Ett explantat analys för bedömning Cellular Beteende för Kranial mesenkym

Biology
 

Summary

Den kraniala mesenkym genomgår dramatiska morfogena rörelser som sannolikt ger en drivkraft för förhöjning av de neurala veck

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sarkar, A. A., Zohn, I. E. An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme. J. Vis. Exp. (71), e4245, doi:10.3791/4245 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det centrala nervsystemet är härledd från den neurala plattan som genomgår en serie komplexa morfogenetiska rörelser resulterar i bildning av det neurala röret i en process som kallas neurulation. Under neurulation är morfogenes av mesenkym bakom det neurala plattan tros driva neurala faldig ökning. Den kraniala mesenkym består av den paraxiella mesoderm och neurala celler crest. Cellerna i den kraniala mesenkym bildar en pourous nätverket som består av stellatceller formade celler och sammanblandning extracellulära matrix (ECM) strängar som stöder de neurala vikningarna. Under neurulation genomgår den kraniala mesenkym stereotypa omarrangemang resulterar i sin expansion och dessa rörelser tros ge en drivkraft för neurala faldig ökning. Dock fortsatt vägar och cellulära beteenden som driver kranial mesenkym morfogenes dåligt undersökta. Interaktioner mellan ECM och cellerna i de kraniala mesenkymceller underliggande These cell beteenden. Här beskriver vi en enkel ex-analys vivo explantat utformats för att karakterisera beteenden hos dessa celler. Denna analys är kan ändras till farmakologiska manipulationer för att dissekera signalvägar involverade och levande analyser bildbehandling för att ytterligare karakterisera beteendet hos dessa celler. Vi presenterar ett representativt experiment som visar användbarheten av denna analys för att karaktärisera de flyttande egenskaperna hos den kraniala mesenkymet på en variation av ECM-komponenter.

Introduction

Neuralrörsdefekter stängning i Skallparti sker mellan embryonala dag 8,5 (E8.5) och 9,5 i musembryo. Underlåtenhet att korrekt stänga neuralröret i huvudet resulterar i anencefali, en gemensam strukturell missbildning hos människor och är oförenlig med livet. De krafter som driver cefaliska neuralrörsdefekter stängning genereras från både nervvävnad själv och den omgivande epidermis och mesenkym 3. Särskilt expansion av den kraniala mesenkym tros vara väsentlig för förhöjning av den kraniala neurala veck 1,2. Den kraniala mesenkym är rik på ECM-proteiner i synnerhet glykosylerade proteiner såsom heparinsulfat proteoglykaner, kondroitin sulfater och hyaluronat 4-8.

Till skillnad från i kycklingembryo där neurala crest celler emigrera från den dorsala neuralröret efter neuralröret stängning, migrerar den neurallisten i musembryo samtidigt som de neurala vikningarna börjar rIse (efter 5 somit stadiet). Sålunda under neurulation i musembryo, den kraniala mesenkym består av celler härledda från neurallisten och paraxiella mesoderm. Neurallisten och axelparallella populationer mesoderm induceras vid olika tidpunkter i utvecklingen, lokaliserade i olika positioner i embryot och utvecklas till olika strukturer 9,10. Den paraxiella mesoderm härstammar från primitivstrimman och migrerar till den främre regionen av embryot för att ligga den presumtiva neurala plattan. Neurallisten induceras vid korsningen av den neurala plattan och epidermal ektoderm, undergår en epitelial att mesenkym övergång och delamineras just före neurala faldig förhöjning i gnagare embryot. Neurallist celler migrerar längs stereotypa banor i subectodermal paraxiella mesoderm till brankiala bågen, frontonasal och periokulär mesenkym. Den paraxiella mesoderm kommer att bidra till en del av skallben valv och musklerna i ansiktet, medan the neurallisten kommer att bidra till andra ben i skallen och ansiktet förutom kranialnerver 9-11. Den paraxiella mesoderm och neurala linjer crest kan differentiellt präglas av Mesp1-cre och Wnt1-Cre transgena linjer mus respektive 9.

Den väsentliga roll kraniala mesenkym i neuralrörsdefekter förslutningen har framgår av experiment där behandling av gnagare embryon med ECM störa såsom hyaluronidas, kondroitinas ABC, heparitinas eller Diazo-oxo-norleucin (DON) under neurulation nedsatt neuralrörsdefekter stängning 7, 12-14. I dessa experiment visade histologisk analys av statiska delar efter neurulation tillhörande dysmorphogeneis av den kraniala mesenkym 7,12-14. Eftersom den teratogena agenten hade tillgång till flera vävnader, återstår det att bestämmas om den kraniala mesenkym verkligen målvävnaden. Till stöd för slutsatsen att denna vävnadär viktigt för neurulation visas kraniala mesenkym onormala på histologiska analyser i vissa mus mutanter med exencefali 15-17. Fortfarande, i de flesta fall, har effekten av mutationen på den cellulära beteende kraniala mesenkym inte åtgärdats.

Vi har utarbetat en ex-analys vivo explantation att direkt undersöka konsekvensen av genetisk mutation eller farmakologisk manipulation på beteendet hos kraniala mesenkymceller 15. Denna analys liknar det som publicerats av Tzahor et al 2003 för att komma åt differentiering potential kraniala mesenkym som ligger bakom rhombomeres 18 förutom att vi har ändrat explantatet dissektionen att studera flyttande egenskaper mera främre populationer av kranial mesenkym som ligger bakom främre neurala platta. Vår metod är också en modifikation av explantation analyser utförs i kycklingembryo att analysera migrerande beteende neurallisten med key skillnader. Tidigare förberedelser har explanterade neurala krön eller mer bakre axelparallellt mesoderm 19,20. Dessutom, under neurala faldig ökning av kyckling embryot har neurallisten ännu inte emigrerade från den dorsala neuralröret och därmed explantat tagna av den främre axelparallellt mesoderm inte skulle innehålla neurala crest celler. I vår analys, är kraniala mesenkymceller explantat bestående av axelparallellt mesoderm, neurallisten och yta ektoderm framställdes och ströks ut på ett substrat. Experimentell manipulering inklusive isolering av explantat från genetiska mutanter, plätering explantat på olika ECM eller farmakologiska behandlingar kan utföras. Celler migrerar från explantatet och avståndet, antal och beteende kan analyseras och jämföras mellan behandlingsgrupperna. Dessutom är denna beredning kan ändras för analyser av cellulär migrering av levande avbildningstekniker. Efter migreringen experiment kan explantat fixeras och utsättas för immunhistokemiska analyser pälsther belysa effekten av behandlingar. På det hela taget är det protokoll som presenteras här en enkel ex vivo för att undersöka beteendet hos den kraniala mesenkym. Som ett representativt experiment, använder vi denna analys för att undersöka migration av kraniala mesenkym på olika extracellulära substrat.

Protocol

1. Beredning av ECM Coated odlingsplattor eller täckglas

  1. Bered ECM förrådslösning genom upplösning ECM substrat i PBS (Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning, Invitrogen, # 14.040-133). Filtrera genom ett 0,2 filter mm spruta (VWR, # 28.145-495) och frys i alikvoter vid -80 ° C.
  2. Späd ECM stamlösning i PBS till önskad koncentration. För MaxGel, späd i DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11.995-065).
  3. Om immunofluorescens kommer att utföras, sterilisera 12 mm cirkulära täckglas (VWR, # 89.015-724) genom doppning i etanol och låt lufttorka. Detta bör göras i den sterila laminärt huven. Om immunofluorescens inte kommer att utföras till steg 1,5.
  4. Placera steriliserade täckglas i varje brunn i en 24 brunnsplatta (Corning, # 3526).
  5. Tillsätt 0,5 ml av utspädd substratlösning till varje brunn av 24 brunnsplatta och inkubera vid rumstemperatur under 3 timmar.
  6. Sug bort ECM-lösning och tvätta three gånger i PBS.
  7. Aspirera av PBS och använd omedelbart eller förpackat i parafilm och förvarades vid 4 ° C i upp till 2 veckor.

2. Beredning av Dissektionsverktyg Verktyg

Sylgard plattor med tillsats kol bereds per tillverkningen protokoll. Den resistenta svart bakgrund av dessa plattor stöder sätter ned embryot och färgen ger god kontrast som underlättar visualisering den genomskinliga embryot.

  1. Att förbereda plattor väger direkt in i en tri-pour bägare på en balans 150 g Del A flytande 15 g del B och 1 g kol pulver (World precisionsinstrument, # SYLG184). Blanda ihop med en trä Popsicle pinne eller tungspatel. Häll i glas eller plast 100 rätter cm. Använd en liten butan brännare hålls cirka 10 till 12 inches ovanför rätter att bränna bort eventuella bubblor. Placera lock på plattor och låt sitta i minst 24 timmar för att ställa in.
  2. För att förbereda dissekering verktyg insats en Minutien stift (0,1 mm diameter) i ett stift hållare (Fine vetenskapliga verktyg, # 26.002-10 och # 26.018-17 respektive) alternativt 26 nålar (BD, # 309.597) böjda i rät vinkel med hjälp av tång kan användas som dissekera instrument. Vässade Student Dumont # 5 Tång (Fine Science Tools, # 91.150-20) med en slipsten (Fine vetenskapliga verktyg, # 29.008-22).
  3. Sterilisera alla dissektion verktyg med 70% etanol före användning.

3. Insamling av embryon

  1. Avliva den tidsinställda gravida musen på 8,5 dagar efter coitum enligt djuranvändning kommitté regler och ta bort livmodern.
  2. Placera livmodern i en plast petriskål med steril PBS.
  3. Tvätta livmodern gång med steril PBS.
  4. Under ett dissektion mikroskop försiktigt bort embryot från deciduas med en pincett.
  5. Ta extraembryonic membran och spara för genotypning om det behövs.
  6. Embryo genom att räkna somiter. Den idealiska stegen för att göra explantat att analysera cellulär behAvior under neurala faldig ökning skulle vara mellan de 6 och 10 somit steg när de neurala veck precis har börjat lyfta och innan den stora morfogenes av kraniala mesenkym sker.
  7. Tvätta embryo i PBS. Placera i en svart Sylgard platta med DMEM som innehåller fenolrött (Invitrogen, # 21.063-029). Ta bort extraembryonic membranen och spara för genotypning om det behövs.

4. Framställning av Explantat

  1. Omfokusera mikroskopet vid högsta möjliga förstoringen över huvudet regionen av embryot.
  2. Gör snitt med en dissektion nål i varje hand. Använd en nål för att hålla vävnaden på plats och den andra för att göra nedskärningar.
  3. Skär av huvudet av embryot främre till rhombomeres.
  4. Klipp längs mittlinjen för att HALVERA huvudet i två lika stora delar.
  5. Skär runt de yttre utkanten av huvudet och mittlinjen. Dessa nedskärningar kommer att ta bort premigratory krönet och ytan ektoderm vid den yttre gränsen ochden prechordal plattan vid mittlinjen. Den återstående vävnaden blir explantatet och kommer att innehålla det migrerande kranial neurallisten, axelparallella mesoderm och yta ektoderm.
  6. Eftersom vävnaden skärs, ta dissekerade skräp från skålen med en steril pasteurpipett. Detta förhindrar förvirrande explantatet med den dissekerade skräp.
  7. Försiktigt tvätta explantatet genom pipettering upp och ned med en 20 ul pipettspets och Pipetman. Detta kommer att ta bort löst fästa cellerna och förhindra ojämna kanter på explantaten.
  8. Försiktigt plocka upp varje explantat i ungefär 10 pl vätska med användning av en 20 pl pipettspets och Pipetman och plats i mitten av den belagda odlingsbrunn.
  9. Tillsätt 20 | il odlingsmedia kompletterat med 15% FBS för att täcka explantatet.
  10. Placera plattan i en befuktad vävnadsodlingsinkubator (5% CO 2, 37 ° C) under 1-2 timmar för att tillåta explantatet att fästa till botten av skålen. Se regelbundet för att säkerställa att explantatet inte torkarut.
  11. När explantatet har fäst, försiktigt lägga till varje brunn 250 | il DMEM kompletterat med 10% FBS som har värmts till 37 ° C i ett vattenbad. När explantat har fäst de inte röra sig när plattan försiktigt skakas under mikroskop.
  12. Återgå skålen vävnadsodling inkubator.
  13. Efter 24 timmar kommer explantaten vara ordentligt fästade och celler börjar att emigrera. Vid denna tidpunkt farmakologiska medel kan sättas till mediet.
  14. 48 timmar efter plätering, kommer cellerna har migrerat från explantaten. Avståndet migrerade kan visualiseras och avbildas. Vi stannar normalt kulturen vid denna punkt eftersom explantat börjar visa tecken på minskad livsduglighet med längre inkubationer. En viktig färgning såsom akridinorange eller trypanblått kan också användas för att kontrollera bärkraft explantatet.
  15. Vid denna punkt bilder kan förvärvas för att dokumentera avståndet och antalet celler som migrerar från explantatet. Alternativt, om var explantat utströks på täckglas,De kan vara fast och immunhistokemiska analyser utförs för att visualisera proteiner av intresse.

Kritiska steg i protokollet

  1. Skär explantat av ungefär samma storlek.
  2. Rensa alla dissektion skräp från dissekera plattan som du dissekera undvika förvirrande skräp med önskad explanterade vävnaden.
  3. När plätering explantat i brunnar eller på täckglas ska du placera droppe media med explantat i centrum av väl.
  4. Låt explantera tillräckligt med tid att fästa innan översvämningar brunnen med media.
  5. Behandling förhållanden bör standardiseras för varje test substrat och används farmakologiskt medel.
  6. Två explantat kan göras från varje embryo (en från vänster och en från höger av neuralröret).
  7. När undersökning av migration av celler från muterade mus linjer under olika experimentella förhållanden, satte en mutant explantat i kontrollgruppen och den andra i den behandlade gruppen.

Felsökning

  1. Om explantat inte fästa, öka den tilldelade tiden för fastsättning. Enligt vår erfarenhet fäster ungefär hälften av explantaten inte och större explantat följa mer effektivt.
  2. Om explantat fäster periferin av väl de kommer att bli svårt att avbilda. Var noga med att placera explantat i mitten av brunnen.
  3. Helst explantat kommer att vara ungefär samma storlek. Emellertid kan skillnader i explantat storlek korrigeras för användning diameter explantaten som en korrektionsfaktor när quanitating flyttningar av celler från explantat.
  4. Om kontaminering sker vara säker sterila arbetsförhållanden används. Alla verktyg och arbetsytor bör steriliseras med 70% etanol. Pipetter och Petriskålarna bör ny och steril.
  5. Om explantat får förloras under dissektionen regelbundet ta bort skräp för att förhindra att förlora explantation.
  6. Behärska dissektion är tidskrävande och kräver övning. Optimal förstoring, skarpa dissekering verktyg och nålar hjälp.

Representative Results

Utseendet av celler som migrerar från kraniala mesenkymceller explantat visas i figur 2. Vi testade migration på olika ECM substrat som finns i den kraniala mesenkym under neurulation inklusive fibronektin (100 mg / ml, Sigma # F1141), Laminin (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 spädning i DMEM , Sigma # E0282) och Hyaluronsyra (1 mg / ml, Sigma, # 53.747). Celler inte migrera från explantatet när inget ECM är närvarande (data ej visade) och alla substrat testade stöds migrering av cellerna. Både formen liksom storleken på cellerna som migrerar från explantaten beror på substratet. Detta förväntas som tidigare studier visar att de mekaniska krafter som genereras genom interaktion av celler med olika ECM påverkar både formen och migrerande egenskaper av celler 21.

Figur 1 Figur 1. Beredning av explantat. (A) För att förbereda explantaten är E8.5 embryon dissekeras från deciduas och extraembryonic vävnader. (B) Embryo huvuden dissekeras från kroppen främre till rhombomeres. Explantat framställes genom att avlägsna vävnad från mittlinjen och de yttre kanterna av huvudet för att avlägsna prechordal plattan vid mittlinjen och den premigratory neurallisten och yta ektoderm vid gränsen resp. (C) Explantat framställs genom att skära bort vävnad från mittlinjen och yttre kanterna på huvudet för att avlägsna prechordal plattan vid mittlinjen och den premigratory neurallisten och yta ektoderm vid gränserna. (D) Explantat placeras i en liten volym av media på ECM-belagda skålar / täckglas och fick fästa innan tillsats av ytterligare material.

Figur 2
Figur 2. Migration av kraniala mesenkymceller från explantat utstrukna på olika substrat. Explantat ströks på fibronektin, laminin, MaxGel ECM eller Hyaluronsyra och fotograferades efter 48 timmar i odling. Storlek bar = 200 mm.

Discussion

Den metod som används här är ett kraftfullt analys för att undersöka beteendet hos kraniala mesenkymceller. Utöver de statiska analyser som presenteras här, realtidsundersökningen experiment i ljust fält eller i kombination med uttryck av GFP-märkta proteiner kan användas för att undersöka beteendet hos cellerna i realtid då de migrerar från explantatet. För levande imaging experiment, skulle explantat märkas med Dil eller att differentiera migrering av neurallisten från paraxiella mesodermet, ROSA-YFP, Mesp1-cre eller ROSA-YFP, Wnt1-cre eller andra transgena linjer kan användas. Kraniala mesenkym-ECM interaktioner kan också undersökas med användning denna explantat analys. Här har vi platta explantat på olika ECM substrat som är närvarande i den kraniala mesenkymet att visa att celler migrerar på dessa i olika grad och att ECM påverkar cellernas morfologi. Vidare kan explantat vara inbäddad i en tredimensionell matris för att komma till beteenden av celÄr i detta sammanhang. Denna explantat analys är kan ändras för analys av effekten av genetiska och farmakologiska manipulationer på kraniella mesenkymceller beteenden att analysera inre och yttre ledtrådar som kan reglera och ändra migration. Till exempel använde vi denna analys i våra studier att urskilja rollen av överskott Hsp90 utsöndring i de onormala cellulära beteenden i Hectd1 mutant kranial mesenkym 15. I dessa experiment, behandlade vi explantat med anti-Hsp90-antikropp, Hsp90 protein, geldanamycin och DMA (dimetyl amelioride) för att blockera sekretion av Hsp90 att visa att onormalt beteende av Hectd1 mutanta celler beror på överskott extracellulära Hsp90 15. Liknande tillvägagångssätt kan användas för att farmakologiskt dissekera ytterligare vägar bakom normal eller onormal morfogenes av kraniala mesenkym. När analysen är klar, kan explantat och celler sträckande analyseras genom en mängd metoder. Till exempel, immunohistokemiska analyser cen användas för att undersöka lokalisering av proteiner kritiska för cell rörelser. Transkriptomanalys analyser skulle också kunna användas för att bestämma hur behandlingar påverkar genuttryck.

En betydande begränsning av denna teknik är att det inte modell beteenden i tre dimensioner som de skulle ske in vivo. Ändring av protokollet där explantat är inbäddade i en tredimensionell matris (t.ex. Matrigel) tillsammans med uttryck av fluorescerande protein-märkta cellulära fack kan användas nödvändigt att behandla denna fråga. Även om dessa ändringar utfördes, skulle ytterligare experiment för att korrelera beteenden ses i denna ex vivo-analys med dem in vivo vara nödvändigt. Andra begränsningar inkluderar det stora antalet embryon som krävs för att generera ett tillräckligt antal för att generera statiskt signifikanta data. Viktigast är att dissektionen relativt enkel, kräver det att lära sig.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av R01-HD058629 till IEZ

References

  1. Copp, A. J. Neurulation in the cranial region--normal and abnormal. Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).
  2. Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies. The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).
  3. Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. The genetic basis of mammalian neurulation. Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).
  4. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence. J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).
  5. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).
  6. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).
  7. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).
  8. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds. Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).
  9. Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme. Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).
  10. Noden, D. M., Trainor, P. A. Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations. Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).
  11. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).
  12. Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).
  13. Morriss-Kay, G., Tuckett, F. Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos. Development. 106-787 (1989).
  14. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation. Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).
  15. Sarkar, A. A., Zohn, I. E. Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme. The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).
  16. Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure. Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).
  17. Chen, Z. F., Behringer, R. R. Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis. Genes Dev. 9, 686-699 (1995).
  18. Tzahor, E., et al. Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle. Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).
  19. Lumsden, A. G. Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ. Development. 103, 155-169 (1988).
  20. Newgreen, D. Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin. Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).
  21. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics