बिगड़ा neurulation तंत्रिका ट्यूब 7 बंद करने के दौरान hyaluronidase chondroitinase एबीसी, heparitinase या Diazo-oxo-norleucine (डॉन) के रूप में इस तरह के एजेंटों के साथ कृंतक भ्रूण के उपचार, 12-14. इन प्रयोगों में, स्थिर वर्गों के histological neurulation विश्लेषण के बाद की कपाल mesenchyme 7,12-14 जुड़े dysmorphogeneis का पता चला. हालांकि, बाद teratogenic एजेंट कई ऊतकों को उपयोग किया था, यह निर्धारित किया जाना बना रहता है अगर कपाल mesenchyme वास्तव में लक्ष्य ऊतक है. निष्कर्ष के समर्थन में है कि इस ऊतकneurulation के लिए आवश्यक है, कपाल mesenchyme कुछ माउस म्यूटेंट में 15-17 exencephaly histological विश्लेषण पर असामान्य प्रतीत होता है. फिर भी, ज्यादातर मामलों में, कपाल mesenchyme की सेलुलर व्यवहार पर उत्परिवर्तन के प्रभाव को संबोधित किया गया नहीं किया गया है.

हम एक पूर्व vivo explant सीधे आनुवंशिक या कपाल mesenchyme 15 कोशिकाओं के व्यवहार पर औषधीय हेरफेर उत्परिवर्तन के परिणाम की जांच परख करने के लिए तैयार कर लिया है. इस परख कि एट 2003 Tzahor अल द्वारा प्रकाशित कपाल mesenchyme के भेदभाव क्षमता का उपयोग करने के लिए इसी तरह की है कि underlies सभी 18 rhombomeres को छोड़कर हम explant विच्छेदन को संशोधित किया है कपाल mesenchyme की अधिक पूर्वकाल आबादी के प्रवासी गुणों का अध्ययन है कि तंत्रिका पूर्वकाल आबाद थाली. हमारी विधि भी explant assays के एक संशोधन चिकन भ्रूण में प्रदर्शन के साथ तंत्रिका शिखा के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण हैy मतभेद. पिछला तैयारी तंत्रिका शिखा या अधिक पीछे paraxial mesoderm 19,20 explanted है. इसके अलावा, चिकन भ्रूण में तंत्रिका गुना ऊंचाई के दौरान, तंत्रिका शिखा अभी तक पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से emigrated गया है और इस प्रकार पूर्वकाल paraxial mesoderm लिया explants तंत्रिका शिखा कोशिकाओं नहीं शामिल होगा. हमारे परख में, कपाल mesenchyme paraxial mesoderm, तंत्रिका शिखा और सतह बाह्य त्वक स्तर के निर्वाचकगण explants तैयार कर रहे हैं एक सब्सट्रेट पर चढ़ाया. आनुवंशिक म्यूटेंट से explants के अलगाव, अलग ECM या औषधीय उपचार पर explants चढ़ाना सहित प्रायोगिक हेरफेर किया जा सकता है. Explant और दूरी, संख्या और व्यवहार से विस्थापित कोशिकाओं और विश्लेषण किया जा सकता है उपचार समूहों के बीच तुलना में. इसके अलावा, इस तैयारी रहते इमेजिंग तकनीक से विश्लेषण करने के लिए सेलुलर प्रवास के संशोधनीय है. माइग्रेशन प्रयोग के बाद, explants और तय किया जा सकता है फर के लिए immunohistochemical विश्लेषण करने के लिए किया जाता हैवहाँ उपचार के प्रभाव को स्पष्ट. कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक साधारण पूर्व vivo कपाल mesenchyme के व्यवहार की जांच परख है. एक प्रतिनिधि के प्रयोग के रूप में, हम इस परख का उपयोग करने के लिए विभिन्न कोशिकी substrates पर कपाल mesenchyme के प्रवास की जांच.

Protocol

1. ईसीएम लेपित संस्कृति व्यंजन या Coverslips की तैयारी

  1. पीबीएस में ECM सब्सट्रेट (है Dulbecco Saline Invitrogen, 14040-133 # फास्फेट बफर) भंग ECM स्टॉक समाधान तैयार. एक 0.2 मिमी सिरिंज (VWR, 28145-495 #) फिल्टर और aliquots में फ्रीज -80 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर फ़िल्टर
  2. ईसीएम शेयर पीबीएस में वांछित एकाग्रता समाधान पतला. MaxGel लिए, DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, Invitrogen, 11,995-065 #) में पतला.
  3. यदि immunofluorescence प्रदर्शन किया जाएगा, इथेनॉल में सूई से 12 मिमी परिपत्र कांच coverslips (VWR, 89015-724 #) बाँझ और शुष्क हवा देते हैं. इस बाँझ पर्णदलीय हुड में किया जाना चाहिए. यदि immunofluorescence प्रदर्शन नहीं किया जाएगा 1.5 कदम को छोड़.
  4. एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में coverslips निष्फल (Corning, ३५२६ #).
  5. 24 अच्छी तरह से और 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते की एक अच्छी तरह से पतला सब्सट्रेट समाधान की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. ECM समाधान Aspirate और thre धो लोपीबीएस में ई बार.
  7. पीबीएस Aspirate और तुरंत का उपयोग करें या parafilm में लिपटे और 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के लिए करने के लिए 2 सप्ताह के लिए संग्रहीत.

2. विच्छेदन उपकरण तैयार

लकड़ी का कोयला के साथ जोड़ा Sylgard प्लेटें निर्माण प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार कर रहे हैं. इन प्लेटों की प्रतिरोधी काले रंग की पृष्ठभूमि नीचे भ्रूण लगाए और रंग अच्छा विपरीत जो पारदर्शी भ्रूण visualizing की सुविधा प्रदान करता है के लिए सहायता प्रदान करता है.

  1. प्लेटों तैयार सीधे एक बीकर में त्रिकोणीय डालना शेष 150 ग्राम भाग एक तरल 15 ग्राम भाग बी और 1 ग्राम चारकोल पाउडर (विश्व प्रेसिजन उपकरण, SYLG184 #) पर तौलना. एक लकड़ी popsicle छड़ी या जीभ कष्टकारक का उपयोग करते हुए एक साथ मिक्स. कांच या प्लास्टिक 100 सेमी व्यंजन में डालो. कोई बुलबुले को जलाने के लिए रवाना व्यंजन के ऊपर 10 से 12 इंच के बारे में आयोजित एक छोटे ब्यूटेन मशाल का उपयोग करें. प्लेटों पर जगह lids और सेट करने के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए बैठते हैं.
  2. एक Minutien पिन डालने विच्छेदन उपकरण तैयार (0.1 मिमी diameteएक पिन धारक (ठीक वैज्ञानिक उपकरण, 26002-10 और # 26018-17, क्रमशः) वैकल्पिक रूप से 26 गेज (बी, 309,597 #) सुई संदंश की सहायता के साथ सही कोण पर तुला में r) विदारक उपकरणों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. बढ़ाई छात्र Dumont 5 (ललित विज्ञान उपकरण, 91150-20 #) संदंश एक पत्थर sharpening (ठीक वैज्ञानिक उपकरण, 29008-22 #) का उपयोग कर.
  3. विच्छेदन उपकरण का उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ जीवाणुरहित.

3. भ्रूण का संग्रह

  1. 8.5 दिनों के बाद में coitum पशु उपयोग के समिति के नियमों के अनुसार समय समाप्त हो गर्भवती माउस और euthanize गर्भाशय निकालना.
  2. बाँझ पीबीएस के साथ एक प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें गर्भाशय.
  3. गर्भाशय एक बार से धोओ बाँझ पीबीएस के साथ.
  4. एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत ध्यान संदंश की एक जोड़ी का उपयोग deciduas से भ्रूण को हटा दें.
  5. Extraembryonic झिल्ली निकालें और जीनोटाइपिंग अगर जरूरत के लिए बचाने के.
  6. स्टेज भ्रूण somites गिनती. आदर्श चरणों explants सेलुलर beh का विश्लेषण करने के लिए बनाने के लिएतंत्रिका गुना ऊंचाई दौरान avior 6 और 10 विखंड चरणों जब तंत्रिका सिलवटों सिर्फ तरक्की की शुरुआत कर रहे हैं और पहले कपाल mesenchyme के प्रमुख morphogenesis जगह लेता के बीच होगा.
  7. पीबीएस में भ्रूण धो लें. DMEM के साथ एक काला sylgard थाली है कि कोई phenol लाल (Invitrogen, 21063-029 #) में रखें. Extraembryonic झिल्ली निकालें और जीनोटाइपिंग अगर जरूरत के लिए बचाने के.

4. Explants की तैयारी

  1. भ्रूण के सिर क्षेत्र पर उच्चतम संभव बढ़ाई खुर्दबीन Refocus.
  2. प्रत्येक हाथ में एक विच्छेदन सुई के साथ कटौती करें. एक सुई का प्रयोग करने के लिए जगह में ऊतक और कटौती करने के लिए दूसरे को पकड़.
  3. Rhombomeres लिए पूर्वकाल भ्रूण के सिर काट.
  4. Midline साथ काटें दो बराबर हिस्सों में सिर द्विविभाजित.
  5. सिर और midline के बाहरी किनारे के आसपास काटें. ये कटौती बाहरी सीमा पर premigratory शिखा और सतह बाहरी झिल्ली को दूर करेगा औरपर midline prechordal थाली. शेष ऊतक explant और ओर पलायन कपाल तंत्रिका शिखा, paraxial mesoderm और सतह बाह्य त्वक स्तर शामिल होगा.
  6. ऊतक के रूप में कट जाता है, एक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग पकवान से dissected मलबा हटाने. यह dissected मलबे के साथ explant भ्रमित रोकता है.
  7. धीरे से एक 20 μl विंदुक टिप और pipetman के साथ और नीचे pipeting explant धो लो. यह शिथिल संलग्न कोशिकाओं को हटाने और explants पर दांतेदार किनारों को रोकने जाएगा.
  8. ध्यान एक 20 μl विंदुक टिप और pipetman और अच्छी तरह से लेपित संस्कृति के केंद्र में जगह का उपयोग कर तरल के लगभग 10 μl में प्रत्येक explant उठाओ.
  9. संस्कृति explant को कवर करने के लिए 15% FBS के साथ पूरक मीडिया के 20 μl जोड़ें.
  10. एक humidified 1-2 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (5% 2 सीओ, 37 डिग्री सेल्सियस) में जगह प्लेट explant पकवान के नीचे करने के लिए करने की अनुमति देते हैं. समय - समय पर देखें करने के लिए सुनिश्चित करें कि explant सूखी नहींबाहर.
  11. जब explant संलग्न है, ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से 250 μl 10% FBS के साथ पूरक DMEM कि 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में गरम है. एक बार explants संलग्न है वे जब प्लेट खुर्दबीन के नीचे धीरे हिल रहा है कदम नहीं होगा.
  12. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में पकवान लौटें.
  13. 24 घंटे के बाद, explants मजबूती से जुड़ी कोशिकाओं को उत्प्रवास करने के लिए शुरू हो जाएगा. इस समय औषधीय एजेंटों मीडिया में जोड़ा जा सकता है.
  14. चढ़ाना के बाद 48 घंटा, कोशिकाओं explants से चले गए. माइग्रेट दूरी visualized और imaged किया जा सकता है. आम तौर पर हम इस बिंदु पर संस्कृति को रोकने के बाद explants अब incubations साथ कम व्यवहार्यता के लक्षण दिखाने शुरू करते हैं. एक महत्वपूर्ण acridine नारंगी या trypan नीले के रूप में इस तरह के दाग भी explant की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  15. इस बिंदु पर छवियों दूरी और कोशिकाओं की संख्या कि explant से विस्थापित दस्तावेज़ प्राप्त किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, अगर explants coverslips पर चढ़ाया गया था,और वे तय किया जा सकता immunohistochemical विश्लेषण करने के लिए ब्याज की प्रोटीन कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया.

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम

  1. लगभग एक ही आकार के explants कट.
  2. विदारक थाली से सभी साफ़ विच्छेदन मलबे के रूप में आप वांछित explanted ऊतक के साथ भ्रमित मलबे से बचने विदारक रहे हैं.
  3. जब कुओं में या coverslips पर चढ़ाना explants explant के साथ अच्छी तरह से केंद्र में मीडिया की छोटी बूंद जगह सुनिश्चित हो.
  4. पर्याप्त समय explant मीडिया के साथ अच्छी तरह से बाढ़ से पहले देते अनुमति दें.
  5. उपचार शर्तों हर परीक्षा सब्सट्रेट और औषधीय एजेंट इस्तेमाल के लिए मानकीकृत किया जाना चाहिए.
  6. दो explants प्रत्येक भ्रूण से बनाया जा सकता है (बाएं से और एक एक न्यूरल ट्यूब के अधिकार से).
  7. जब उत्परिवर्ती माउस लाइनों से प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन विभिन्न कोशिकाओं के प्रवास परीक्षण, इलाज समूह में एक नियंत्रण समूह में उत्परिवर्ती explant और अन्य डाल दिया.

समस्या निवारण

  1. यदि explants करने के लिए देते हैं विफल, लगाव के लिए आवंटित समय में वृद्धि हुई है. हमारे अनुभव में, explants के लगभग आधे देते हैं और नहीं बड़ा explants और अधिक कुशलता से पालन करना है.
  2. यदि explants अच्छी तरह से की परिधि के लिए देते हैं वे छवि के लिए मुश्किल हो जाएगा. अच्छी तरह से केंद्र में explants जगह सुनिश्चित.
  3. आदर्श रूप में explants लगभग एक ही आकार का हो जाएगा. हालांकि, explant आकार में विसंगतियों explants के व्यास का उपयोग कर एक सुधार कारक के रूप में जब explants से कोशिकाओं की migrations quanitating के लिए सही किया जा सकता है.
  4. अगर प्रदूषण होता यकीन है कि बाँझ काम शर्तों इस्तेमाल किया जा रहा है. सभी उपकरण और 70% इथेनॉल के साथ काम की सतहों निष्फल किया जाना चाहिए. Pipets और पेट्री डिश नए और बाँझ होना चाहिए.
  5. यदि explants विच्छेदन के दौरान खो दिया हो रही है, समय समय पर मलबा हटाने explant खोने को रोकने के.
  6. माहिर विच्छेदन समय लगता है और अभ्यास लेता है. Optiबढ़ाई मल, तेज विच्छेदन उपकरण और सुइयों मदद.

Representative Results

कपाल mesenchyme explants से पलायन कोशिकाओं की उपस्थिति चित्रा 2 में दिखाया गया है. Laminin (100 मिलीग्राम / एमएल, सिग्मा L2020 #), MaxGel ईसीएम (DMEM में 1:500 कमजोर पड़ने, हम विभिन्न ECM substrates कि कपाल neurulation दौरान mesenchyme सहित Fibronectin (सिग्मा F1141 # 100 मिलीग्राम / एमएल) में मौजूद हैं पर प्रवास का परीक्षण किया सिग्मा, #) E0282 और Hyaluronic एसिड (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर, सिग्मा, 53,747 #). कोशिकाएं explant से माइग्रेट करने के असफल जब कोई ECM मौजूद है (नहीं दिखाया डेटा) और सभी substrates कोशिकाओं का समर्थित प्रवास का परीक्षण किया. दोनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आकार सब्सट्रेट कोशिकाओं है कि explants से विस्थापित की आकार पर निर्भर करता है. इस के रूप में पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि यांत्रिक विभिन्न ECM साथ कोशिकाओं की बातचीत के द्वारा उत्पन्न बलों दोनों और 21 कोशिकाओं के आकार प्रवासी गुण को प्रभावित होने की उम्मीद है.

चित्रा 1 चित्रा 1. (ए) explants की तैयारी explants तैयार करने के लिए., E8.5 भ्रूण deciduas और extraembryonic ऊतकों से विच्छेदित कर रहे हैं. (बी) भ्रूण सिर शरीर पूर्वकाल से rhombomeres dissected हैं. Explants midline और सिर के बाहरी किनारों से ऊतकों को हटाने और सीमा पर premigratory तंत्रिका शिखा और सतह बाह्य त्वक स्तर पर midline prechordal थाली हटा, क्रमशः द्वारा तैयार कर रहे हैं. (सी) explants सिर के midline और बाहरी किनारों से दूर ऊतक को काटने के लिए midline और तंत्रिका और सीमाओं पर सतह बाह्य त्वक स्तर शिखा premigratory में prechordal प्लेट हटाने से तैयार कर रहे हैं. (D) explants ईसीएम लेपित व्यंजन / coverslips पर मीडिया की एक छोटी मात्रा में रखा जाता है और अधिक मीडिया के अलावा पहले संलग्न करने की अनुमति दी.

चित्रा 2
चित्रा 2. विभिन्न substrates पर चढ़ाया explants से कपाल mesenchyme कोशिकाओं के प्रवासन. Explants Fibronectin, laminin, MaxGel ईसीएम या Hyaluronic एसिड पर चढ़ाया गया और संस्कृति में 48 घंटे के बाद फोटो खिंचवाने. साइज बार = 200 मिमी.

Discussion

यहाँ लागू विधि कपाल mesenchyme कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली परख प्रदान करता है. स्थैतिक यहाँ प्रस्तुत विश्लेषण करने के लिए इसके अलावा, उज्ज्वल क्षेत्र में या संयोजन में GFP-लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ इमेजिंग प्रयोगों जीने के लिए वास्तविक समय में कोशिकाओं के व्यवहार की जांच के रूप में वे explant से विस्थापित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए, explants DiI साथ लेबल किया जा सकता है या paraxial mesoderm, रोजा YFP से तंत्रिका शिखा के प्रवास अंतर Mesp1 - रचनात्मक या रोजा - YFP; Wnt1 - रचनात्मक या अन्य ट्रांसजेनिक लाइनों इस्तेमाल किया जा सकता है. कपाल mesenchyme ECM बातचीत भी इस explant परख के उपयोग की जांच की जा सकता है. यहाँ हम अलग ECM substrates है कि कपाल mesenchyme में मौजूद पता चलता है कि कोशिकाओं के विभिन्न डिग्री के लिए इन पर विस्थापित ईसीएम कोशिकाओं की आकारिकी प्रभावित कर रहे हैं पर थाली explants. इसके अलावा, एक तीन आयामी मैट्रिक्स में explants एम्बेड किया जा सकता है cel के व्यवहार का उपयोगइस संदर्भ में रास. यह explant कपाल mesenchyme के लिए आंतरिक और बाह्य संकेत है कि विनियमित और प्रवास को संशोधित कर सकते हैं का विश्लेषण व्यवहार पर आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए संशोधनीय परख है. उदाहरण के लिए, हम अपने अध्ययन में इस परख का उपयोग Hectd1 उत्परिवर्ती कपाल 15 mesenchyme में असामान्य सेलुलर व्यवहार में अतिरिक्त Hsp90 स्राव की भूमिका विचार. इन प्रयोगों में, हम विरोधी Hsp90 एंटीबॉडी के साथ explants Hsp90 प्रोटीन, geldanamycin और डीएमए (डाइमिथाइल amelioride) का इलाज किया Hsp90 के स्राव को दिखाना है कि Hectd1 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के असामान्य व्यवहार के कारण अतिरिक्त कोशिकी Hsp90 15 है ब्लॉक. समान दृष्टिकोण pharmacologically अतिरिक्त कपाल mesenchyme के सामान्य या असामान्य morphogenesis अंतर्निहित रास्ते टुकड़े करना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक बार परख पूरा हो गया है, explants और पलायन कोशिकाओं तरीकों की एक मेजबान से विश्लेषण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, immunohistochemical विश्लेषण करती है गएक सेल आंदोलनों के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन का स्थानीयकरण की जांच करने के लिए नियोजित किया जा. Transcriptome विश्लेषण भी निर्धारित करने के लिए कैसे उपचार जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह तीन आयामों में मॉडल व्यवहार के रूप में वे vivo में घटित होता नहीं है. प्रोटोकॉल जहां explants फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में चिह्नित सेलुलर डिब्बों की अभिव्यक्ति के साथ एक तीन आयामी मैट्रिक्स (जैसे Matrigel) में एम्बेडेड रहे हैं की इस मुद्दे के समाधान के लिए आवश्यक संशोधन नियोजित किया जा सकता है. यहां तक कि अगर इन संशोधनों प्रदर्शन किया गया, आगे vivo में उन लोगों के साथ इस पूर्व vivo परख में देखा व्यवहार सहसंबंधी प्रयोगों के लिए आवश्यक होगा. अन्य सीमाओं statically महत्वपूर्ण डेटा उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए आवश्यक भ्रूण की बड़ी संख्या में शामिल हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, विच्छेदन अपेक्षाकृत सरल है, यह मास्टर करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

यह काम R01 HD058629 द्वारा IEZ समर्थित है

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