Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол описывает метод визуализации ДНК двухцепочечной перерыв сигнальный белок активируется в ответ на повреждения ДНК, а также его локализации во время митоза.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beckta, J. M., Henderson, S. C., Valerie, K. Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins. J. Vis. Exp. (67), e4251, doi:10.3791/4251 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Двунитевых разрывов (ДР) являются наиболее вредными повреждения ДНК клетки может столкнуться. Если оставить неустраненные, DSBs гавани большой потенциал для создания мутаций и хромосомных аберраций 1. Чтобы предотвратить эту травму от катализирующих геномной нестабильности, крайне важно для клеток для обнаружения DSBs, активировать ответ повреждение ДНК (РДР), и ремонт ДНК. Когда стимулируются, DDR работает, чтобы сохранить целостность генома, вызывая остановку клеточного цикла, чтобы обеспечить ремонт пройдет или заставить клетки к апоптозу. Преобладающий механизм ремонта DSB происходить через негомологичных конце-присоединение (NHEJ) и гомологичной рекомбинации ремонт (HRR) (отзывы в 2). Есть много белков, чья деятельность должна быть четко организованы для DDR функционировать должным образом. Здесь мы опишем метод для 2 - и 3-мерные (D) визуализация одного из этих белков, 53BP1.

P53-связывающий белок 1 (53BP1) локализуется в областиDSBs путем связывания изменение гистонов 3,4, образуя очаги в течение 5-15 минут 5. Модификации гистонов и вербовки 53BP1 и других белков DDR для DSB сайтов, как полагают, содействие структурной перестройке хроматина вокруг области повреждения и способствуют репарации ДНК 6. Помимо непосредственного участия в ремонте, дополнительные роли были описаны для 53BP1 в ГДР, например, регулирование внутри-S контрольно-пропускном пункте, G2 / M контрольно-пропускного пункта, и активация белка ниже по течению DDR 7-9. Недавно было обнаружено, что 53BP1 не образует очаги в ответ на повреждение ДНК индуцированных во время митоза, вместо ожидания для клеток, чтобы войти G1 до локализации в окрестности DSBs 6. DDR белки, такие как 53BP1 были найдены общаться с митотической структур (таких, как кинетохоры) во время их прохождения митоза 10.

В этом протоколе описываются использования 2 - и 3-D изображений живых клеток, чтобы визуализироватьформирование 53BP1 очагов в ответ на ДНК-повреждающих агентов камптотецин (CPT), а также поведение 53BP1 во время митоза. Камптотецин является ингибитором топоизомеразы I, что в первую очередь вызывает DSBs во время репликации ДНК. Для этого мы использовали ранее описанных 53BP1-mCherry флуоресцентный белок слияния построить, состоящий из 53BP1 домена белка способен связывать DSBs 11. Кроме того, мы использовали гистона H2B-GFP флуоресцентный белок слияния построить в состоянии контролировать динамику хроматина протяжении клеточного цикла, но, в частности, во время митоза 12. Изображений живых клеток в нескольких измерениях является отличным инструментом для углубления нашего понимания функции белков DDR в эукариотических клетках.

Protocol

А. клеточный препарат

  1. Нормальные человеческие первичных фибробластов (GM02270) были получены от Coriell сотовых Repository, Камден, Нью-Джерси, и увековечил с hTERT 6. Клетки выращивались и расширена в Cellstar 6-см блюд в средствах массовой информации (4 мл), состоящий из MEM с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO), non-essential/essential аминокислоты, витамины, пируват натрия, и пенициллина / стрептомицина (HyClone ).
  2. Эмбриональной почки человека 293 (HEK293) клетки были получены из Американской коллекции типовых культур и выросла и расширилась в Cellstar 6-см блюд. Клетки хранятся в средствах массовой информации (4 мл), состоящей из DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, без незаменимых аминокислот, L-глутамина и пенициллина / стрептомицина.
  3. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene плазмиды 19836) и H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene плазмиды 17735) гена слияния конструкций, также выразив пуромицин или гены G418 сопротивления, соответственно, преобразованных (fibroblaп.) или трансфицированных (HEK293) с помощью Superfect (Qiagene) в клетках и поддерживают в состоянии наркотического выбор. Техническое обслуживание флуоресценции периодически проверяться.
  4. 24-48 часа до захвата изображений, клетки трипсинизировали в одной клеточной суспензии и высевают при низкой плотности на 3,5-см FluroDish пластины со стеклянным дном.

B. Установка микроскопа и Image Acquisition

Этот протокол был разработан с использованием сотового Zeiss наблюдателей SD вращающийся диск конфокальной микроскопии оснащена AxioObserver Z1 стенд, двухканальный Yokagawa CSU-X1A 5000 вращающимся диском блок, 2 Фотометрия QuantEM 512SC EMCCD камер, HXP 120C на основе волокон подсветка, 4 лазеры (Lasos 100mW многоканальный Аргон [458, 488, 514 нм], 50 мВт 405 нм диод, 40 мВт 561 нм диод, и 30 мВт 635 нм диод), AOTF, Pecon XL multiS1 стадии инкубации системы, Zeiss инкубации Модули (O 2 модуля S, CO 2 модуля S, TempModule S, нагревательный элемент XL S) и До моментаtorized XY сцене с вставкой NanoScanZ пьезо-Z. Для минимизации сферических аберраций в то время как изображения живых клеток поддерживается в водной среде, C-Apochromat 63x/1.20 воды / Корр объектива Zeiss и Immersol W иммерсионной жидкости (с показателем преломления n = 1,334) были использованы. Для 2-канальный конфокальной микроскопии, RQFT 405/488/568/647 дихроичным зеркалом и BP525/50 (зеленый) и BP629/62 (красный) выбросов фильтры были использованы. Система программного обеспечения, используемого было Zeiss AxioVision (версия 4.8.2.0) с AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, физиологии, MOSAIX, Mark & ​​Find, двойная камера, внутри 4D, автофокусом и 3-D модули Deconvolution.

  1. Убедитесь, что CO 2 газ работает на CO 2 модуля инкубационного системы. Если микроскоп поддерживается антивибрационные воздух таблицы, включить подачу воздуха (или газа N 2) для воздуха таблице.
  2. Включите для микроскопа стенд, вращающийся диск устройства, камеры, инкубационный модулей, HXP осветителя, моторизованные этапе, Аргонлазера и компьютера.
  3. Через 1 мин время прогрева, поверните ключ зажигания для аргонового лазера на "On".
  4. На панели управления Zeiss лазер, включите переключатели для лазерных линий, которые будут использоваться.
  5. Переключите тумблер для контроллера Lasos Аргон лазера от "ожидания" на "лазерных Run" и отрегулировать света контроллера до оптимального уровня (т.е. чуть ниже точки, где зеленый индикатор красного цвета).
  6. Запустите программу AxioVision. Примечание: интерфейс пользователя для AxioVision могут быть настроены с окна и выпадающие меню, которые являются специфическими для конкретной микроскопа и компонентов, которые он контролирует. Таким образом, каждая система имеет потенциально уникальным интерфейсом. Таким образом, общие инструкции для программного обеспечения манипуляции приводятся в последующих шагах, а не для конкретных направлений окна программы, вкладки и / или выпадающими меню.
  7. Примерно за 1 час до изображений, в программное обеспечение, найдите управления для инкубатора иВключение отопления для верхней палате и стадии пластины. Установка температуры до 37 ° C. Включите CO 2 контроля и установить уровень в 5%.
  8. Выбор объектива для получения изображения. В этом исследовании, 63x/1.20 НС C-Apochromat воды / Корр объектив был использован. Примечание: Для этого объектива, иммерсионной среды с показателем преломления, сходных с водой (Zeiss Immersol W иммерсионной жидкости) не требуется.
  9. Если несколько отдельных позиций для отбора проб в течение длительного периода времени, обязательно применять достаточное количество иммерсионной среды, чтобы оно осуществляется из одного положения в другое.
  10. Поместите блюдо на сцену и принести объектива вверх в контакт с дном.
  11. Используя либо микроскопом управления или программного обеспечения, руководит излучаемого света в окуляр и выберите соответствующий широкопольных набор фильтров для флуоресцентного сигнала интерес (для этого исследования, "Red" набор фильтров для 53BP1 и "GFP" набор фильтров для H2B ). </ Li>
  12. Вид через глазные линзы, фокусировать изображение, и найти подходящего поля клеток.
  13. При использовании любого программного обеспечения или микроскоп управления, руководит излучаемого света от окуляров в порт с конфокальной вращающийся блок диска.
  14. В программе, включите соответствующий лазер (для этого исследования, 561 нм с лазером для 53BP1 и 488 нм линии аргонового лазера для H2B).
  15. Для каждого канала настроить интенсивность лазерного путем корректировки акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF) управления соответствующего уровня.
  16. Выберите подходящий дихроичным зеркалом (RQFT 405/488/568/647) и выбросов фильтрами (BP 629/62 для 53BP1 и BP 525/50 для H2B). Откройте затвор в прядильный единичном круге.
  17. Выберите "Онлайн" для отображения текущего поля зрения.
  18. В программе открытия "Камера" управления, выберите камеры, которые будут использоваться (если двойная система камеры) и установить время экспозиции около 100 мс. Отрегулируйте% и EM получить как включенные в другие группировки. Essary Примечание: 53BP1-mCherry конструкция выглядит несколько тускло. Мы нашли его полезным для повышения коэффициента усиления EM.
  19. В программе открытия контроля за конфокальной вращающегося диска и блока регулировки скорости прядения диска, введя время экспозиции камеры, которая была установлена ​​для захвата подходящего изображения (например, ~ 100 мс). Нажмите кнопку "Установить", чтобы зафиксировать изменения.
  20. Откройте "многомерный приобретения". Выберите вкладку канала и загрузки / выбора соответствующих каналов. Для этого исследования, мы используем каналы, определенные для DsRed (561 нм лазерного возбуждения и BP 629/62 Фильтр для выбросов) и GFP (488 нм лазера для возбуждения и BP525/50 фильтром для излучения).
  21. Для обеспечения регистрации изображений, общий дихроичным зеркалом (RQFT 405/488/568/647) был использован для обоих каналов. Установка программного обеспечения для «Автофокус». Примечание: Перейдите в раздел Инструменты → Настройки редактора для настройки параметров MDA. Убедитесь, что адекватная мощность лазерного установлен ("Достаточные мощности лазера" относятся параметр, который позволит вамДля возбуждения соответствующего флуорофор при минимизации фото-отбеливание).
  22. В окне MDA, выберите Z-Stack вкладки. Выберите "Z-стек текущее положение фокуса". Установить диапазон ~ 10 мкм Z-Stack и выберите "оптимальным" для числа шагов для обеспечения Найквиста через Z. Примечание: точные размеры Z-Stack будет зависеть от высоты ваших клеток. Отрегулируйте соответственно.
  23. 23. Нажмите кнопку "Пуск" и проанализировать полученную Z-Stack изображений для обеспечения параметров являются подходящими для того, что вы расследования (например, в данном исследовании, было важно, чтобы изображение всего ядра).
  24. Выберите "T" (время) вкладки. Для нашего эксперимента с камптотецин, мы устанавливаем интервал между изображениями моменты времени до 5 мин, а общая продолжительность сессии 1 час для контроля (необработанные клетки) видео. Примечание: чтобы свести к минимуму фото-отбеливание клеток, эксперимент должна быть настроена таким образом, что AOTF заготовок лазерные между точками изображения времени.
  25. Фаили многоточечная изображений из нескольких клеток в блюдо, в окне MDA, выберите позицию табуляции. Убедитесь, «Применить» настройка перед / после момента времени "в положение" проверяется. Выберите "Mark_Find". Использование "Live" точки зрения, перемещать антенну вокруг и выбрать соответствующие поля зрения.
  26. Нажмите кнопку "Пуск" в многомерном приобретения меню, чтобы начать экспериментировать и записывать видео контроля (необработанных клеток).
  27. После контроля видео, добавлять соответствующее лечение (в данном случае, 10 мкМ камптотецин). Мы записали экспериментальный (препарат обработанных клеток) видео в 5-10 минутные интервалы в течение 2-4 часов. Примечание: Важным вопросом для рассмотрения является скорость, с которой данный эффект возникает после лечения. Как видно на видео, 53BP1 очагов начинают от ~ 5 мин после добавления КПП. Несмотря на относительно легкий процесс, добавив наркотиков на блюдо вручную и заново калибровки микроскопа требует времени. Рассмотрение должно быть уделено этим при проектировании экспериментов.
  28. Для контроля мitosis, мы устанавливаем интервал 7,5 мин и записаны в течение 4-5 ч (конкретные параметры зависят от клеточной линии используются, и длина его клеточного цикла). Корректировки, возможно, придется быть сделано для предотвращения фото-отбеливание во время длинных записей.

С. обработки и анализа изображений

Этот протокол был разработан с использованием программного обеспечения Volocity (PerkinElmer). Программное обеспечение используется для получения этих данных (AxioVision) также имеет возможность обрабатывать и анализировать изображения. Пользователям рекомендуется использовать программное обеспечение для них, а также проконсультироваться соответствующей литературы по их применению.

  1. Откройте Volocity программного обеспечения. Создание и назвать новую библиотеку, и импортировать видео файлы.
  2. Для просмотра файлов, мы обычно находим его наиболее полезно использовать "Расширенный фокус" настройки. Это накладывает Z-Stack ломтиками, а для этого протокола, позволяет визуализировать 53BP1 очагов в различных областях ядра.
  3. Отрегулируйте видео по мере необходимости. Voрости оснащен набором инструментов для улучшения качества получаемых изображений. Обеспечивая настройки на микроскопе было необходимо, много времени может быть сохранен в редактировании позже. Часто это полезно deconvolve изображения, а также настроить яркость / контрастность. Ваши конкретные потребности редактирования будет меняться в зависимости от эксперимента.
  4. Добавить относительной отметки времени и шкалы.
  5. Для просмотра клетки в 3-D, перейти к "3-D Opacity" настройки. Это позволяет вращение 3-D оказанных клеток в пространстве, обеспечивая тем самым различные точки зрения структуры интересов внутри клеток. Примечание: Это полезно для визуализации клеток в разных плоскостях, чтобы определить, где структура интерес путешествия. Например, в "расширенный фокус" Настройка трудно различить, что 53BP1 же, в самом деле, отмежеваться от ДНК во время митоза. Впрочем, это легко просматривается в 3-D.
  6. Фильмы и неподвижные изображения можно экспортировать в файлы различных типов на основе пользовательских предпочтений. I>

D. Представитель Результаты

Пример 53BP1 очагов формирования в ответ на КПП показано на рисунке 1. Клетки подвергаются CPT формы очагов в течение 5-10 мин, и поддерживать эти очаги в течение всей записи. Как показано на рисунке 2, 53BP1 отделяется от хроматина в начале митоза, образуя тонкую дымку вокруг конденсации хромосом. Как телофазе происходит и митоза подходит к концу, 53BP1 раз агрегатов на отдельные очаги. В то время как НЕК293 не подвергались CPT, тем не менее они образуются обильные, спонтанные 53BP1 очагов ремонт порожденных эндогенные повреждения ДНК. Это наблюдение позволило нам сделать вывод, что 53BP1 не образует очаги на ранних стадиях митоза, в соответствии с предыдущими отчет, показывающий, подобный эффект после воздействия на клетки ионизирующих излучений и радиомиметических наркотиков 5.

рисунке 1 "SRC =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Камптотецин (10 мкМ) вызывает DSBs и 53BP1 формирование очагов в велосипедных фибробластов в течение 30 мин добавления наркотиков в среду.

Рисунок 2
Рисунок 2. 53BP1 не образует очаги во время митоза, пока telophase/G1 в НЕК293.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поддержание целостность генома имеет решающее значение для выживания клеток. Неспособность сохранить геном приводит к преждевременному старению, канцерогенеза, или смерть 8. Существует повышенный интерес взыскательных как DDR функций, вытекающих из его значение как фундаментальные и клинические исследования. Многие методы были разработаны на протяжении многих лет, чтобы помочь в исследовании того, как клетки обнаружить и устранить повреждение ДНК. Традиционные методы, такие как иммуноцитохимии и вестерн-блоттинга были опорой поле, хотя последние достижения в технологии позволили более изощренные методы, чтобы развиваться. Живая клетка изображений, как указано в этом протоколе, позволяет изучать характеристики DDR упускают из виду более традиционные методы.

Центральный использования изображений живых клеток является создание флуоресцентно меченых белков. Здесь мы опишем использование mCherry с метками белков, участвующих в ГДР, 53BP1, а также гистона H2B-GFP слияния продукта. Флуоресцентно меченых белков широко используются в молекулярной и клеточной биологии, однако, они не без их ограничения. Установка новой структуры эндогенного белка создает очевидный риск изменения природной функции. Кроме того, некоторые конструкции могут быть и будут, высказанные на различных уровнях в различных клеточных линиях, в различных условиях. Мы наблюдали различные уровни интенсивности флуоресценции во всех генетически модифицированные клетки, используемые в этом исследовании. 53BP1 построить, используемые в настоящем протоколе не хватает самых функциональных областей, однако она сохраняет способность связываться с сайтов повреждений ДНК, которые, кажется, не отрицательно влияют на клетки 2.

Кроме того, важно учитывать метод доставки генов. В этом протоколе, мы использовали два метода: лентивирусные трансдукции и стабильной трансфекции. Наши лентивирус-инфицированные клетки стабильно трансдуцированных с люминесцентными конструкции;Таким образом, они будут продолжать выражать эти белки на неопределенный срок. Однако, этот метод является несколько более трудоемкий по сравнению с трансфекции и продиктовано, какой вид клетки становятся мишенью; некоторые клетки не поддаются эффективной трансфекции. С другой стороны, лентивирусов могут ввести большинства клеток, в том числе человека. Следователи рекомендуется взвесить все плюсы и минусы каждого из методов, когда дело доходит до их собственных экспериментов. В качестве возможного средства обхода проблем, связанных с флуоресцентно меченых белков, использование сотовых проницаемой флуоресцентно меченых зондов были недавно сообщила для живой клетки экспериментов 10. Однако этот метод еще не полностью развита.

Основным преимуществом изображений живых клеток является возможность изучения пространственно-временных отношений DDR и DSB ремонт. Действительно, Димитрова и соавт. (2008) имели возможность наблюдать флуоресцентно меченые живых клеток и выявить романФормирование относительно 53BP1 привязки к теломеры и как она влияет на динамику хроматина. Этот анализ может быть значительно более сложным, хотя и не невозможно, с другими методами. Имея возможность контролировать DDR в пространстве и во времени позволяет выявить функции и отношения, которые мы могли бы не заметить.

Таким образом, использование изображений живых клеток позволяет ученым следить за кинетикой формирования DSB и разрешение в режиме реального времени, а также позволяет количественного анализа на одном уровне клетки. В дополнение к техника, используемая в данном исследовании других приложений изображений живых клеток может быть использована, например, рвать и FRAP 3. Технология наблюдения клеток в реальном времени по-прежнему будет улучшена и используется для изучения различных клеточных процессов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

При частичной поддержке R01NS064593 и R21ES016636 (KV). Микроскопия была выполнена в VCU - отдел фонда микроскопии нейробиологии и анатомии, поддерживается, в частности, с финансированием из NIH-NINDS центра основного гранта 5P30NS047463. Вращающийся диск конфокальной микроскопии был приобретен с NIH-NCRR премии (1S10RR027957).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CellStar culture dishes Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes World Precision Instruments, Inc.
MEM media GIBCO
Non-essential amino acids GIBCO
Amino acids GIBCO
Vitamins GIBCO
Sodium Pyruvate Invitrogen
Penicillin/Streptomycin HyClone
Fetal Bovine Serum GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;
plasmid 19836
Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 Addgene
SuperFect Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system Zeiss
AxioVision (release 4.8.2) Zeiss
Zeiss Immersol W Oil Zeiss
Volocity software (version 6.0) PerkinElmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
  2. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  3. Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
  4. Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
  5. Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
  6. Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
  7. Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
  8. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
  9. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
  10. Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
  11. Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
  12. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
  13. Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
  14. Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
  15. Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).

Comments

2 Comments

  1. Hi

    I think there is a mistake in the protocol. it should be the plasmid http://www.addgene.org/19835/ mCherry-BP1-2 pLPC-Puro from Titia De Lange lab, isn't it?
    the 19836 is N-Myc tagged and not mCherry.


    Reply
    Posted by: Valentine C.
    June 29, 2015 - 11:11 AM
  2. Ah, yes, you are correct. I apologize for missing that.

    Reply
    Posted by: Jason B.
    August 15, 2015 - 2:35 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics