En Eksplantasjon Assay for å vurdere Cellular Behavior av Cranial mesenchyme

Biology
 

Summary

Cranial mesenchyme gjennomgår dramatiske morphogenic bevegelser som sannsynligvis gir en pådriver for heving av nevrale folder

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sarkar, A. A., Zohn, I. E. An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme. J. Vis. Exp. (71), e4245, doi:10.3791/4245 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sentralnervesystemet er avledet fra det nevrale plate som gjennomgår en serie av komplekse morfogenetisk bevegelser resulterer i dannelsen av nevralrøret i en prosess kjent som neurulation. Under neurulation, er morphogenesis av mesenchyme som ligger til grunn for nevrale plate antas å drive nevrale fold høyde. Cranial mesenchyme består av paraksiale mesoderm og neural crest cellene. Cellene i cranial mesenchyme danner en pourous meshwork består av stellate formede celler og intermingling ekstracellulære matrix (ECM) tilnærmingene som støtter de nevrale folder. Under neurulation gjennomgår cranial mesenchyme stereotype rearrangements resulterer i utvidelsen og disse bevegelsene antas å gi en pådriver for nevrale fold høyde. Men fortsatt trasé og cellulære atferd som driver cranial mesenchyme morphogenesis dårlig undersøkt. Interaksjoner mellom ECM og cellene i kraniale mesenchyme underliggende these celle atferd. Her beskriver vi en enkel ex vivo eksplantasjon assay utviklet for å karakterisere virkemåter for disse cellene. Denne analysen er amendable til farmakologiske manipulasjoner å dissekere signalveier involvert og sanntidsavbildning analyser til videre karakterisere oppførselen til disse cellene. Vi presenterer et representativt eksperiment demonstrerer nytten av denne analysen for å karakterisere den vandrende egenskaper kraniale mesenchyme på en rekke ECM komponenter.

Introduction

Nevralrøret nedleggelsen i skallen oppstår mellom embryonale dag 8,5 (E8.5) og 9,5 i musen embryo. Unnlatelse av å lukke nevralrøret i hodet resultatene i anencephaly, en felles strukturelle fødsel defekt hos mennesker og er uforenlig med liv. De kreftene som driver cephalica nevralrøret nedleggelse genereres fra både nervevev selv og omkringliggende epidermis og mesenchyme 3. Spesielt utvidelse av kraniale mesenchyme antas å være avgjørende for heving av den kraniale nevrale folder 1,2. Cranial mesenchyme er rik på ECM proteiner spesielt glykosylert proteiner som heparin sulfat proteoglykaner, chondroitin sulfater og Hyaluronate 4-8.

I motsetning til i kylling embryo der neural crest cellene emigrere fra dorsal nevralrøret etter neural tube nedleggelse, vandrer neural crest i musen embryo på samme tid som de nevrale folder begynner å rise (etter 5 somitt stadiet). Dermed under neurulation i mus embryo, er cranial mesenchyme består av celler avledet fra neural crest og paraksiale mesoderm. Neural crest og paraksiale mesoderm populasjoner er indusert på ulike tidspunkt i utviklingen, lokalisert i ulike posisjoner i embryo og utvikle seg til ulike strukturer 9,10. Den paraksiale mesoderm stammer fra primitive strek og vandrer til fremre delen av embryo til grunn for den presumptive nevrale plate. Neural crest er indusert ved krysset av nevrale plate og epidermal ektoderm, gjennomgår en epitelial å mesenchyme overgang og delaminates like før nevrale fold økning i gnager embryo. Neural crest cellene vandrer langs stereotype baner i subectodermal paraksiale mesoderm til branchial bue, frontonasal og periokulær mesenchyme. Den paraksiale mesoderm vil bidra til noen av beina i skallen hvelvet og muskler i ansiktet, mens the neural crest vil bidra til andre bein i hodeskallen og ansiktet i tillegg til kraniale nerver 9-11. Den paraksiale mesoderm og neural crest linjene kan forskjellig preget av Mesp1-cre og Wnt1-CRE transgene mus linjer, henholdsvis 9.

Avgjørende rolle av den kraniale mesenchyme i nevralrøret nedleggelsen er avledet fra forsøk hvor behandling av gnagere embryoer med ECM forstyrre agenter som hyaluronidase, kondroitinase ABC, heparitinase eller Diazo-oxo-norleucin (DON) under neurulation svekket neural tube nedleggelse 7, 12-14. I disse eksperimentene, avslørte Histologisk analyse av statiske deler etter neurulation knyttet dysmorphogeneis av cranial mesenchyme 7,12-14. Men siden teratogene agenten hadde tilgang til flere vev, gjenstår det å bli bestemt om den kraniale mesenchyme er virkelig målvevet. Til støtte for den konklusjon at dette veveter viktig for neurulation, vises cranial mesenchyme unormal på histologiske analyser i noen mus mutanter med eksencefali 15-17. Likevel, i de fleste tilfeller, har effekten av mutasjonen på cellenivå oppførsel av kraniale mesenchyme ikke blitt adressert.

Vi har utviklet en ex vivo eksplantering analysen til direkte undersøke konsekvensen av genetisk mutasjon eller farmakologisk manipulasjon på oppførselen kraniale mesenchyme celler 15. Denne analysen er lik som publisert av Tzahor et al 2003 for å få tilgang til differensiering potensialet i kraniale mesenchyme som ligger til grunn de rhombomeres 18 bortsett fra vi har endret eksplantering disseksjon å studere trekkende egenskapene flere fremre bestander av cranial mesenchyme som ligger til grunn anterior neural plate. Vår metode er også en modifikasjon av eksplantasjon assays utført i kylling embryo for å analysere trekkadferden av neural crest med key forskjeller. Tidligere forberedelsene har eksplantert neural crest eller mer posterior paraksiale mesoderm 19,20. Videre, under nevrale fold økning i kylling embryo, har neural crest ennå ikke emigrerte fra dorsal nevralrøret og dermed explants tatt av fremre paraksiale mesoderm ikke ville inneholde neural crest cellene. I analysen vår, er cranial mesenchyme explants bestående av paraksiale mesoderm, neural crest og overflate ektoderm forberedt og belagt på et substrat. Eksperimentell manipulasjon inkludert isolasjon av explants fra genetiske mutanter, plating explants på ulike ECM eller farmakologisk behandling kan utføres. Cellene vandrer fra eksplantering og avstand, antall og atferd kan analyseres og sammenlignes mellom behandlingsgruppene. I tillegg er dette preparatet amendable til analyser av cellulær migrasjon av levende avbildningsteknikker. Etter migreringen eksperimentet kan eksplanter være fast og utsettes for immunhistokjemiske analyser til pelsther belyse effekten av behandlinger. I det hele er protokollen som presenteres her en enkel ex vivo-forsøk for å undersøke oppførselen til kraniale mesenchyme. Som en representant eksperiment, bruker vi denne analysen for å undersøke migrasjon av cranial mesenchyme på ulike ekstracellulære underlag.

Protocol

1. Utarbeidelse av ECM Coated kultur retter eller dekkglass

  1. Forbered ECM stamoppløsning ved oppløsning ECM substrat i PBS (Dulbeccos fosfatbufret saltløsning, Invitrogen, # 14040-133). Filteret ved hjelp et 0,2 mm sprøytefilter (VWR, # 28145-495) og fryse i aliquoter ved -80 ° C.
  2. Fortynn ECM stamoppløsning i PBS til ønsket konsentrasjon. For MaxGel fortynnes i DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065).
  3. Hvis immunfluorescens vil bli utført, sterilisere 12 mm sirkulære glass dekkglass (VWR, # 89015-724) ved dypping i etanol og la det lufttørke. Dette bør gjøres i det sterile laminær hette. Hvis immunfluorescens ikke vil bli utført til trinn 1.5.
  4. Plass sterilisert dekkglass i hver brønn av en 24 brønners plate (Corning, # 3526).
  5. Tilsett 0,5 ml av fortynnet substratoppløsning til hver brønn av 24 brønn plate og inkuber ved romtemperatur i 3 timer.
  6. Aspirer av ECM-løsning og vask three ganger i PBS.
  7. Aspirer avslag PBS og brukes umiddelbart eller innpakket i parafilm og lagret ved 4 ° C i opptil 2 uker.

2. Utarbeidelse av Disseksjonsverktøyer

Sylgard plater med ekstra kull er forberedt per produksjon protokoll. Den resistente svart bakgrunn av disse platene gir støtte for låsing ned embryoet og fargen gir god kontrast som letter visualisere den gjennomskinnelige embryo.

  1. For å forberede platene veie direkte inn i en tri-pour beger på en balanse 150 g Del A væske 15 g del B og 1 g kull pulver (World Precision Instruments, # SYLG184). Bland sammen ved hjelp av en tre popsicle pinne eller tunge depressor. Hell i glass eller plast 100 cm retter. Bruk en liten butan lommelykt holdt ca 10 til 12 inches over rettene til å brenne av noen bobler. Sted lokk på platene og la sitte i minst 24 timer for å stille.
  2. Å forberede Disseksjonsverktøyer sette inn en Minutien pin (0,1 mm diameter) inn i en pinne holderen (fine vitenskapelige verktøy, # 26002-10 og # 26018-17, henholdsvis) alternativt 26 gauge nåler (BD, # 309597) bøyd i rett vinkel ved hjelp av tang kan brukes som dissekerende instrumenter. Skjerpet Student Dumont nr 5 Forceps (Fin Science Verktøy, # 91150-20) ved hjelp av en skjerping stein (Fin vitenskapelige verktøy, # 29008-22).
  3. Steriliser alle Disseksjonsverktøyer med 70% etanol før bruk.

3. Innsamling av embryo

  1. Avlive den tidsbestemte gravid mus på 8,5 dager etter coitum henhold til dyr bruk komité forskrifter og fjerne livmoren.
  2. Sted livmor i en plast petriskål med sterilt PBS.
  3. Vask livmor gang med sterilt PBS.
  4. Under en disseksjon mikroskop forsiktig fjerne embryo fra deciduas ved hjelp av en pinsett.
  5. Fjern extraembryonic membraner og lagre for genotyping hvis nødvendig.
  6. Embryo ved å telle somites. Den ideelle etapper for å gjøre explants å analysere cellulære BehAvior under nevrale fold høyde ville være mellom 6 og 10 somitt stadier når de nevrale folder er bare begynnelsen for å heve og før den store morphogenesis av den kraniale mesenchyme finner sted.
  7. Vask embryo i PBS. Plasser i en svart sylgard plate med DMEM som ikke inneholder fenolrødt (Invitrogen, # 21063-029). Fjern de extraembryonic membraner og lagre for genotyping hvis nødvendig.

4. Utarbeidelse av explants

  1. Refokusere mikroskopet på høyest mulig forstørrelse over hodet regionen i embryo.
  2. Gjøre kutt med en disseksjon nål i hver hånd. Bruk en nål til å holde vevet på plass og den andre til å gjøre kutt.
  3. Skjær av hodet av embryoet anterior til rhombomeres.
  4. Skjær langs midtlinjen å halvere hodet i to like halvdeler.
  5. Skjær rundt i yttergrensen av hodet og midtlinjen. Disse kuttene vil fjerne premigratory kam og overflate ektoderm på ytre grensen ogden prechordal plate ved midtlinjen. De resterende vev vil være eksplantering og vil inneholde den utvandrende cranial neural crest, paraksiale mesoderm og overflate ektoderm.
  6. Som vevet er kuttet, fjernes dissekert rusk fra rett med en steril Pasteur-pipette. Dette forhindrer forvirrende eksplantering med den dissekerte rusk.
  7. Forsiktig vaske eksplantering ved pipeting opp og ned med en 20 pl pipettespiss og Pipetman. Dette vil fjerne løst festet celler og forhindre ujevne kanter på explants.
  8. Nøye plukke opp hver eksplantasjon i omtrent 10 pl av væske ved hjelp av en 20 ul pipettespiss og Pipetman og sted i sentrum av den belagte kulturen godt.
  9. Tilsett 20 pl av dyrkningsmedier supplert med 15% FBS for å dekke eksplantasjon.
  10. Settes platen i en fuktet vevskultur inkubator (5% CO 2, 37 ° C) i 1-2 timer for å tillate at eksplantasjon å feste til bunnen av skålen. Vis periodisk for å sikre at eksplantasjon ikke tørkerut.
  11. Når eksplantasjon har festet, tilsett forsiktig til hver brønn 250 pl DMEM supplert med 10% FBS som har blitt oppvarmet til 37 ° C i et vannbad. Når explants har festet de ikke vil bevege seg når platen er forsiktig ristet under mikroskop.
  12. Returnere parabolen til vev kultur inkubator.
  13. Etter 24 timer vil explants være godt festet og celler vil begynne å emigrere. På denne tiden farmakologiske midler kan legges til media.
  14. 48 timer etter plating, vil cellene har migrert fra explants. Avstanden migrert kan visualiseres og avbildes. Vi vanligvis stoppe kultur på dette punktet siden eksplanter begynner å vise tegn på redusert levedyktighet med lengre inkubasjoner. En vital flekken eksempel akridin oransje eller Trypan blått kan også brukes til å kontrollere levedyktigheten til eksplantasjon.
  15. På dette punktet bilder kan bli kjøpt for å dokumentere avstand og antall celler som migrerer fra eksplantering. Alternativt var hvis explants belagt på dekkglass,de kan være fast og immunhistokjemiske analyser utføres for å visualisere proteiner av interesse.

Kritiske trinn i protokollen

  1. Skjær explants av noenlunde samme størrelse.
  2. Fjerne all disseksjon rusk av dissekere plate som du dissekere å unngå forvirrende rusk med ønsket eksplantert vev.
  3. Når plating explants i brønner eller på dekkglass sørg for å plassere dråpe media med eksplantering i sentrum av godt.
  4. Tillat eksplanterer tilstrekkelig tid til å feste før flom godt med media.
  5. Behandling forholdene bør være standardisert for hver test underlaget og farmakologisk agent brukes.
  6. To eksplanter kan gjøres fra hver embryo (en fra venstre og en fra høyre av nevralrøret).
  7. Når testing migrasjon av celler fra mutant mus linjer under forskjellige eksperimentelle betingelser, sette en mutant eksplantasjon i kontrollgruppen og den andre i den behandlede gruppen.

Feilsøking

  1. Hvis explants klarer å feste, øke den avsatte tiden for vedlegg. I vår erfaring, gjør omtrent halvparten av explants ikke feste og større explants følge mer effektivt.
  2. Hvis eksplanter feste til periferien av brønnen vil de være vanskelig å bilde. Sørg for å plassere explants i sentrum av brønnen.
  3. Ideelt explants vil være omtrent den samme størrelsen. Imidlertid kan variasjoner i eksplantasjon størrelsen bli korrigert for ved hjelp av diameteren av eksplanter som korreksjonsfaktor når quanitating vandringer av celler fra eksplanter.
  4. Hvis forurensning oppstår være sikker sterile arbeidsforhold blir brukt. Alle verktøy og arbeidsflater bør steriliseres med 70% etanol. Pipets og petriskåler bør være nytt og sterilt.
  5. Hvis explants blir tapt under disseksjon, periodevis fjerne rusk å unngå å miste eksplantering.
  6. Mastering disseksjon er tidkrevende og krever øvelse. Optimal forstørrelse, skarpe disseksjon verktøy og nåler hjelp.

Representative Results

Utseendet av celler migrerer fra cranial mesenchyme eksplanter er vist i figur 2. Vi testet migrasjon på ulike ECM underlag som er tilstede i den kraniale mesenchyme under neurulation inkludert Fibronektin (100 mg / ml; Sigma # F1141), laminin (100 mg / ml; Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 fortynning i DMEM ; Sigma # E0282) og hyaluronsyre (1 mg / ml; Sigma, # 53747). Celler ikke klarer å migrere fra eksplantasjon når ingen ECM er tilstede (Data ikke vist), og alle substrater testet støttet migrasjon av cellene. Både form så vel som størrelsen på cellene som vandrer fra eksplanter avhenger substratet. Dette er forventet som tidligere studier viser at de mekaniske kreftene som genereres av samspill av celler med forskjellig ECM påvirke både figuren og trekkende egenskaper av celler 21.

Figur 1 Figur 1. Utarbeidelse av explants. (A) For å forberede explants er E8.5 embryoer dissekert fra deciduas og extraembryonic vev. (B) Embryo hoder dissekeres fra kroppen anterior til rhombomeres. Eksplanter fremstilles ved å fjerne vev fra midtlinjen og den ytre kanten av hodet for å fjerne prechordal plate på midtlinjen og premigratory neural crest og overflate ektoderm på grensen, henholdsvis. (C) eksplanter fremstilles ved å skjære bort vev fra midtlinjen og ytre kantene av hodet for å fjerne prechordal plate på midtlinjen og premigratory neural crest og overflate ektoderm på grensene. (D) eksplanter er plassert i et lite volum av media på ECM belagte retter / dekkglass og tillatt å feste før tilsetning av flere medier.

Figur 2
Figur 2. Migrasjon av kraniale mesenchyme celler fra explants belagt på forskjellige underlag. Explants ble sådd ut på Fibronectin, Laminin, MaxGel ECM eller Hyaluronsyre og fotografert etter 48 timer i kultur. Størrelse bar = 200 mm.

Discussion

Metoden anvendt her gir en kraftig assay å undersøke oppførselen av kraniale mesenchyme celler. I tillegg til de statiske analysene som presenteres her, sanntidsavbildning eksperimenter i lyse felt eller i kombinasjon med ekspresjon av GFP-merkede proteiner kan anvendes for å undersøke de virkemåter for celler i sanntid som de migrerer fra eksplantasjon. For live bildebehandling eksperimenter, kan explants merkes med Dii eller å differensiere migrering av neural crest fra paraksiale mesoderm, ROSA-YFP; Mesp1-cre eller ROSA-YFP; Wnt1-cre eller andre transgene linjer kan brukes. Kraniale mesenchyme-ECM interaksjoner kan også bli undersøkt utnytte denne eksplantering analysen. Her vi plate eksplanter på ulike ECM substrater som er tilstede i den kraniale mesenchyme å vise at cellene vandrer på disse til forskjellige grader og at ECM påvirker morfologien av cellene. Videre kan explants være forankret i en tredimensjonal matrise for å få tilgang til atferd av cells i denne sammenheng. Dette eksplantering analysen er amendable til analyse av effekten av genetiske og farmakologiske manipulasjoner på cranial mesenchyme atferd å analysere indre og ytre signaler som kan regulere og endre migrasjon. For eksempel, benyttet vi denne analysen i våre studier for å skjelne rolle overflødig HSP90 sekresjon i de unormale cellene atferd i Hectd1 mutant cranial mesenchyme 15. I disse eksperimentene, behandlet vi eksplanter med anti-antistoff, HSP90 HSP90 protein, geldanamycin og DMA (dimetyl amelioride) for å blokkere utskillelse av HSP90 å demonstrere at den unormale oppførselen Hectd1 mutante celler skyldes overskytende ekstracellulær HSP90 15. Lignende tilnærminger kan brukes til farmakologisk dissekere ytterligere trasé underliggende normal eller unormal morphogenesis av den kraniale mesenchyme. Når analysen er fullført, kan eksplanter og migrerende celler bli analysert av en rekke metoder. For eksempel, immunhistokjemisk analyser cen brukes til å undersøke lokalisering av proteiner kritiske for celle bevegelser. Transkriptom analyser kan også brukes til å bestemme hvordan behandlinger påvirker genuttrykk.

Én betydelig begrensning av denne teknikken er at den ikke modell atferd i tre dimensjoner som de ville oppstå in vivo. Modifisering av protokollen der explants er innebygd i en tredimensjonal matrise (f.eks Matrigel) sammen med uttrykk av fluorescerende protein-merkede cellene kan være ansatt nødvendig for å løse dette problemet. Selv om disse modifikasjoner ble utført, ville ytterligere eksperimenter for å korrelere atferd sett i dette ex vivo-forsøk med de i vivo være nødvendig. Andre begrensninger omfatter det store antall embryoer som kreves for å generere et tilstrekkelig antall for å generere statisk betydelige data. Viktigst er disseksjon relativt enkel, krever det øvelse å mestre.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Dette arbeidet støttes av R01-HD058629 til IEZ

References

  1. Copp, A. J. Neurulation in the cranial region--normal and abnormal. Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).
  2. Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies. The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).
  3. Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. The genetic basis of mammalian neurulation. Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).
  4. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence. J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).
  5. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).
  6. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).
  7. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).
  8. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds. Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).
  9. Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme. Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).
  10. Noden, D. M., Trainor, P. A. Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations. Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).
  11. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).
  12. Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).
  13. Morriss-Kay, G., Tuckett, F. Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos. Development. 106-787 (1989).
  14. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation. Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).
  15. Sarkar, A. A., Zohn, I. E. Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme. The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).
  16. Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure. Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).
  17. Chen, Z. F., Behringer, R. R. Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis. Genes Dev. 9, 686-699 (1995).
  18. Tzahor, E., et al. Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle. Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).
  19. Lumsden, A. G. Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ. Development. 103, 155-169 (1988).
  20. Newgreen, D. Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin. Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).
  21. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics