Exploring arteriella glatta muskel KV7 Funktion kaliumkanal med Elektrofysiologi Patch Clamp och tryck Myography

Published 9/14/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Mätningar av KV7 (KCNQ) kalium kanal aktivitet i isolerade arteriella myocyter (med patch clamp elektrofysiologiska tekniker) parallellt med mätningar av constrictor / dilator svar (med tryck myography) kan avslöja viktig information om roller KV7 kanaler i vaskulär glatt muskulatur fysiologi och farmakologi.

Cite this Article

Copy Citation

Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sammandragning eller avslappning av glatta muskelceller i väggarna i motståndet artärer bestämmer artären diameter och därmed styr blodflödet genom kärlet och bidrar till det systemiska blodtrycket. Kontraktionen Processen regleras primärt av cytosolisk kalciumkoncentration ([Ca 2 +] CYT), som i sin tur styrs av en mängd olika jon transportörer och kanaler. Jonkanaler är vanliga mellanprodukter i signaltransduktionsvägar som aktiveras av vasoaktiva hormoner för att åstadkomma vasokonstriktion eller vasodilatation. Och jonkanaler ofta måltavla för läkemedel uppsåtligen (t.ex. kalciumkanalblockerare som används för att framkalla vasodilatation och lägre blodtryck) eller oavsiktligt (t.ex. för att framkalla oönskade kardiovaskulära biverkningar).

KV7 (KCNQ) spänning-aktiverade kaliumkanaler har nyligen varit inblandad som viktiga fysiologiska och terapeutiska TargETS för reglering av kontraktion av glatt muskulatur. Att belysa specifika roller KV7 kanaler i både fysiologiska signaltransduktion och handlingar terapeutiska medel, måste vi studera hur deras aktivitet moduleras på cellnivå samt utvärdera deras bidrag i samband med den intakta artären.

Råtta mesenteriska artärer ger en användbar modell-system. Artärerna kan lätt dissekeras, rengörs från bindväv, och användes för att framställa isolerade arteriella myocyter för patch-clamp-elektrofysiologi, eller kanyleras och trycksattes för mätning av kärlsammandragande / vasodilaterande svar under relativt fysiologiska betingelser. Här beskriver vi de metoder som används för båda typer av mätningar och ge några exempel på hur den experimentella designen kan integreras för att ge en bättre förståelse för de roller dessa jonkanaler i regleringen av vaskulär ton.

Protocol

1. Kirurgisk excision av tunntarmen mesenterica Vaskulär Arcade

  1. Söva en 300-400 g Sprague-Dawley-råtta med isofluran (4%) administreras genom inhalation.
  2. Utför en mittlinje laparotomi att exponera tunntarmen tarmkäxet. Exteriorize den lilla och stora tarmen genom buksnitt med stor omsorg för att undvika trauma till exponerade tarm och tarmkäx. Försiktigt lufta krös ut över steril gasbinda.
  3. Kirurgiskt punktskatt tunntarmen och en del av tjocktarmen, inklusive blindtarmen (blodkärl Skär försiktigt längs marginalerna och ursprunget från de primära grenarna av överlägsna mesenterica artär / ven).
  4. Överför den utskurna vävnaden till en bägare innehållande iskall dissekera lösning (tabell 1).
  5. Efter excision av tarmen, bör råttan humant avlivas under anestesi.

2. Dissektion ettd Rengöring av artärer

  1. Överför utskurna tarmen och mesenteriska arkad till en kyld dissekera kammare (4-5 ° C) innehållande dissekera lösning. Kammaren består av en 100-mm glas Petri-skål med en SYLGARD 184 elast bas att rymma dissekera stift, petriskålen placeras i en kyld bas som hålles vid 4-5 ° C med ett cirkulerande vattenbad.
  2. Användning av kirurgiska saxar klippa en ca 10-12 cm segment av hela tarmen. Skär vid varje ände av tarmen segmentet hålla sin vaskulatur fäst och ta bort den oanvända tarmen från kammaren lämnar ett segment med sin tillhörande vaskulatur (mesenteriska arkad) i isolering.
  3. Nåla ner segmentet tunntarmen, sprida tarmkäxet över nära sidan av kammaren, så att den primära grenen av den överlägsna mesenterica artär / ven är i centrum och de efterföljande order grenar strålar från centrum (Figur 1). Pl Ace stiften endast på de intestinala segment (inte på blodkärlen).
  4. Skilj artärerna från venerna av deras relativt klarröd färg, tjocka väggar och karakteristiska V-formade grenar, snarare än de U-formade grenar sett i venerna.
  5. Visualisera genom en upplyst dissekeringsmikroskop försiktigt bort fettvävnad och bindväv som omger 2: a - 4: ​​e ordningens artärer nära tarmen (streckad cirkel i figur 1) med mikro pincett och sax. Håller intilliggande vener underlättar rensa fettvävnad och bindväv. Undvik onödig sträckning av artärerna.
  6. Mesenterialartären segment rensas av bindväv kan sedan dissekeras ut och användas för cellisolering (för encelliga patch clamp studier § § 3-4) eller kanyl för tryck myography (avsnitt 5). Klipp segment mellan förgreningspunkter, vanligtvis upp till 1 cm långa.
jove_title "> 3. cellisolering för studier patch clamp

  1. Förbered 0,5 liter Isolering Solution (tabell 1) och dela upp den i 2 delar innan justering av pH Den första delen (vanligen 100 ml) bör värmas upp till 37 ° C och pH-värdet bör justeras till 7,2 vid 37 ° C (37 ° C Isolering lösning). Den andra delen av Isolering Lösningen bör kylas ned till 4 ° C och pH-värdet bör justeras till 7,2 vid 4 ° C (is Cold Isolation lösning). Efter pH-justering, måste osmolariteten båda lösningarna anpassas till 298 mOsm genom tillsats av en lämplig mängd av D-glukos eller H 2 O
  2. Överför 2 ml av 37 ° C Isolering lösning till en glasflaska och inkubera vid 37 ° C för användning i steg 3,4. Tillsätt 20 mg bovint serumalbumin (BSA) till 10 ml av 37 ° C Isolering lösning, lös, åter varm till 37 ° C och justera pH-värdet till 7,2. Till 2 ml av denna lösning 4 mg kollagenas typ VIII (Sigma, sats 089K8612: 633 units / mg kollagenasaktivitet, 285 enheter / mg Caseinase aktivitet, 1,6 enheter / mg Clostripain aktivitet), 0,64 mg elastas typ IV (Sigma, Lot 110M7025V 5,9 enheter / mg, tillsätt 40 ul av en 16 mg / ml lager framställts i 37 ° K Isolering Lösning) och 2 pl av 1 M DL-ditiotreitol (DTT Sigma), före varm denna enzymlösning till 37 ° C i förberedelse för steg 3,5.
  3. Överför 2-3 segment av mesenterialartären till en 35-mm vävnadsodlingsskål innehållande 2 ml iskallt Isolering Solution och placera skålen på is. Skär mesenterialartären segment i 3-4 mm långa bitar.
  4. Med hjälp av en pasteurpipett med eld polerad spets (för att förhindra skada på artärer) överföra de arteriella segment i en glasflaska (15 x 45 mm, 1 dram) innehållande 2 ml förvärmd 37 ° C Isolering lösning och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
  5. Efter 30 minuter, försiktigt aspirera 37 ° C Isolering lösningen med en Pasteur-pipett, tillsätt 2 ml varm enzymlösning och inkubera 35 minutervid 37 ° C.
  6. Omedelbart efter 35 minuters inkubation i enzymlösningen, placera flaskan på is, aspirera enzymlösningen och tillsätt 2 ml iskall Isolering Solution (upprepa aspiration och tillsats av färsk Ice Cold Isolering Lösning 4 gånger). Sedan i en volym av 1 ml iskall Isolering lösning försiktigt triturera arteriella segment med de polerade Pasteurpipett 10-20 gånger för att frigöra enskilda mesenteriska artär glatta muskelceller (MASMCs).
  7. Regelbundet kontrollera myocyter utseende genom att placera en droppe av cellsuspensionen på en 35-mm skål och visning under ett mikroskop. Friska MASMCs bör ha en jämn långsträckt utseende. Inte alla celler i artärväggen kommer att släppas. Cellsuspensionen bör hållas på is.
  8. En annan användbar indikator på MASMC hälsa är deras tolerans av fysiologiska Ca 2 + koncentrationer. Fyll inspelning kammare (Bioscience Verktyg, # CSC-25L) med badkar solution innehållande 2 mM CaCb 2 (pH 7,3 vid rumstemperatur (RT), för komposition se tabell 1) och position-agar bro (böjt glas kapillär fylld med 2% agar i 2 M KCl, införd i referenselektroden (Warner Instrument, REF -3L)) inuti kammaren. Använda polerade Pasteur-pipett cirka 100-200 pl cellsuspension till en inspelning kammare och tillåta cellerna att vidhäfta under 15 minuter. Oskadade celler bör inte ihop signifikant i 2 mM CaCl 2-innehållande lösning (celler bör verkar vara långsträckta eller stavformad, inte avrundas uppåt till bollar).
  9. Efter tillsats första alikvoten av cellsuspensionen till inspelningen kammaren, 0,25 ml badlösning innehållande 2 mM CaCl2 bör läggas till den återstående volymen av cellsuspension. Denna återstående cellsuspension kan bibehållas i denna lösning på is och användes för patch clamp inspelning för upp till 6 timmar.

4.Användning av helcell Patch Clamp att mäta KV7 kaliumströmmar eller membran Spänning

  1. Efter myocyter följa glasfot för inspelningen kammarens (25-mm Antal 1 v täckglas, Warner Instruments), initiera kontinuerlig perfusion av badlösningen (tabell 1). För inspelning av KV7 strömmar i isolering från försenade strömmar likriktare kalium av KV1 och KV2 familjer bör badet lösningen kompletteras med 100 M GdCl 3.
  2. Framställ en patch-pipett från borsilikatglas (Kimax-51, Kimble Chase) med användning av en pipett avdragare och microforge, dess motstånd bör vara 4-5 MQ när de fylls med intern lösning (tabell 1). Bestryk undre 1/3 av pipetten (~ 1-2 mm ovanför spetsen) med SYLGARD 184.
  3. För inspelning av KV7 strömmar i MASMCs bör perforerade patch hela cellspänning klämma teknik användas. Användning av en perforerad lapp konfiguration hjälper till att förhindra depletion membran fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP 2) och efterföljande snabb (inom 5 minuter) genomgång av de KV7 strömmarna, som vanligen observeras med den konventionella brustna plåstret konfiguration. Komplettera intern lösning (tabell 1) med 120 pg / ml amfotericin B: tillsätt 3 pl 2 mg / ml lager av amfotericin B (framställd i DMSO och förvaras fryst i små portioner och skyddas från ljus) till 0,5 ml intern lösning. Fyll spets fläckpipetten med Amphotericin B-fri inre lösningen genom doppning av pipettspetsen i amfotericin B-fri intern lösning och sedan applicera sug på den andra änden med hjälp av en 10 ml spruta fäst via en slang (Tygon R- 3603). Lägg amfotericin B-innehållande pipett lösning från toppen med hjälp av en Eppendorf Microloader pipettspetsen tills pipetten är ungefär hälften fylld med lösning. Ta bort eventuella luftbubblor genom att försiktigt knacka på pipetten. Använd pipetten direkt.
  4. Sätt pipettentill elektrodhållaren och använda en mikromanipulator för att sänka pipetten till ytan av en långsträckt myocyt (nära, men inte på toppen av kärnan, figur 2). När motståndet i pipetten ökar till 6-10 MQ, avsugning för att åstadkomma en giga-tätning (> 10 GΩ).
  5. Ställ hålla spänningen till 0 mV i väntan på membran perforering. Applicera 100 ms spänningssteg till +10 mV och därefter till -10 mV, och använda förstärkaren att kompensera snabba transienter pipett kapacitans. Samtidigt med uppkomsten av hela transienter cell kapacitans, små ihållande positiva strömmar (vanligtvis 2-10 pA) indikerar förekomst av funktionella KV7 kanaler.
  6. Framgångsrik perforering med amfotericin B minskar tillgången resistens mot 35 MQ eller mindre. Aktuella inspelningen kan sedan initieras med hjälp av en 5 sekunder protokoll spänning steg från -4 mV innehav spänning. Vi använder -4 mV håller spänning för att uppnå nära maximal inaktivering av andra typer av fördröjd rectifier kalium strömmar (förmedlad huvudsakligen av KV1 och KV2 kanaler) som annars skulle förorena inspelningen av de relativt små icke-inaktiverande KV7 strömmar. Den långa (5 sek) spänningssteg protokollet är nödvändigt för att uppnå steady-state aktivering av KV7 kanaler, vilka uppvisar långsam spänningsberoende aktivering och deaktivering. De KV7 strömmarna inte inaktivera inte under ihållande spänningssteg.
  7. För att spela in KV7 ström-spänning (IV) förhållande, tillämpas 5 sek spänningssteg till spänningar mellan -84 mV, vid vilken den öppna sannolikheten KV7 kanaler är minimal, till +16 mV vid vilken den öppna sannolikheten KV7 kanaler når en platå, efter 5 sek vid varje test spänning, gå tillbaka till att hålla spänningen (-4 mV) i 10 sek. Det kommer att ta cirka 3,5 min för fullständig serie testpulser (Figur 3A). Utför 2-3 kontroll IV inspelningar att säkerställa att de registrerade strömmarna är stabila över tiden. Tomt genomsnitt slut puls strömmar (genomsnittströmmar registreras för sista 1 sek) kontra spänning för att skapa en IV kurvan (Figur 3D). Kontrollaktiviteterna IV kurvor bör vara ungefär överlagras om strömmarna är stabila.
  8. Innan någon farmakologiska medel initierar ett protokoll tidsförlopp utformad att kontinuerligt registrera ström vid -20 mV. Säkerställa stabil registrering av strömmen för minst 5 min före läkemedelsapplicering. Tillämpa farmakologiska medel för 5-15 minuter eller tills en steady-state uppnås (figur 3C), sedan avsluta protokollet tidsförloppet och spela två IV kurvor med hjälp av spänning-steg-protokollet. Washout läkemedlet och registrera tidsförloppet av läkemedel washout, följt av inspelning av två ytterligare IV kurvor.
  9. Vid slutet av experimentet gäller 10 M linopirdine eller 10 M XE991, irreversibla hämmare av KV7 kanaler, dessa läkemedel bör fullt hämmar strömmarna inspelade vid spänningar negativ till -20 mV (figur 3D).

5. Användning av intakta Artery segment för tryck Myography

  1. Ett tryck myograph-system köps från danska Myo Technology (DMT A / S, Danmark, modell 110p) används för trycket myography experimentet. Montera artären segmentet i kammare av rostfritt stål genom att sätta den horisontellt fixerad vänstra glas kanyl in i en ände och den rörliga högra glaset kanyl in i den andra änden. Två tryckomvandlare (P1 till höger och P2 på vänster sida) är inbyggda i att övervaka trycket inuti artären lumen. Fluid från den högra glaset kanylen kommer att användas för att justera trycket inuti artären till sin ungefärliga fysiologisk nivå. Till att börja, före fylla en öppen 10 ml spruta (tjänar som ett gravitationsmatning lågtryckskolonnen), med lumen lösning (tabell 1). Höj sprutan för att driva lösningarning via polyetenrör i rätt glas kanylen, var noga med att undvika luftbubblor i slangen eller kanyl. Den vänstra kanyl ska förfylld med lumen lösning via en 1 ml spruta. Fyll kammartrycket myograph med 10 ml av kärlets badlösningen (tabell 1). Löst avbryta två färdiga fina nylonsuturer på varje sida intill glaset kanyler.
  2. Försiktigt överföra dissekerade segmentet mesenterialartären (vanligen en 3: e eller 4: e ordningen segmentet, cirka 200 till 350 pm i diameter, från steg 2,6) från dissekera kammaren till trycket myograph kammaren genom att hålla i den ena änden av segmentet med hjälp av mikro pincett.
  3. Visualisera genom en upplyst dissekeringsmikroskop, håll ena änden av gatan segmentet och försiktigt skjuta den över vänstra glaset kanylen och fäst änden med hjälp av nylon suturer. Försiktigt spola lumen fluid genom monterade kärlet för att avlägsna blod och skräp inuti kärlet.Ventilen till vänster sprutan skall sedan stängas så att denna sida utgör en statisk kolonn av vätska mot vilken trycket justeras från den högra sidan.
  4. Använda mikromanipulator, placera rörliga rätt glas kanyl närmare artären segmentet och dra den högra änden av segmentet över det slutligen säkra den med nylonsuturer. Klipp bort överflödigt suturtrådar.
  5. Montera enheten trycket myograph på scenen under tryck myograph mikroskop. Placera locket över trycket myograph kammaren. Locket för kammaren innehåller superfusion inlopp och sugröret är fäst vid den. Anslut superfusion inloppet till ett samlingsrör för att möjliggöra superfusion av rumstemperatur bad eller 60 mM KCl-lösning i tryck myograph kammaren genom gravitation. Test ämnen, till exempel läkemedel eller hormoner som finns i mätningarna patch clamp att påverka KV7 kanal funktion, i allmänhet appliceras direkt på badet lösningen, inte via badet superfusion eller i lumen lösningen. Den superfusion av bad-lösning kommer att användas för att tvätta bort den KCl-lösning. Fäst sugledningen till ett vakuumsystem för att avlägsna överskottet superfusate. Sätt temperatursensorn i badlösningen genom öppningen anordnad i myograph lock.
  6. Anslut enheten trycket myograph till myo-gränssnittet system, hårdvara som möjliggör kommunikation av myograph enheten till Myoview programvara (DMT).
  7. Öppna Myoview mjukvaran i datorn. I parametern fönstret, ställ in måltemperatur som 35 ° C med en temperatur tolerans på 1 ° C, mål inflöde tryck som 80 mmHg och mål utflöde tryck som 80 mmHg. Ladda kalibreringsfil och kalibrera kärlet ytterdiameter så att ändringarna i artär diameter registreras korrekt i mikron. Justera kontrasten efter behov för att möjliggöra en god bild av den monterade segmentet mot bakgrunden. En detaljerad beskrivning av hur man använder programvaranfinns i bruksanvisningen från DMT.
  8. Gradvis höja 10 ml spruta (tjänar som ett gravitationsmatning lågtryckskolonnen) under en period av 15 min tills P1 tryckomvandlaren läser 80 mmHg. Samtidigt höja trycket kolumnen kontrollera eventuella läckor i kärlet. Om det finns några läckor, kasta segmentet och montera en annan artär segmentet (upprepa steg från 5,2). Justera avståndet mellan kanylerna vid behov. Avståndet bör justeras på ett sådant sätt att den trycksatta artär segmentet är ungefär rak (men ej sträckt) och bildar en skuldra som-mönster där banden görs (figur 4A).
  9. Slå på uppvärmning av trycket myograph kammare genom kontrollerna i myo-gränssnittet systemet. Låt badlösningen värmas gradvis tills den når 36-37 ° C.
  10. Använd XYZ justeringar av målet i DMT mikroskop vid behov för att hålla fartyget i fokus och underlätta korrekt spårning av lmAnges i yttre kärldiameter.
  11. Kontrollera livskraft monterade fartyget genom övergående superfusion (~ 30 sek) med 60 mM KCl. En livskraftig fartyg constricts snabbt vid tillsats av KCl och dilaterar omedelbart vid sköljning av 60 mM KCl (superfuse ca 60 ml badlösning att tvätta ut KCl). Efter detta test, justera volymen av badlösningen till exakt 10 ml. Temperaturen hos badet reduceras under KCl testet och uttvättning eftersom dessa lösningar vid rumstemperatur, men kammaren värmaren återställer temperaturen till 36-37 ° C inom några minuter.
  12. Låt artären att jämvikt under minst 30 minuter (diametern bör vara stabil under åtminstone de sista 10 min av denna period). Tillsätt koncentrerade testsubstans till badlösningen direkt och pipettera och tillbaka försiktigt nära kanterna av kammaren för att blanda testämnet i badlösningen, vilket gav den lämpliga slutkoncentrationen i 10 ml kammarvolym. ChanGES i kärldiametern efter tillsats av testsubstans (s) kan övervakas i live-videobild och även kartlagt i bildanalys fönstret medan experimentet pågår.
  13. Efter avslutad experimentet kan de lagrade data (*. Myo-fil) öppnas som ett kalkylblad för vidare analys.

6. Representativa resultat

De resultat som visas i figur 3 illustrerar typiska registreringar av KV7 strömmar från mesenteriala artären myocyter med ett spänningssteg protokoll före (Figur 3A, B svarta spår) och under behandling med en KV7 kanal aktivator Zn pyrition (ZnPyr, 100 nM, fig 3A, B röda spår). Liknande spänningssteg data från 3-celler beräknades för att framställa de ström-spänning (IV) plottar som visas i figur 3D. En representativ tidsförlopp för förbättring av strömamplituden (mätt med kontinuerlig spänning klämma vid -20 mV) During behandling med 100 nM Zn pyrition visas i figur 3C Figur 4B visar tidsförloppet av effekten av ZnPyr på mesenterialartären ytterdiameter mätt med tryck myography,. fartyget var pre-begränsade med 100 pM arginin vasopressin (AVP) före tillsats av 100 nM ZnPyr. Medelvärdesbildade dos-svarsdata för ZnPyr-inducerad mesenterica dilatation visas i figur 4C.

Figur 1
Figur 1. Bild på en mesenteriska arkad i dissekera kammaren.

Figur 2
Figur 2. Bild på en myocyt med en patch-pipett på dess yta.

Figur 3
Figur 3. Original spår av KV7 strömmar, tidsförloppet av läkemedel ansökan, IV kurvor. A. familj av sekventiella nuvarande spår (undre panelen) inspelade svar på spänningssteg (övre panelen) innan behandling (kontroll, svart) och efter stabilisering i närvaro av 100 nM ZnPyr (röd) i en enda MASMC. B. Representativa nuvarande spår från A (vilket indikeras av pilspetsar) för kontroll (svart) och 100 nM ZnPyr (röd). Grå staplar indikerar tidsintervall där genomsnittliga aktuella amplituder mättes för ström-spänning (IV) tomter. Steg spänningar anges på höger genom pilspetsar. C. Tidsförloppet för KV7 nuvarande förstärkning med 100 nM ZnPyr mätt med kontinuerlig spänningsklämma vid -20 mV (bar). D. genomsnittlig IV kurvor (n = 3) härledd från KV7 strömtätheter registreras före (kontroll, fyllda cirklar), vid behandling med 100 nM ZnPyr (öppna cirklar), och under behandling med 10 iM XE991 (fyllda trianglar). Ospecifika läckage strömmar subtraherades som beskrivs av Passmore et al. 1.

ENT "> Figur 4
Figur 4. ZnPyr inducerad avslappning av en mesenterialartären förväg trängd med 100 pM AVP. A. Fotografera av en mesenterialartären monterad i tryck myograph set-up. B. Tidsförlopp för förändringar i ytterdiameter av fartyget som svar på applicering av 100 pM AVP (öppen bar) följt av tillämpning av 100 nM ZnPyr (fylld stapel). C. Stapeldiagram sammanfattar resultaten av 100 nM ZnPyr-inducerad vasodilaion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder och experimentella metoder som beskrivs här är ganska robusta och kan leda till tydliga och reproducerbara resultat när den tillämpas med stor omsorg om detaljerna. Bra elektrofysiologiska inspelningar och sammandragning / utvidgning av arteriella segment är beroende av hälsa celler och segment artär, respektive. Cellpreparationer kan variera från dag till dag, även med samma protokoll. Isolering lösningar kan användas i upp till 2 veckor, men om kvaliteten på cellpreparatet är låg på två påföljande dagarna nya Isolering lösningar bör utarbetas. Vi har funnit att enzymaktiviteter varierar från sats till sats och därmed isolering förhållanden (tider av inkubation och koncentrationer av enzymer) kräver optimering med varje nytt parti av enzymer. Vi har också funnit att cellisolering protokoll som beskrivs här för rått mesenterialartären är inte optimal för andra vaskulära bäddar eller andra arter, som kan ha en annorlunda blandning eller denshet av extracellulära matrixkomponenter. Varje vaskulär förberedelse kräver en egen optimering för att identifiera förhållanden som producerar hälsosamma cellerna. De kriterier som vi finner mest användbara för att identifiera friska celler är: 1) cellmorfologi: slät, avlång, men något begränsade utseende efter triturering MA segment i isoleringen Lösning innehållande 50 M Ca 2 +, och behålla samma utseende när de överförs till 2 mM Ca 2 +-innehållande extern lösning. Inte alla celler kommer att behålla sin nästan helt avslappnad långsträckt form, men endast nästan helt avslappnad myocyter bör användas för elektrofysiologisk inspelning, 2) Celler bör vara optiskt tätt, vilket indikerar en intakt oskadad membran, 3) Resting membran spänningar friska myocyter används för rekord kalium strömmar eller för ström-clamp inspelningar av membran spänning bör vara mer negativ än -40 mV (vanligen i intervallet -45 mV till -56 mV under de joniska förhållanden described i vår protokoll här).

För att säkerställa framgångsrika elektrofysiologiska inspelningar badet lösningen och pipetten lösningen (för komposition se tabell 1) bör utarbetas på dagen för experimentet. Det är viktigt att anpassa osmolalitet både interna och bad lösningar vara identiska (298-299 mOsm).

Isobariska arteriella funktion mätningar i små artärer (<500 nm) med tryck myography närmare ungefärliga fysiologiska förhållanden än vad isometriska kraft mätningar gjorda med en tråd myograph. Fartygen i ett tryck myograph är oftast mer känsliga för kärlsammandragande agonister 2-4, närmare tillnärmning av känsliga mätt in vivo 5, 6. Den ökade känsligheten för låga koncentrationer av agonister har möjliggjort identifiering av mekanismer signalöverföringsmekanismer inducerad av fysiologiskt relevanta pikomolar koncentrationer av AVP7, 8.

Tryck myography bevarar geometrin hos kärlet och upprätthåller integriteten för endotelet. Endotel-medierade effekter av läkemedel kan särskiljas från glatt muskulatur-medierade effekter genom att utföra parallella mätningar i intakta och endotel-utblottad fartyg 9. Avsiktlig störning av endotelet kan åstadkommas genom att fysiskt skada endotelet (t.ex. genom att passera ett mänskligt hår och tillbaka genom lumen) eller genom perfusion av luft genom lumen hos artären. Förlusten av endotelfunktion (men inte vaskulär glatt muskulatur funktion) bör bekräftas genom att mäta en minskad endotel-medierad kärlvidgande respons på acetylkolin i fartyg före förträngda med en agonist 9.

Parallella mätningar av jonströmmar / membran spänning i mesenterialartären myocyter med metoder patch clamp och arteriell sammandragning / utvidgning av mesenteriska arteries med tryck myography kan möjliggöra klargörande av roller specifika jonkanaler i både fysiologiska signaltransduktionskaskader och handlingar terapeutiska medel. Behandlingar riktade mot särskilda grupper av jonkanaler eller specifika signal intermediärer transduktion kan tillämpas additivt eller i följd för att ge mekanisk information om roller dessa kanaler i regleringen av myocyt funktion på cellnivå och sammandragning / utvidgning av intakta artärer. Konvergerande resultat av behandlingar som förstärker eller hämmar vissa typer av joniska strömmar med motsvarande effekter på artär diameter ger mer tillförlitliga än tolkningar kan erhållas med endera metoden i sig. Idealt, bör koncentrationen beroendet av medlen som undersöks fastställas i båda systemen. För att bedöma fysiologisk eller terapeutisk relevans, bör de testade koncentrationerna relateras till koncentrationer som uppmätts i den fysiologiska miljön oR uppnås med kliniska behandlingar. Exempel på dessa typer av experimentella metoder kan hittas i våra tidigare publikationer 8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats av ett anslag från National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) till KLB och pre-doktorander stipendier från American Heart Association (09PRE2260209) och Arthur J. Schmitt stiftelsen BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. Intech. (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats