Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Published 9/14/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Metingen van KV7 (KCNQ) kaliumkanaal activiteit in geïsoleerde bloedvaten myocyten (met behulp van patch-clamp elektrofysiologische technieken), parallel met metingen van constrictor / dilatator reacties (met behulp van druk myografie) kunnen belangrijke informatie over de rol van KV7 kanalen in het gladde spierweefsel fysiologie en farmacologie.

Cite this Article

Copy Citation

Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Contractie of relaxatie van gladde spiercellen in de wanden van slagaders weerstand bepaalt de vaatdiameter en daardoor regelt bloedstroom door het vat en bijdraagt ​​aan systemische bloeddruk. De contractie wordt primair gereguleerd door cytosolische calciumconcentratie ([Ca 2 +] cyt), die op zijn beurt gecontroleerd door verschillende vervoerders en ion kanalen. Ion-kanalen zijn vaak tussenproducten in signaaltransductie pathways geactiveerd door vasoactieve hormonen aan vasoconstrictie of vaatverwijding te bewerkstelligen. En ionenkanalen worden vaak doelwit van therapeutische middelen opzettelijk (bijv. calciumantagonisten gebruikt om vaatverwijding en een lagere bloeddruk te wekken) of onbedoeld (bijvoorbeeld om ongewenste cardiovasculaire bijwerkingen veroorzaken).

KV7 (KCNQ) voltage-geactiveerde kaliumkanalen zijn onlangs betrokken als belangrijke fysiologische en therapeutische Targets voor de regulering van gladde spiercontractie. De specifieke rollen van KV7 kanalen in zowel fysiologische signaaltransductie en de acties van therapeutische middelen toe te lichten, moeten we onderzoeken hoe hun activiteit gemoduleerd op cellulair niveau en evalueren hun bijdrage in de context van het intacte slagader.

De rat mesenteriale slagaders zorgen voor een bruikbaar model systeem. De aders kunnen gemakkelijk worden ontleed, ontdaan van bindweefsel en gebruikt om geïsoleerde arteriële myocyten voorbereiden patch clamp elektrofysiologie of canule en druk metingen van vasoconstrictor / vaatverwijdende reacties onder relatief fysiologische omstandigheden. Hier beschrijven we de methoden voor beide metingen geven enkele voorbeelden van de proefopzet kan worden geïntegreerd om een ​​beter begrip van de rol van deze ionkanalen in de regulatie van de vasculaire tonus geven.

Protocol

1. Chirurgische excisie van de dunne darm Mesenteriale Vasculaire Arcade

  1. Verdoven een 300-400 g Sprague-Dawley ratten met isofluraan (4%) toegediend door inhalatie.
  2. Voer een middellijn laparotomie naar de dunne darm mesenterium bloot te leggen. Exterioriseren de dunne en dikke darm door de abdominale incisie met grote voorzichtigheid om trauma te voorkomen blootgestelde darm en mesenterium. Voorzichtig uitwaaieren het mesenterium uit over steriel gaas.
  3. Chirurgisch Snijd de dunne darm en een deel van de dikke darm, inclusief de caecum (bloedvaten mooigesneden langs de randen en de oorsprong van de primaire takken van de mesenterica superior / ader).
  4. Breng de uitgesneden weefsel naar een bekerglas met ijskoude ontleden oplossing (Tabel 1).
  5. Na excisie van de darm, moet de rat humane worden gedood terwijl onder verdoving.

2. Dissection eend Reiniging van de slagaders

  1. Breng de uitgesneden darm en mesenterische arcade een gekoelde ontleden kamer (4-5 ° C) bevattende oplossing ontleden. De kamer bestaat uit een 100 mm glazen petrischaal met een elastomeer Sylgard 184 base te ontleden kunnen accommoderen; de petrischaal geplaatst in een gekoelde base die bij 4-5 ° C gehandhaafd door een circulerend waterbad.
  2. Met behulp van chirurgische schaar snijden een ongeveer 10-12 cm segment uit de hele darm. Snijd aan beide uiteinden van de darm segment met behoud van de bloedvaten aangesloten, en verwijder vervolgens de ongebruikte darm uit de kamer verlaten van de ene segment samen met de verbonden vaatstelsel (mesenteriale arcade) in isolatie.
  3. Pinnen het segment van de dunne darm, verspreidt het mesenterium op de korte zijde van de kamer, zodat de eerste tak van de mesenterica superior / ader is in het centrum en de nabestellingen takken stralen van de (Figuur 1). Pl ace de pennen alleen op de dunne darm (niet op de bloedvaten).
  4. Onderscheiden slagaders aders door hun relatief helder rode kleur, dikke muren en karakteristieke V-vormige takken, in plaats van de U-vormige takken gezien in aderen.
  5. Visualiseren door een verlichte dissectiemicroscoop voorzichtig schakelt het vetweefsel en het bindweefsel rond de 2 - 4 Ode orde slagaders nabij de darmen (gestreepte cirkel in figuur 1) met micro tangen en scharen. Houd de aangrenzende aderen vergemakkelijkt het opruimen van de vetweefsel en bindweefsel. Onnodig uitrekken van de slagaders.
  6. A. mesenterica segmenten vrijgesproken van bindweefsel kan dan worden ontleed en gebruikt voor celisolatie (voor single-cell patch clamp studies, secties 3-4) of een canule voor druk myografie (hoofdstuk 5). Knip segmenten tussen vertakkingspunten, gewoonlijk tot 1 cm in lengte.
jove_title "> 3. Cell Isolatie van de Patch Clamp Studies

  1. Bereid 0,5 L van isolatie Oplossing (tabel 1) en verdeel het in 2 porties voor het instellen van de pH Het eerste gedeelte (meestal 100 ml) worden verwarmd tot 37 ° C en pH worden ingesteld op 7,2 bij 37 ° C (37 ° C Isolation Solution). Het tweede deel van de isolatie oplossing moet afgekoeld tot 4 ° C en pH worden ingesteld op 7,2 bij 4 ° C (Ijskoude Isolation Solution). Na pH instelling moet de osmolariteit van beide oplossingen worden aangepast aan mOsm 298 door toevoeging van een geschikte hoeveelheid D-glucose of H 2 O.
  2. Breng 2 ml van 37 ° C isolatieoplossing een glazen flesje en incubeer bij 37 ° C voor gebruik in stap 3.4. Voeg 20 mg van runderserumalbumine (BSA) aan 10 ml van 37 ° C isolatieoplossing, oplossen, opnieuw warm tot 37 ° C en stel de pH tot 7,2. Tot 2 ml van deze oplossing toe te voegen 4 mg collagenase type VIII (Sigma, Lot 089K8612: 633 uneten / mg Collagenase activiteit 285 eenheden / mg activiteit Caseinase, 1,6 eenheden / mg Clostripain activiteit), 0,64 mg elastase Type IV (Sigma, Lot 110M7025V 5,9 eenheden / mg; voeg 40 ul van een 16 mg / ml stock bereid in 37 ° C isolatieoplossing) en 2 pi 1 M DL-dithiothreitol (DTT Sigma); voorverwarmen deze enzymoplossing tot 37 ° C in voorbereiding stap 3.5.
  3. Overdracht 2-3 segmenten van de a. mesenterica in een 35-mm weefselkweek schotel met 2 ml van Ice Cold Isolatie Oplossing en plaats de schotel op het ijs. Snijd mesenterica segmenten in 3-4 mm lange stukken.
  4. Met een Pasteur pipet met vuur gepolijst tip (Om te voorkomen dat slagaders) overdragen van de arteriële segmenten in een glazen buisje (15 x 45 mm, 1 dram) dat 2 ml voorverwarmde 37 ° C Isolatie oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  5. Na 30 min voorzichtig de 37 ° C isolatieoplossing met een Pasteur pipet zuigen, voeg 2 ml warm enzymoplossing en incubeer gedurende 35 minutenbij 37 ° C.
  6. Onmiddellijk na de 35 min incubatie in de enzymoplossing Plaats de flacon op ijs te zuigen de enzymoplossing en voeg 2 ml ijskoud Isolation Solution (repeat aspiratie en toevoeging van vers Ijskoude isolatieoplossing 4 keer). Dan, in een volume van 1 ml ijskoude isolatieoplossing voorzichtig vermalen slagadersegmenten met de gepolijste pasteurpipet 10-20 keer individuele mesenterica gladde spiercellen (MASMCs) vrij.
  7. Periodiek verifiëren myocyten uiterlijk door een daling van de celsuspensie op een 35 mm schotel en die onder een microscoop. Gezonde MASMCs moet een gladde langwerpige uiterlijk. Niet alle cellen in de vaatwand worden vrijgegeven. De celsuspensie worden bewaard op ijs.
  8. Een andere nuttige indicator van MASMC gezondheid is hun tolerantie van fysiologische Ca 2 +-concentraties. Vul de opname kamer (bio-Tools, # CSC-25L) met ligbad slutie die 2 mM CaCl2 (pH 7,3 bij kamertemperatuur (RT), voor samenstelling zie tabel 1) en positie agar brug (gebogen glas capillair gevuld met 2% agar in 2 M KCl, ingebracht in de referentie-elektrode (Warner Instrument, REF -3L)) in de kamer. Met de gepolijste Pasteur pipet ongeveer 100-200 pi celsuspensie een opname kamer en laat de cellen hechten gedurende 15 minuten. Onbeschadigd cellen niet significant samentrekken in de 2 mM CaCl2 bevattende oplossing (cellen zouden blijken te zijn of langwerpig staafvormig, niet afgerond bolletjes).
  9. Na toevoegen van de eerste hoeveelheid van de celsuspensie om de opname kamer 0,25 ml badoplossing bevattende 2 mM CaCl2 worden toegevoegd aan het resterende volume van celsuspensie. Deze overblijvende celsuspensie kan worden gehandhaafd in deze oplossing op ijs en voor patch clamp opname tot 6 uur.

4.Gebruik van Whole Cell Patch Clamp om KV7 Kalium stromen of Membrane spanning te meten

  1. Na myocyten vast op het glas basis van de opname kamer (25 mm # 1 rond dekglaasje, Warner Instruments), leiden continue perfusie van de badoplossing (tabel 1). Voor het opnemen van KV7 stromen los van vertraagde gelijkrichter kalium stromen van KV1 en Kv2 families moeten de badoplossing worden aangevuld met 100 uM GdCl 3.
  2. Fabriceren een patch pipet van borosilicaatglas (Kimax-51, Kimble Chase) met een pipet trekker en microforge, de weerstand moet worden MQ 4-5 gevuld met interne oplossing (Tabel 1). Coat het onderste 1/3 van de pipet (~ 1-2 mm boven de bovenkant) met Sylgard 184.
  3. Voor het opnemen van KV7 stromen in MASMCs moet de geperforeerde gehele cel patch voltage clamp techniek worden toegepast. Gebruik van een geperforeerde patch configuratie voorkomt depletion van membraan fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) en vervolgens snel (binnen 5 min) overzicht van de KV7 stromen, die gewoonlijk wordt waargenomen met de conventionele gescheurde patch configuratie. Vul het interne oplossing (Tabel 1) met 120 ug / ml amfotericine B: voeg 3 pl 2 mg / ml voorraad Amfotericine B (bereid in DMSO en bevroren gehouden in kleine porties en beschermd tegen licht) tot 0,5 ml interne oplossing. Vul de punt van de pipet patch met amfotericine B-vrije interne oplossing door dompelen de pipetpunt in de Amfotericine B-vrije interne oplossing en vervolgens te zuigen aan het andere uiteinde met een 10 ml spuit bevestigd via een buisstuk (Tygon R- 3603). Voeg amfotericine B-bevattende pipet oplossing uit de top met behulp van een Eppendorf Microloader pipetpunt totdat de pipet is ongeveer de helft gevuld met de oplossing. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig te tikken op de pipet. Direct gebruik van de pipet.
  4. Plaats de pipet inde elektrodehouder en een micromanipulator de pipet verlagen tot het oppervlak van een langwerpige myocyte (dichtbij, maar niet bovenop de kern, figuur 2) gebruikt. Wanneer de weerstand in de pipet verhoogt van 6-10 MQ afzuigen, op een giga-afdichting (> 10 GΩ) te bereiken.
  5. Houdspanning ingesteld op 0 mV afwachting van membraan perforatie. Breng 100 ms spanning stappen tot +10 mV en daarna tot -10 mV, en gebruik de versterker om snel pipet capaciteit transiënten te compenseren. Tegelijk met het verschijnen van hele cel capaciteit transiënten, kleine aanhoudend positieve stromen (gewoonlijk 2-10 pA) geeft de aanwezigheid van functionele KV7 kanalen.
  6. Succesvolle perforatie met amfotericine B vermindert toegang weerstand 35 MQ of minder. Huidige opname kan vervolgens worden gestart met behulp van een 5 sec spanning stap protocol van -4 mV deelneming spanning. We gebruiken -4 mV houdspanning bereiken bijna maximale inactivering van andere vertraagde rectifier kalium stromen (voornamelijk gemedieerd door KV1 en Kv2 kanalen) die anders zou vervuilen het opnemen van de relatief kleine, niet-inactiverende KV7 stromen. De lange (5 sec) spanning stap protocol is noodzakelijk om steady-state activering van KV7 kanalen, die langzaam spanningsafhankelijke in-en uitschakelen vertonen bereiken. De KV7 stromen niet inactiveren tijdens de aanhoudende spanning stappen.
  7. De KV7 stroom-spanning (IV) relatie opnemen toepassing 5 sec voltage stappen spanningen van -84 mV, waarbij de open waarschijnlijkheid van KV7 kanalen minimaal tot +16 mV waarbij de open waarschijnlijkheid van KV7 kanalen bereikt plateau; na 5 sec bij elke test spanning, een stap terugzetten naar de houdspanning (-4 mV) gedurende 10 sec. Het duurt ongeveer 3,5 min voor de volledige reeks testpulsen (Figuur 3A). Voer 2-3 control IV opnamen dat de opgenomen stromen stabiel zijn in de tijd. Plot gemiddelde eindpolsslag stromen (gemiddeldestromen opgenomen voor het laatst 1 sec) versus spanning een IV curve (figuur 3D) maakt. De controle IV curves moet ongeveer geprojecteerd als de stroming stabiel.
  8. Voor het aanbrengen van enkele farmacologische agenten start een tijdsverloop protocol ontworpen om continu stroom op te nemen bij -20 mV. Een stabiele opnemen van het ten minste 5 minuten voor de drug toepassing. Breng de farmacologische middelen voor 5-15 minuten of totdat een steady-state wordt bereikt (Figuur 3C), dan beëindigt de tijdsverloop protocol en opnemen twee IV weer door middel van de spanning-stap protocol. Washout het geneesmiddel en om de tijd tijdens drug washout, gevolgd door opname van twee extra IV curves.
  9. Aan het einde van het experiment toepassing 10 pM of 10 pM linopirdine XE991, irreversibele remmers van KV7 kanalen; deze geneesmiddelen remmen de stromen volledig opgenomen bij spanningen negatieve tot -20 mV (Figuur 3D).

5. Het gebruik van Intact slagader Segmenten voor Pressure myografie

  1. Een druk myograaf aangeschaft bij Danish Myo Technology (DMT A / S, Denemarken, Model 110P) wordt gebruikt voor de druk myografie experiment. Monteer de slagader segment in de roestvrij stalen kamer door invoeging van de horizontaal bevestigd linker glazen canule aan de ene kant en het beweegbare juiste glas canule in het andere uiteinde. Twee drukopnemers (rechts P1 en P2 aan de linkerkant) worden ingebouwd om de druk in de slagader lumen controleren. Vloeistof uit de rechter glazen canule wordt gebruikt om de druk in de slagader te passen zijn ongeveer fysiologisch niveau. Om te beginnen, vooraf vullen van een open 10 ml spuit (die als zwaartekracht drukkolom) met lumen oplossing (Tabel 1). Breng de spuit om oplossingen te duwentie via polyethyleen buis in de juiste glazen canule, en zorg ervoor dat luchtbellen in de slang of canule te voorkomen. De linker canule moet vooraf worden gevuld met lumen oplossing via een 1 ml spuit. Vul de druk myograaf kamer met 10 ml van het vaartuig badoplossing (tabel 1). Losjes schorten twee vooraf gemaakte fijn nylon hechtingen aan weerszijden grenzend aan het glas canules.
  2. Breng voorzichtig de doorsneden mesenterica segment (meestal een 3e of 4e orde segment, ongeveer 200 tot 350 micrometer in doorsnede; uit stap 2.6) van de snijkamer kamer om de druk myograaf kamer door vast te houden aan een uiteinde van het segment met micro forceps.
  3. Visualiseren door een verlichte dissectiemicroscoop, houdt een uiteinde van de slagader segment en voorzichtig glijden over de linker glazen canule en zet het uiteinde met de nylon hechtingen. Zachtjes spoelen van de vloeistof door de lumen gemonteerd vaartuig bloed en vuil te verwijderen in het vat.De klep naar links injectiespuit moet dan worden gesloten, zodat deze zijde een statische kolom vloeistof waartegen de druk wordt aangepast aan de rechterkant geeft.
  4. Met de micromanipulator, positie de beweegbare juiste glas canule dichter bij de slagader segment en trek het rechter uiteinde van het segment over het tenslotte deze met de nylon hechtingen. Knip de overtollige hechtdraad draden.
  5. Monteer de druk myograaf eenheid op het podium over de druk myograaf microscoop. Plaats het deksel op de druk myograaf kamer. De dekking voor deze kamer bevindt zich de superfusie inlaat en de zuigleiding die eraan verbonden zijn. Sluit de superfusie inlaat naar een verdeelstuk om superfusie van kamertemperatuur bad of 60 mM KCl oplossing in de druk myograaf kamer door de zwaartekracht mogelijk te maken. Teststoffen, zoals geneesmiddelen of hormonen die in de patch clamp metingen KV7 kanaal kunnen aantasten, worden in het algemeen direct op de badoplossing, niet via het bad superfusion of in het lumen oplossing. De superfusie van badoplossing wordt gebruikt om de spoelen KCl oplossing. Bevestig de zuigleiding een vacuümsysteem om de overmaat superfusate verwijderen. Breng de temperatuursensor in de badoplossing door de opening in het deksel myograaf.
  6. Sluit de druk myograaf eenheid de myo-interface systeem de hardware die mededeling van de myograaf apparaat in staat stelt de Myoview software (DMT).
  7. Open de Myoview software in de computer. In de parameter venster, stelt u de gewenste temperatuur tot 35 ° C met een temperatuur tolerantie van 1 ° C, doel instroom druk 80 mm Hg en doel uitstroom druk 80 mm Hg. Laad het kalibratiebestand en kalibreer het vaartuig buitendiameter zodat de wijzigingen in vaatdiameter nauwkeurig zijn geregistreerd in microns. Stel het contrast als nodig is om een ​​goed zicht op de gemonteerde segment tegen de achtergrond in te schakelen. Een gedetailleerde beschrijving van hoe de software te gebruikenwordt in de gebruiksaanwijzing van DMT.
  8. Verhoog de 10 ml spuit (die als zwaartekracht drukkolom) over een periode van 15 min tot P1 drukomvormer leest 80 mmHg. Terwijl het verhogen van de druk kolom, controleer op lekkages in het vat. Als er lekken, gooi het segment en monteer een andere slagader segment (herhaal de stappen van 5,2). De afstand tussen de canules indien nodig. De afstand moet worden aangepast zodanig dat de druk slagader segment is ongeveer recht (niet gestrekt) en vormt een schouder like-patroon waarbij de banden gemaakt (Figuur 4A).
  9. Zet de verwarming van de druk myograaf kamer door de besturingselementen in het myo-interfacesysteem. Laat de badoplossing men geleidelijk opwarmen tot aan 36-37 ° C.
  10. Gebruik de XYZ aanpassingen van de doelstelling in de DMT microscoop wanneer dat nodig is om het schip te houden in focus en accurate tracering van de ch te vergemakkelijkenanges in buitenvat diameter.
  11. Controleer de levensvatbaarheid van de gemonteerde vaartuig door kortstondige superfusie (~ 30 sec) met 60 mM KCl. Een levensvatbare schip vernauwt snel bij toevoeging van KCl en verwijdt direct na uitwas van de 60 mM KCl (superfuse ongeveer 60 ml bad-oplossing te spoelen de KCl). Na deze test desgewenst het volume van de badoplossing precies 10 ml. De temperatuur van het bad wordt verminderd tijdens het KCl washout test en omdat deze oplossingen bij kamertemperatuur, maar de kamer kachel de temperatuur weer op 36-37 ° C binnen enkele minuten.
  12. Laat de slagader equilibreren ten minste 30 min (de diameter moet stabiel zijn gedurende tenminste de laatste 10 minuten van deze periode). Voeg de geconcentreerde teststof aan de badoplossing rechtstreeks en voorzichtig pipetteren heen en weer langs de randen van de kamer naar de teststof mengen in de badoplossing, waardoor de juiste uiteindelijke concentratie in de kamer 10 ml volume. Changes in de vaatdiameter volgende toevoeging van de teststof (s) worden gevolgd in het videobeeld en gebracht in de beeldanalyse venster terwijl het experiment wordt uitgevoerd.
  13. Na voltooiing van het experiment, kunnen de opgeslagen gegevens (*. Myo) bestand geopend als een spreadsheet voor verdere analyse.

6. Representatieve resultaten

De resultaten in figuur 3 illustreren typische opnames van KV7 stromen van mesenterica myocyten met een spanningssprong protocol voor (Figuur 3A, B zwart sporen) en tijdens de behandeling met een KV7 kanaal activator Zn pyrithione (ZnPyr, 100 nM, fig. 3A, B rode sporen). Soortgelijke spanningssprong gegevens van 3 cellen werden gemiddeld om de stroom-spannings (IV) plots figuur 3D bereiden. Een vertegenwoordiger tijdsverloop van de versterking van de huidige amplitude (gemeten door continue spanning klem bij -20 mV) During behandeling met 100 nM Zn pyrithione wordt getoond in figuur 3C Figuur 4B illustreert het tijdsverloop van de effecten van ZnPyr op mesenterica buitendiameter gemeten met druk myografie;. het vaartuig pre-ingesnoerd met 100 pM argininevasopressine (AVP) vóór toevoeging van 100 nM ZnPyr. Gemiddelde dosis-respons gegevens voor ZnPyr geïnduceerde mesenterica dilatatie worden getoond in Figuur 4C.

Figuur 1
Figuur 1. Afbeelding van een mesenteriale arcade in de ontleden kamer.

Figuur 2
Figuur 2. Foto van een myocyte met een patch pipet op het oppervlak.

Figuur 3
Figuur 3. Originele sporen van KV7 stromingen, tijdsverloop van drugs toepassing IV curves. A. Family opeenvolgende huidige sporen (onderste paneel) geregistreerd in reactie op spanningsverschillen (bovenste paneel) vóór behandeling (controle, zwart) en na stabilisatie in de aanwezigheid van 100 nM ZnPyr (rood) in een MASMC. B. Representatieve stroom sporen van A (zoals aangegeven door pijlpunten) voor controle (zwart) en 100 nM ZnPyr (rood). Grijze balken geven tijdsinterval waar gemiddelde huidige amplitudes werden gemeten voor stroom-spanning (IV) percelen. Stap spanningen worden aangegeven aan de rechterzijde van pijlpunten. C. Tijd loop van KV7 huidige verbetering met 100 nM ZnPyr gemeten met continue spanning klem bij -20 mV (bar). D. gemiddelde curves IV (n = 3) uit KV7 stroomdichtheden gemeten vóór (controle, gevulde cirkels), tijdens de behandeling met 100 nM ZnPyr (open cirkels) en tijdens de behandeling met 10 uM XE991 (opgevulde driehoekjes). Niet-specifieke lekstromen werden afgetrokken zoals beschreven door Passmore et al.. 1.

ENT "> Figuur 4
Figuur 4. ZnPyr geïnduceerde relaxatie van een a. mesenterica pre-vernauwd met 100 pM AVP. A. Foto van een a. mesenterica gemonteerd in de druk myograaf set-up. B. Tijdsverloop van veranderingen in buitendiameter van het vaartuig in reactie op toepassing van 100 pM AVP (open bar) gevolgd door het aanbrengen van 100 nM ZnPyr (gevulde bar). C. Staafdiagram samenvatting resultaten van 100 nM ZnPyr-geïnduceerde vasodilaion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methoden en experimentele benaderingen hier beschreven zijn zeer robuust en kan produceren duidelijke en reproduceerbare resultaten bij toepassing met nauwgezette aandacht voor detail. Goede elektrofysiologische opnames en vernauwing / verwijding van slagadersegmenten zijn afhankelijk van de gezondheid van de cellen en slagader segmenten respectievelijk. Celpreparaten kan van dag tot dag, zelfs met hetzelfde protocol. Isolatie oplossingen worden toegepast tot 2 weken, maar indien de kwaliteit van het celpreparaat laag op twee daaropvolgende dagen Isolation nieuwe oplossingen moeten worden bereid. We hebben gevonden dat enzym activiteiten variëren van partij tot partij en derhalve isolatie voorwaarden (de tijden van incubatie en concentraties van enzymen) vereisen optimalisatie elke nieuwe partij enzymen. We hebben ook gevonden dat de celisolatie protocol hier beschreven rat mesenterica niet optimaal is voor andere vasculaire bedden of andere soorten die een andere samenstelling of holen kunnenheid van extracellulaire matrixcomponenten. Elke vasculaire voorbereiding vereist zijn eigen optimalisatie om voorwaarden die de gezondste cellen produceren te identificeren. De criteria die we zeer nuttig bij het ​​identificeren van gezonde cellen: 1) celmorfologie: glad, langwerpig, maar iets ingesnoerd verschijning na tritureren MA segmenten in de isolatie oplossing die 50 uM Ca2 + en behoud van dezelfde verschijning wanneer overgebracht naar 2 mM Ca 2 +-bevattend externe oplossing. Niet alle cellen behouden hun bijna volledig ontspannen langwerpige vorm, maar bijna volledig ontspannen myocyten worden gebruikt voor elektrofysiologische opname; 2) worden de cellen optisch dichte, wat duidt op een intact onbeschadigd membraan; 3) rust membraanpotentiaal spanningen van gezonde myocyten gebruikt stemming kalium stromen of current-clamp opnames membraan spanning moet negatiever dan -40 mV (gewoonlijk in het traject van -45 mV tot -56 mV onder de ionische omstandigheden described in ons protocol hier).

Om succesvol elektrofysiologische opnames de badoplossing en de pipetoplossing (samenstelling zie tabel 1) worden bereid op de dag van het experiment te verzekeren. Het is cruciaal om de osmolaliteit van het interne en bad oplossingen identiek (298-299 mOsm) passen.

Isobare arteriële functie metingen in kleine slagaders (<500 micrometer) met behulp van druk myografie dichter benaderen fysiologische omstandigheden dan doen isometrische krachtmetingen gemaakt met behulp van een draad myograaf. De vaten in een druk myograaf zijn meestal gevoeliger voor vasoconstrictor agonisten 2-4, beter benadert de gevoeligheden gemeten in vivo 5, 6. De verhoogde gevoeligheid voor lage concentraties van agonisten heeft de identificatie van signaaltransductie mechanismen geïnduceerd door fysiologisch relevante picomolaire concentraties van AVP7, 8.

Myografie druk behoudt de geometrie van het vat en onderhoudt de integriteit van het endotheel. Endotheel gemedieerde effecten van geneesmiddelen kan worden onderscheiden van gladde spier-gemedieerde effecten door het uitvoeren van metingen in parallel intact endotheel en ontdaan vaten 9. De opzettelijke verstoring van het endotheel kan worden bereikt door fysiek te beschadigen het endotheel (bijvoorbeeld door het passeren van een menselijk haar heen en weer door de lumen) of te doorstromen lucht door het lumen van de slagader. Het verlies van endotheliale functie (maar niet vasculaire gladde spier functie) worden bevestigd door het meten van een verminderde endotheel-gemedieerde vasodilatoire respons op acetylcholine in vaten pre-vernauwd met een agonist 9.

Parallelle metingen van ionenstromen / membraan spanning in mesenterica myocyten met patch clamp technieken en arteriële vernauwing / verwijding van mesenterische arteries met behulp van druk myografie kunt inschakelen opheldering van de rol van specifieke ionenkanalen in zowel fysiologische signaaltransductie cascades en in de acties van therapeutische middelen. Behandelingen voor specifieke klassen van ionkanalen of specifieke signaaltransductie tussenproducten kunnen additief of achtereenvolgens worden toegepast mechanistische informatie over de rol van deze kanalen in de regulatie van myocyte functie op cellulair niveau en vernauwing / verwijding van bloedvaten intact verschaffen. Convergente resultaten van behandelingen die verbeteren of bepaalde soorten ionenstromen remmen met overeenkomstige effecten op de vaatdiameter meer betrouwbare interpretaties dan kan worden verkregen met behulp van methode zelf. Idealiter zou de concentratie-afhankelijkheid van de onderzochte middelen worden bepaald in beide systemen. Naar fysiologische of therapeutische relevantie, moet de geteste concentraties worden gerelateerd aan de concentraties gemeten in de fysiologische omgeving or bij klinische therapieën. Voorbeelden van deze typen experimentele benaderingen kunnen worden gevonden in onze eerdere publicaties 8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) naar KLB en pre-doctorale beurzen van de American Heart Association (09PRE2260209) en Arthur J. Schmitt Stichting BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. Intech. (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats