استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يمكن قياس Kv7 (KCNQ) البوتاسيوم في النشاط قناة myocytes الشرايين معزولة (باستخدام تقنيات التصحيح المشبك الكهربية) بالتوازي مع قياسات المضيقة / موسع الردود (باستخدام تخطيط العضل الضغط) يكشف عن معلومات مهمة حول دور كل من القنوات في الأوعية الدموية Kv7 علم وظائف الأعضاء والعضلات الملساء علم الصيدلة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

انكماش أو التخفيف من خلايا العضلات الملساء في جدران الشرايين المقاومة يحدد قطر الشريان وبالتالي تسيطر على تدفق الدم عبر الأوعية ويساهم في ضغط الدم النظامية. وينظم عملية انكماش في المقام الأول تركيز الكالسيوم عصاري خلوي ([CA 2 +] CYT)، والذي هو بدوره يسيطر عليها مجموعة متنوعة من نقل أيون والقنوات. القنوات الأيونية هي وسيطة مشتركة في مسارات نقل الإشارة تفعيلها من خلال الهرمونات فعال في الأوعية تضيق الأوعية أو لإحداث توسع الأوعية. وغالبا ما يتم استهداف القنوات الأيونية من العوامل العلاجية عمدا إما (مثل حاصرات قنوات الكالسيوم تستخدم للحث على توسع الأوعية وانخفاض ضغط الدم) أو عن غير قصد (مثل للحث على غير المرغوب فيه الآثار الجانبية القلبية الوعائية).

وقد تم مؤخرا Kv7 (KCNQ) قنوات البوتاسيوم الجهد تنشيط تورط بأنها مهمة targ الفسيولوجية والعلاجيةETS لتنظيم تقلص العضلات الملساء. لتوضيح أدوار محددة من Kv7 القنوات في كل من نقل الإشارة والفسيولوجية في أعمال العوامل العلاجية، ونحن بحاجة لدراسة كيفية نشاطهم هو التضمين على المستوى الخلوي، فضلا عن مساهمتها تقييم في سياق الشريان سليمة.

الشرايين المساريقي الفئران توفير نظام نموذجا مفيدا. ويمكن الشرايين تشريح بسهولة، وتنظيفها من النسيج الضام، وتستخدم لإعداد myocytes الشرايين معزولة عن التصحيح المشبك الكهربية، أو مقنى وضغط لقياسات مضيق للأوعية / عائي الردود في ظل الظروف الفسيولوجية نسبيا. نحن هنا تصف الأساليب المستخدمة لكلا النوعين من القياسات وتقديم بعض الأمثلة للكيفية التي يمكن أن تكون متكاملة في التصميم التجريبي لتوفير فهم أوضح للأدوار هذه القنوات الأيونية في تنظيم نغمة الأوعية الدموية.

Protocol

1. جراحية استئصال الأمعاء الصغيرة مساريقي مركز الألعاب الأوعية الدموية

  1. تخدير ل300-400 ز سبراغ داولي الفئران مع isoflurane (4٪) تدار عن طريق الإستنشاق.
  2. إجراء البطن خط الوسط لفضح مساريق الصغيرة الأمعاء. Exteriorize الأمعاء الصغيرة والكبيرة من خلال شق في البطن بقدر كبير من العناية لتجنب الصدمة إلى الأمعاء المكشوفة ومساريق. تأجيج بلطف مساريق على مدى شاش معقم.
  3. المكوس جراحيا الأمعاء الدقيقة وجزء من الأمعاء الغليظة، بما في ذلك الأعور (الأوعية الدموية قطع بعناية على طول الهوامش وعلى أصول من فروع الرئيسية للالمساريقي العلوي الشريان / الوريد).
  4. نقل الأنسجة رفعه إلى دورق يحتوي على الجليد الباردة حل تشريح (الجدول 1).
  5. بعد استئصال الأمعاء، ينبغي على الفئران بينما يصرح باستخدامها إنسانية تحت التخدير.

2. تشريح للد تنظيف الشرايين

  1. نقل الأمعاء رفعه والممرات المساريقي إلى غرفة تبريد تشريح (4-5 ° C) التي تحتوي على حل تشريح. غرفة تتكون من طبق بتري 100-مم الزجاج مع المطاط الصناعي قاعدة SYLGARD 184 إلى استيعاب دبابيس تشريح؛ يتم وضع طبق بتري في قاعدة تبريد التي يتم الاحتفاظ في C ° 4-5 من حمام الماء المنتشرة.
  2. باستخدام مقص جراحي قطع شريحة سم تقريبا 10-12 من الأمعاء كلها. قطع في كل نهاية الجزء المعوية حفظ الأوعية الدموية المرفقة به، ثم قم بإزالة الأمعاء غير المستخدمة من الغرفة وترك الجزء واحد مع الأوعية الدموية المرفقة به (ممر المساريقي) في عزلة.
  3. انخفاض الرقم جزء من الأمعاء الدقيقة، ونشر أكثر من مساريق الجانب القريب من الغرفة بحيث فرع الرئيسي للالمساريقي العلوي الشريان / الوريد في وسط وأوامر لاحقة من فروع تشع من المركز (الشكل 1). رر الآس دبابيس فقط على قطاعات الأمعاء (وليس على الأوعية الدموية).
  4. تمييز الشرايين من الأوردة من لونها أحمر فاتح نسبيا، جدران سميكة ومميزة فروع على شكل حرف V، وليس على شكل U فروع ينظر في الأوردة.
  5. تصور من خلال مجهر تشريح مضيئة، قم بإلغاء بعناية الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة المحيطة الثانية 2-4 الشرايين أجل عشر على مقربة من الأمعاء (دائرة متقطع في الشكل 1) باستخدام ملقط ومقص الصغيرة. عقد الأوردة المجاورة يسهل تطهير الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة. تجنب لا لزوم لها تمتد من الشرايين.
  6. ويمكن بعد ذلك شرائح الشريان المساريقي تطهيرها من النسيج الضام أن تشريح من وتستخدم لعزل الخلايا (على دراسات وحيدة الخلية المشبك التصحيح، مقاطع 3-4) أو مقنى لتخطيط العضل الضغط (القسم 5). قطع شرائح بين نقاط فرع، عادة ما يصل إلى 1 سم في الطول.
jove_title "> 3. زنزانة انفرادية للدراسات المشبك التصحيح

  1. إعداد 0.5 لتر من محلول العزل (الجدول 1) وتقسيمه إلى 2 أجزاء قبل ضبط درجة الحموضة. يجب أن تكون درجة حرارة الجزء الأول (عادة 100 مل) حتى 37 ° C وينبغي تعديل درجة الحموضة إلى 7.2 في 37 ° C (37 ° C الحل عزل). يجب تبريد الجزء الثاني من الحل عزل أسفل إلى 4 ينبغي تعديل ° C ودرجة الحموضة إلى 7.2 في 4 درجات مئوية (الجليد الباردة حل العزل). بعد ضبط الأس الهيدروجيني، يجب على كل من الحلول الأسمولية تعديلها الى 298 الميلي أسمول بإضافة كمية مناسبة من السكر D-H أو O. 2
  2. نقل 2 مل من محلول 37 ° C العزلة إلى قارورة زجاجية واحتضان في C ° 37 للاستخدام في الخطوة 3.4. إضافة 20 ملغم من ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 10 مل من محلول 37 ° C عزل، حل، إعادة تسخين إلى 37 ° C وتعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.2. ل2 مل من هذا الحل إضافة 4 ملغ كولاجيناز نوع VIII (سيغما، ولوط 089K8612: 633 شالقمل / ملغ النشاط كولاجيناز، 285 وحدة / ملغ النشاط Caseinase، 1.6 وحدة / ملغ النشاط Clostripain)، 0.64 ملغ إيلاستاز النوع الرابع (سيغما، ولوط 110M7025V 5.9 وحدات سكنية / ملغ؛ اضافة 40 ميكرولتر من مخزون ملغ / مل أعد في 37 16 ° C حلول العزل) و 2 ميكرولتر من 1 DL-M dithiothreitol (DTT سيغما)؛ دافئة قبل هذا الحل أنزيم إلى 37 ° C استعدادا لخطوة 3.5.
  3. نقل 2-3 شرائح الشريان المساريقي في طبق نسيج الثقافة التي تحتوي على 35-مم 2 مل من محلول الجليد الباردة وعزل مكان الطبق على الجليد. قطع شرائح الشريان المساريقي إلى قطع طويلة مم 3-4.
  4. باستخدام ماصة باستور مع تلميح النار مصقول (لمنع تلف الشرايين) نقل قطاعات الشرياني إلى قارورة زجاج (15 × 45 مم، 1 DRAM) يحتوي على 2 مل قبل تحسنت 37 ° C الحل عزل واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C.
  5. بعد 30 دقيقة، نضح بعناية ال 37 ° C عزل الحل باستخدام ماصة باستور، إضافة 2 مل محلول أنزيم الدافئة واحتضان لمدة 35 دقيقةفي 37 ° C.
  6. مباشرة بعد دقيقة الحضانة 35 في الحل انزيم، ضع قارورة على الجليد، نضح الحل انزيم وإضافة 2 مل من محلول الجليد الباردة عزل (الطموح تكرار وإضافة جديدة عزل الجليد الباردة حل 4 مرات). ثم، في حجم 1 مل من محلول الجليد عزل الباردة، يسحن بلطف شرائح الشرايين مع مصقول مرات باستور 10-20 ماصة للافراج عن الفردية المساريقي خلايا العضلات الملساء الشريان (MASMCs).
  7. تحقق من ظهور دوري myocytes عن طريق وضع قطرة من تعليق الخلية على طبق 35-مم وعرضها تحت المجهر. يجب MASMCs صحية لها مظهر ناعم ممدود. لن يتم الإفراج عن جميع من الخلايا في جدران الشرايين. ينبغي أن تظل الخلية التعليق على الجليد.
  8. آخر مؤشرا مفيدا للصحة MASMC هو تسامحها الفسيولوجية تركيزات الكالسيوم + 2. ملء غرفة التسجيل (أدوات العلوم البيولوجية، CSC-25L #) مع حمام قolution تحتوي على 2 مم CaCl 2 (الرقم الهيدروجيني 7،3 في درجة حرارة الغرفة (RT)، لتكوين أنظر الجدول 1) وموقف الجسر أجار (الشعرية مليئة الزجاج عازمة أجار مع 2٪ في بوكل M 2، إدراجها في الإلكترود المرجعي (وارنر الصك، REF -3L)) داخل الغرفة. باستخدام ماصة باستور مصقول، ونقل ما يقرب من 100-200 ميكرولتر تعليق الخلية إلى دائرة التسجيل والسماح للخلايا الالتزام لمدة 15 دقيقة. ينبغي الخلايا غير التالفة لا ينكمش بدرجة كبيرة في مم 2 CaCl 2-المحتوية على الحل (الخلايا يجب أن تظهر لتكون مستطيلة أو على شكل قضيب، وليس تقريب يصل الى كرات).
  9. وينبغي بعد إضافة قسامة الأول من التعليق الخلية إلى غرفة تسجيل، 0.25 مل من محلول يحتوي على حمام 2 مم تضاف CaCl 2 إلى حجم ما تبقى من التعليق الخلية. يمكن الحفاظ على هذا التعليق الخلية المتبقية في هذا الحل على الجليد واستخدامها لتسجيل المشبك التصحيح لمدة تصل إلى 6 ساعة.

4.استخدام المشبك التصحيح الجامعة خلية لقياس التيارات Kv7 البوتاسيوم أو غشاء الجهد

  1. بعد myocytes الانضمام إلى قاعدة الزجاج للغرفة تسجيل (25 ملم رقم الغطاء زلة الدور 1، وارنر الصكوك)، والشروع في نضح المستمر من الحل حمام (الجدول 1). لتسجيل Kv7 التيارات بمعزل عن التيارات البوتاسيوم المعدل تأخر من Kv1 وKv2 الأسر، ينبغي أن تستكمل الحل حمام مع 100 ميكرومتر GdCl 3.
  2. افتعال ماصة التصحيح من الزجاج البورسليكات (Kimax-51، كيمبل تشيس) باستخدام مجتذب ماصة وmicroforge؛ مقاومته يجب أن تكون 4-5 MΩ عندما مليئة الحل الداخلي (الجدول 1). معطف أيهما أقل. 1/3 من ماصة (~ 1-2 ملم فوق تلميح) مع SYLGARD 184
  3. لتسجيل التيارات Kv7 في MASMCs، ينبغي استخدام مثقب التصحيح الجهد خلية كاملة تقنية المشبك. استخدام تكوين التصحيح مثقبة يساعد على منع depletioن من فوسفتيدلينوستول غشاء 4،5-bisphosphate (PIP 2) وسريعة لاحقة (خلال 5 دقائق) المتهدمة من التيارات Kv7، الذي يتم الاحتفال عادة باستخدام التكوين التقليدية التصحيح تمزق. تكملة الحل الداخلي (الجدول 1) مع 120 ميكروغرام / مل الامفوتريسين B: إضافة 3 ميكرولتر من الأسهم ملغ / مل 2 من الامفوتريسين B (أعد في DMSO وتجميدها في مأخوذة الصغيرة ومحمية من الضوء) إلى 0.5 مل من محلول الداخلية. ملء غيض من ماصة التصحيح مع حل B خالية الامفوتريسين الداخلية عن طريق غمس طرف ماصة في حل B خالية الامفوتريسين الداخلية ومن ثم تطبيق الشفط على الطرف الآخر باستخدام حقنة 10 مل تعلق عبر قطعة من أنابيب (R-Tygon 3603). إضافة الامفوتريسين حل ماصة تحتوي على B-من أعلى باستخدام تلميح ماصة إيبندورف Microloader حتى ماصة حوالي ملء نصف مع الحل. إزالة أي فقاعات الهواء من خلال استغلال بلطف ماصة. استخدام ماصة على الفور.
  4. إدراج ماصة فيلصاحب القطب واستخدام مياداة مجهرية لخفض ماصة إلى السطح من خلية عضلية ممدود (بالقرب من، ولكن ليس على رأس النواة، الشكل 2). عندما المقاومة في ماصة يزيد على 6-10 MΩ، وتطبيق الشفط لتحقيق GIGA-الختم (> 10 GΩ).
  5. تعيين إلى 0 عقد الجهد بالسيارات أثناء انتظار ثقب الغشاء. تطبيق MS 100 الخطوات الجهد إلى +10 بالسيارات ومن ثم إلى -10 بالسيارات، واستخدام مكبر للصوت للتعويض سريع العابرين السعة ماصة. وبالتزامن مع ظهور كل العابرين السعة زنزانة صغيرة التيارات إيجابية مستمرة (عادة 2-10 باسكال) تشير إلى وجود قنوات Kv7 الوظيفية.
  6. وانثقاب ناجحة مع الامفوتريسين B تقليل المقاومة الوصول إلى 35 MΩ أو أقل. ويمكن بعد ذلك أن يبدأ التسجيل الحالية باستخدام الجهد ثوانى 5 بروتوكول خطوة من الجهد القابضة -4 بالسيارات. نستخدم الجهد بالسيارات -4 عقد لتحقيق أقصى تعطيل بالقرب من الأنواع الأخرى من تأخر تفصيلالتيارات البوتاسيوم tifier (توسط في الغالب من قبل Kv1 وKv2 قنوات) التي من شأنها أن تلوث خلاف ذلك تسجيل التيارات الصغيرة نسبيا Kv7 غير تعطيل. منذ فترة طويلة خطوة الجهد (5 ثانية) البروتوكول هو ضروري لتحقيق حالة استقرار تفعيل قنوات Kv7، والتي تظهر بطيئة الجهد التي تعتمد على تفعيل والتعطيل. التيارات Kv7 لا تعطيل الخطوات خلال الجهد المتواصل.
  7. لتسجيل Kv7 الحالية ذات الجهد (IV) العلاقة، تطبيق 5 خطوات لالفولتية الجهد ثانية تتراوح بين -84 بالسيارات، حيث احتمال فتح قنوات للKv7 هو الحد الأدنى، ل+16 بالسيارات التي من احتمال فتح قنوات تصل إلى Kv7 الهضبة، وبعد 5 ثانية في كل اختبار الجهد، خطوة الى الوراء لعقد الجهد (إم -4) لمدة 10 ثانية. سوف يستغرق حوالي 3.5 دقيقة لسلسلة كاملة من البقول اختبار (الشكل 3A). 2-3 تنفيذ مراقبة التسجيلات الرابع للتأكد من أن التيارات سجلت مستقرة على مر الزمن. مؤامرة متوسط ​​نهاية نبض التيارات (متوسطالتيارات المسجلة لثانية 1 السابق) مقابل الجهد لخلق منحنى الرابع (الشكل 3D). ينبغي IV منحنيات السيطرة فرضه تقريبا إذا التيارات مستقرة.
  8. قبل تطبيق أي وكلاء الدوائية بدء دوام بروتوكول مصممة لتسجيل مستمر الحالي في بالسيارات -20. ضمان تسجيل مستقرة للتيار لمدة لا تقل 5 دقائق قبل تطبيق الدواء. تطبيق كلاء الدوائية لمدة بين 5-15 دقيقة أو حتى يتم التوصل إلى حالة مستقرة-(الشكل 3C)؛ ثم إنهاء بروتوكول دوام وسجل اثنين من منحنيات IV باستخدام بروتوكول الجهد الخطوة. تبييض المخدرات وبالطبع تسجيل وقت تبييض المخدرات، تليها تسجيل اثنين من منحنيات IV إضافية.
  9. في نهاية التجربة تطبيق 10 ميكرومتر أو linopirdine 10 ميكرومتر XE991، مثبطات لا رجعة فيه Kv7 القنوات، وهذه الأدوية يجب أن تمنع تماما التيارات الفولتية السلبية المسجلة في لبالسيارات -20 (الشكل 3D).

5. استخدام شرائح الشريان سليمة لتخطيط العضل الضغط

  1. ويستخدم نظام الضغط مخطاط العضل شراؤها من التكنولوجيا ميو الدنماركية (DMT A / S، الدنمارك، الموديل 110P) لضغط التجربة تخطيط العضل. تحميل الجزء الشريان في قاعة الفولاذ المقاوم للصدأ وذلك بإضافة ثابتة أفقيا قنية الزجاج اليسار إلى نهاية واحدة والمنقولة قنية الزجاج الحق في الطرف الآخر. يتم بناؤها محولات الضغط اثنين (P1 على الحق وP2 على الجانب الأيسر) في رصد الضغط داخل تجويف الشريان. وسيتم استخدام السائل من الزجاج قنية الحق في ضبط الضغط داخل الشريان إلى مستواه الفسيولوجية تقريبية. لتبدأ، قبل ملء مفتوح حقنة مل 10 (بمثابة العمود ضغط الجاذبية تغذية)، مع حل التجويف (الجدول 1). رفع حقنة لدفع سولونشوئها عبر أنابيب البولي ايثيلين في قنية الزجاج الحق، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء في أنابيب أو قنية. وينبغي على اليسار قنية مسبقا مليئة الحل التجويف عن طريق حقنة 1 مل. ملء الغرفة مع الضغط مخطاط العضل 10 مل من محلول حمام السفينة (الجدول 1). تعليق فضفاضة اثنان قبل الصنع خيوط النايلون غرامة على كل جانب بالقرب من القنيات الزجاج.
  2. نقل بعناية تشريح الشريان المساريقي قطعة (عادة ما يكون النظام ال 3 ش أو 4 الجزء، حول 200 حتي 350 ميكرومتر في القطر؛ من الخطوة 2.6) من غرفة تشريح للضغوط غرفة مخطاط العضل من خلال عقد واحد على نهاية الجزء الخاص الصغيرة ملقط.
  3. تصور من خلال مجهر تشريح مضيئة، وعقد واحدة من نهاية الجزء الشريان وحرك برفق على يسار قنية الزجاج وتأمين نهاية باستخدام الخيوط الجراحية النايلون. تدفق السائل بلطف من خلال التجويف السفينة التي شنت لإزالة الدم والحطام داخل السفينة.وينبغي بعد ذلك صمام إلى اليسار حقنة تكون مغلقة حتى هذا الجانب يمثل العمود ثابت من السوائل على أساسها يتم ضبط ضغط من الجانب الأيمن.
  4. باستخدام مياداة مجهرية، ضع المنقولة قنية الزجاج الحق أقرب إلى الجزء الشريان وسحب الطرف الأيمن للجزء أكثر من ذلك، وتأمين أخيرا مع خيوط النايلون. مقطع من على المواضيع خياطة الزائدة.
  5. تركيب وحدة مخطاط العضل الضغط على المسرح خلال الضغط المجهر مخطاط العضل. وضع غطاء على ضغط الدائرة مخطاط العضل. الغطاء عن غرفة تحتوي على مدخل superfusion وأنابيب شفط المرتبطة به. ربط مدخل إلى superfusion متعددة للسماح superfusion من حمام درجة حرارة الغرفة أو 60 ملي بوكل حل في غرفة الضغط مخطاط العضل عن طريق الجاذبية. عموما يتم تطبيق المواد الاختبار، مثل المخدرات أو الهرمونات التي توجد في المشبك التصحيح القياسات أن تؤثر على وظيفة قناة Kv7، مباشرة إلى حل حمام، وليس عن طريق حمام سوبerfusion أو في الحل التجويف. سيتم استخدام superfusion من حل حمام لتغسل الحل بوكل. إرفاق أنابيب الشفط لنظام فراغ لإزالة superfusate الزائدة. إدراج استشعار درجة الحرارة في الحمام الحل من خلال فتح غطاء المقدمة في غرفة مخطاط العضل.
  6. توصيل الوحدة مخطاط العضل الضغط على نظام ميو واجهة، والأجهزة التي تمكن الاتصالات من وحدة مخطاط العضل إلى برنامج myoview (DMT).
  7. فتح برنامج myoview في الكمبيوتر. في إطار معلمة، تعيين درجة حرارة الهدف ك C ° 35 التسامح مع درجة الحرارة من 1 ° C، الهدف ضغط تدفق و80 مم زئبق وضغط تدفق الهدف إلى 80 مم زئبق. تحميل ملف معايرة ومعايرة قطر السفينة الخارجي بحيث يتم تسجيل التغييرات في قطر الشريان بدقة في ميكرون. ضبط التباين حسب الضرورة لتمكين عرض جيد للجزء شنت ضد الخلفية. وصف مفصل لكيفية استخدام البرنامجوتقدم في دليل المستخدم من DMT.
  8. رفع المحقنة تدريجيا مل 10 (بمثابة العمود ضغط الجاذبية تغذية) على مدى فترة من 15 دقيقة حتى محول الضغط P1 يقرأ 80 مم زئبق. بينما رفع ضغط العمود، تحقق من وجود أي تسرب في السفينة. إذا كان هناك أي تسرب، تجاهل الجزء وجبل مقطع آخر الشريان (كرر الخطوات من 5.2). ضبط المسافة بين القنيات عند الضرورة. ينبغي تعديل المسافة في مثل هذه الطريقة أن الجزء الشريان الضغط مستقيم تقريبا (ولكن امتدت لا) ويشكل الكتف مثل النمط حيث تتخذ العلاقات (الشكل 4A).
  9. بدوره على تسخين الضغط من خلال غرفة مخطاط العضل عناصر التحكم في نظام واجهة ميو. يسمح الحل لتدفئة الحمام تدريجيا حتى تصل 36-37 ° C.
  10. استخدام التعديلات XYZ هدف في المجهر DMT عند الضرورة للحفاظ على السفينة في التركيز وتسهيل تتبع دقيق للCHanges في قطر السفينة الخارجي.
  11. التحقق من صلاحية السفينة التي مارستها superfusion عابرة (~ 30 ثانية) مع بوكل 60 ملم. سفينة قابلة للحياة يضيق بسرعة على إضافة بوكل ويتوسع فور تبييض ملي بوكل من 60 (superfuse حوالي 60 مل من محلول لغسل الحمام خارج بوكل). بعد هذا الاختبار، إعادة ضبط حجم المحلول إلى حمام بالضبط 10 مل. يتم تقليل درجة حرارة الحمام أثناء الاختبار بوكل وتبييض لأن هذه الحلول هي في درجة حرارة الغرفة، ولكن سخان الغرفة ستقوم استعادة درجة الحرارة إلى 36-37 درجة مئوية في غضون بضع دقائق.
  12. تسمح الشريان لتتوازن للا يقل عن 30 دقيقة (القطر يجب أن تكون مستقرة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة الأخيرة من هذه الفترة). إضافة مادة الاختبار المركزة في حل حمام مباشرة وماصة بلطف ذهابا وإيابا بالقرب من حواف الدائرة لخلط مادة الاختبار في حل حمام، مما أسفر عن تركيز المناسبة النهائي في المجلد 10 غرفة مل. تشانيمكن رصدها في الآتي GES بالإضافة سفينة القطر من مادة الاختبار (ق) في الصورة ورسمت لقطات فيديو حية أيضا في الصورة إطار التحليل في حين أن التجربة قيد التقدم.
  13. بعد الانتهاء من التجربة، يمكن فتح البيانات المخزنة (*. ميو) الملف كملف جدول بيانات لمزيد من التحليل.

6. ممثل النتائج

النتائج مبين في الشكل 3 توضيح تسجيلات نموذجية من التيارات Kv7 من myocytes الشريان المساريقي باستخدام بروتوكول خطوة الجهد قبل (الشكل 3A، B آثار الأسود) وأثناء العلاج مع قناة بيريثيون الزنك Kv7 المنشط (ZnPyr، 100 نانومتر؛ 3A الشكل، B آثار أحمر). وبلغ متوسط ​​مماثلة البيانات الخطوة الجهد من 3 خلايا لإعداد الحالية ذات الجهد (IV) هو مبين في المخططات 3D الشكل. دورة الوقت ممثل تعزيز السعة الحالية (التي تقاس المشبك الجهد المستمر في بالسيارات -20) الزيتوويرد ز العلاج مع الزنك بيريثيون 100 نانومتر في الشكل 3C الشكل 4B يوضح مسار الوقت للتأثير على قطر ZnPyr الشريان المساريقي الخارجي قياسها باستخدام تخطيط العضل الضغط؛ السفينة كانت مقيدة قبل مع 100 فاسوبريسين أرجينين مساء (AVP) قبل إضافة ZnPyr 100 نانومتر. وتظهر متوسط ​​الجرعة والاستجابة للبيانات التي يسببها تمدد ZnPyr الشريان المساريقي في الشكل 4C.

الشكل 1
الشكل 1. صورة لممر المساريقي في غرفة تشريح.

الشكل 2
الشكل 2. صورة لخلية عضلية مع ماصة التصحيح على سطحه.

الشكل 3
الشكل 3. آثار الأصل من تيارات Kv7، ملعب الوقت من المخدرات تطبيق، والمنحنيات IV. A. العائلة من آثار متتابعة الحالي (اللوحة السفلى) سجلت ردا على الخطوات الجهد (اللوحة العلوية) قبل العلاج (السيطرة، أسود) وتحقيق الاستقرار التالية في وجود ZnPyr نانومتر 100 (الحمراء) في MASMC واحد. B. آثار الممثل الحالي من A (كما يتبين من رؤوس الأسهم) للسيطرة (السوداء) وZnPyr نانومتر 100 (الحمراء). خطوط رمادية تشير إلى الفاصل الزمني حيث تم قياس متوسط ​​سعة الحالية للمؤامرات (IV) الجاري الجهد. يشار إلى الفولتية خطوة على رؤوس سهام الحق. C. بالطبع وقت Kv7 تعزيز ZnPyr الحالي بنسبة 100 نانومتر قياس الجهد المستمر مع المشبك في -20 بالسيارات (بار). D. متوسط ​​IV منحنيات (ن = 3) المستمدة من Kv7 الكثافة الحالية سجلت قبل (التحكم، والدوائر شغل)، خلال فترة العلاج مع ZnPyr نانومتر 100 (الدوائر المفتوحة)، وخلال فترة العلاج مع 10 ميكرومتر XE991 (مثلثات شغل). تم طرح التيارات تسرب غير محددة كما وصفها آخرون باسمور 1.

الأنف والحنجرة "> الشكل 4
الشكل 4. ZnPyr الناجم عن استرخاء في الشريان المساريقي قبل ضيق مع AVP PM 100. شنت الصورة A. من الشريان المساريقي في مخطاط العضل الضغط انشاء. B. بالطبع وقت التغييرات في القطر الخارجي للسفينة ردا على تطبيق AVP PM 100 (بار مفتوح) ثم طلب من ZnPyr نانومتر 100 (بار شغل). C. بار الرسم البياني يلخص النتائج من 100 vasodilaion ZnPyr التي يسببها نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب والنهج التجريبي الموصوفة هنا هي قوية جدا ويمكن أن تسفر عن نتائج واضحة وقابلة للتكرار عندما يطبق مع الاهتمام بالتفاصيل الدقيقة. التسجيلات الكهربية جيدة وانقباض / تمدد الشرايين قطاعات تعتمد على صحة الخلايا وشرائح الشريان، على التوالي. يمكن الاستعدادات الخلية تختلف من يوم لآخر، حتى باستخدام نفس البروتوكول. يمكن استخدام حلول العزلة لمدة تصل الى 2 أسابيع، ولكن إذا كانت نوعية إعداد خلية هناك انخفاض في يومين يترتب على ذلك ينبغي إعداد حلول عزل الجديدة. لقد وجدنا أن الأنشطة انزيم تختلف من دفعة لدفعة ظروف العزلة، وبالتالي (زمن الحضانة وتركيزات الإنزيمات) تتطلب التحسين مع كل دفعة جديدة من الانزيمات. كما وجدنا أن البروتوكول العزلة خلية وصفها هنا لالشريان المساريقي الفئران ليست الأمثل لأسرة الأوعية الدموية الأخرى أو الأنواع الأخرى، والتي قد يكون لها مزيجا مختلفا أو أوكارإيتي من مكونات المصفوفة خارج الخلية. كل الأوعية الدموية يتطلب إعداد الأمثل خاصة بها لتحديد الظروف التي تنتج الخلايا أصح. المعايير التي نجد مفيدة للغاية في تحديد الخلايا السليمة هي: 1) شكل الخلية: مظهر ناعم، ممدود، ولكن في حدود ضيقة قليلا بعد الطحن شرائح MA في الحل يحتوي على 50 ميكرومتر عزل كا 2 +، والإبقاء على نفس المظهر عندما نقل إلى 2 ملي كا 2 + التي تحتوي على حل خارجي. لن تحتفظ كل الخلايا شكلها ممدود ما يقرب من الاسترخاء التام، ولكن ينبغي أن تستخدم فقط ما يقرب من myocytes خففت تماما لتسجيل الكهربية، 2) يجب أن تكون خلايا كثيفة بصريا، والذي يدل على وجود غشاء سليمة غير تالفة، 3) الفولتية غشاء يستريح صحية تستخدم لmyocytes يجب أن التيارات البوتاسيوم أو سجل الجاري المشبك التسجيلات من الجهد غشاء يكون أكثر سلبية من -40 بالسيارات (عادة في حدود -45 -56 بالسيارات إلى بالسيارات في ظل الظروف الأيونية قصرفي بروتوكول صفه ب دينا هنا).

لضمان التسجيلات الكهربية ناجحة، والحل والحل حمام ماصة (لتكوين أنظر الجدول 1) يجب أن تكون مستعدة في يوم التجربة. لا بد من ضبط الأسمولية من الحلول على الصعيدين الداخلي وحمام لتكون مماثلة (298-299 الميلي أسمول).

أدلى إسوي الضغط الشرياني وظيفة القياسات المحرز في الشرايين الصغيرة (<500 ميكرون) باستخدام تخطيط العضل الضغط عن كثب تقريبي الظروف الفسيولوجية من القيام قياسات القوة متساوي القياس باستخدام السلك مخطاط العضل. السفن في مخطاط العضل الضغط وعادة ما تكون أكثر حساسية للمنبهات مضيق للأوعية 2-4، على نحو أوثق تقارب الحساسيات في الجسم الحي قياس 5، 6. وقد مكنت زيادة الحساسية لتركيزات منخفضة من ناهضات تحديد آليات نقل الإشارة الناجمة عن تركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية بيكو مولي من AVP7 و 8.

تخطيط العضل الضغط يحافظ على هندسة السفن ويحافظ على سلامة البطانة. ويمكن تمييز البطانة بوساطة آثار المخدرات من آثار العضلات بوساطة سلس عن طريق إجراء قياسات موازية في الأوعية سليمة والبطانة المعري-9. ويمكن تحقيق تعطيل متعمد للالبطانة عن طريق اتلاف فعليا البطانة (على سبيل المثال عن طريق تمرير شعرة الإنسان ذهابا وإيابا من خلال التجويف) أو عن طريق الهواء من خلال perfusing تجويف الشريان. ينبغي تأكيد فقدان وظائف بطانة الأوعية الدموية (ولكن ليس وظيفة العضلات الملساء الوعائية) عن طريق قياس استجابة لانخفاض عائي البطانة بوساطة لأستيل في الأوعية قبل ضيق مع ناهض 9.

بالتوازي قياسات التيارات الأيونية / غشاء الجهد في myocytes الشريان المساريقي باستخدام تقنيات المشبك التصحيح وانقباض الشرايين / الشريان المساريقي تمدديمكن استخدام تخطيط العضل وفاق ضغط تمكين الكشف عن أدوار محددة القنوات الأيونية في كل من أجهزة الطرد المركزي الفسيولوجية ونقل الإشارة في أعمال العوامل العلاجية. ويمكن تطبيق العلاج استهداف فئات معينة من القنوات الأيونية أو وسيطة محددة أو نقل الإشارة additively في تسلسل لتوفير المعلومات آليا حول دور كل من هذه القنوات في تنظيم وظيفة خلية عضلية على المستوى الخلوي وانقباض في / تمدد الشرايين سليمة. نتائج متقاربة من العلاجات التي تعزز أو تمنع أنواع معينة من التيارات الأيونية مع الآثار المقابلة على قطر الشريان تقديم تفسيرات أكثر موثوقية من يمكن الحصول باستخدام الأسلوب نفسه. من الناحية المثالية، ينبغي تحديد تركيز الاعتماد من وكلاء قيد الدراسة في كلا النظامين. لتقييم أهمية الفسيولوجية أو العلاجية، ينبغي أن تكون ذات صلة تركيزات اختبار لقياس تركيزات في البيئة الفسيولوجية سحققت R مع العلاجات السريرية. ويمكن الاطلاع على أمثلة من هذه الأنواع من المناهج التجريبية في 8-10 لدينا المنشورات السابقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من القلب والرئة والدم المعهد (NIH-R01 HL089564) لKLB وقبل الدكتوراه المنح الدراسية من جمعية القلب الأمريكية (09PRE2260209) وآرثر لمؤسسة J. شميت BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. Intech. (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics