इंजीनियरिंग murine Myoblast पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और बिजली की उत्तेजना के अनुप्रयोग से कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों

Published 3/19/2013
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Bioengineering

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Summary

इंजीनियर मांसपेशियों के ऊतकों रोग मॉडल के रूप में भी है और मांस के लिए एक वैकल्पिक स्रोत के रूप में पुनर्योजी चिकित्सा में काफी क्षमता है. यहाँ हम माउस myoblast पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, और बिजली दालों द्वारा उत्तेजना से इस मामले में एक मांसपेशी निर्माण के इंजीनियरिंग, वर्णन.

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van der Schaft, D. W., van Spreeuwel, A. C., Boonen, K. J., Langelaan, M. L., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267, doi:10.3791/4267 (2013).

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Abstract

Protocol

1. Murine Myoblast पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं या C2C12 कोशिकाओं की संस्कृति

  1. प्रोटोकॉल के अनुसार शुरू में Shefer और उनके सहयोगियों ने 10 के द्वारा प्रकाशित और बाद में कोलिन्स एट अल. 11 और Boonen एट अल. 12 के द्वारा रूपांतरित कोशिकाओं को अलग और तरल नाइट्रोजन में इन स्टोर. यह चूहों, जैसे C57BL / 6 की आवश्यकता है. अन्य प्रयोगशालाओं में वैकल्पिक तरीकों का उपयोग किया जाता है, जैसे एक विधि ली वाई एट अल द्वारा visualized प्रयोगों के जर्नल में प्रकाशित 13. अभिकर्मकों और उपकरणों के लिए आप पृष्ठ 7 और 8 पर तालिका के लिए भेजा जाता है. एक माउस से पेशी से आप आम तौर पर पर्याप्त कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में के बारे में 20 शीशियों cryopreserve प्राप्त करेंगे. अगला, हम प्रोटोकॉल पिघलना के तरल नाइट्रोजन भंडारण से कोशिकाओं शुरू करते हैं.
  2. एक 25 सेमी 2 (1 मिलीग्राम / एमएल) Matrigel लेपित ऊतक संस्कृति फ्लास्क में 1 शीशी से कोशिकाओं प्लेस और विकास (जीएम) के माध्यम के निर्वाचकगण (335 मिलीलीटर DMEM उन्नत, 100 मिलीलीटर भ्रूण bovin जोड़नेई सीरम (FBS), 50 मिलीलीटर एच एस, 5 मिलीग्राम पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 मिलीग्राम एल glutamin, 5 मिलीलीटर चिकन भ्रूण (CEE) निकालने).

नोट: कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए कोट और आकांक्षा द्वारा Matrigel हटाने.

  1. Subculture कोशिकाओं लगभग 3 दिनों हर 01:03.
    इसका मतलब यह है: 3 दिन बीतने के कोशिकाओं को एक 75 सेमी 2 फ्लास्क से दो 150 सेमी 2 बोतल (30 uncoated बोतल में preplating मिनट के साथ): एक एक 75 सेमी 2 फ्लास्क 25 2 सेमी, 6 दिन से पारित होने की कोशिकाओं. दिन हस्तांतरण 9 एक 150 सेमी 2 फ्लास्क 1 ट्रिपल 150 सेमी 2 फ्लास्क, या यदि तीन 150 सेमी 2 बोतल (यदि आवश्यक preplate फिर कोशिकाओं के phenotype पर निर्भर करता है) के लिए उपलब्ध नहीं है. 12 दिन की कोशिकाओं को एक मांसपेशी का निर्माण में बोने के लिए तैयार हैं.

नोट: - ट्रिपल 150 2 सेमी प्रति कोशिकाओं की संख्या लगभग 4.5 x 10 6 कोशिकाओं हो जाएगा.
- के माध्यम का उपयोग करेंअलग isolations से रास उन्हें मिश्रण करने के बोने के समय में कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी प्राप्त.

नोट: यदि आप प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम नहीं करने के लिए चुनते हैं, C2C12 myoblasts एक अच्छा विकल्प है.

2. कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों इंजीनियरिंग

  1. "इलाज के एजेंट" (10:01) के साथ "elastomer" मिश्रण से सिलिकॉन गोंद तैयार. वेल्क्रो की एक त्रिकोणीय पक्ष (1 चित्रा आकार घर की तरह) के साथ 5 मिमी वर्ग खंडों - + / कट. एक 6 वर्गों के बीच लगभग 12 मिमी के एक स्थान पर अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के कुओं में गोंद वेल्क्रो.

नोट: - केवल वेल्क्रो के नरम पक्ष का उपयोग करें और इस तरफ ऊपर की ओर का सामना.
- यह सुनिश्चित करें कि छतों को एक दूसरे का सामना है.
सिलिकॉन गोंद के साथ केवल वेल्क्रो कवर, गोंद अच्छी तरह से भर में फैल नहीं है.
- बाद में बिजली की उत्तेजना के लिए यह प्रासंगिक है अच्छी तरह pl की ऊर्ध्वाधर दिशा में constructs संरेखित करेंखाया (लंबे धुरी के साथ).

  1. वैक्यूम ओवन में रात भर छोड़ सूखी गर्म नहीं है, मुख्य रूप से हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए. कुओं और सेते तक 15 मिनट के लिए 70% EtOH जोड़कर जीवाणुरहित. पीबीएस के साथ 3x कुल्ला और 15 मिनट के लिए यूवी के तहत डाल दिया. कुओं से सभी PBS और वेल्क्रो और उपयोग जब तक मशीन में जगह निकालें.
  2. फ्रिज में Matrigel समाधान पिघलना और वांछित एकाग्रता के लिए 3 डी constructs करने से पहले शीघ्र ही कोलेजन समाधान तैयार. बाँझ 0.02% एसिटिक एसिड (अंतिम एकाग्रता 3.2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ शेयर कोलेजन पतला.

नोट: बर्फ पर सब कुछ छोड़.

  1. कोशिकाओं, जीएम और गिनती में resuspend Trypsinize. अपकेंद्रित्र ट्यूब में इनक्यूबेटर में कोशिकाओं छोड़ें.
  2. Constructs की संख्या के लिए कोलेजन स्टॉक समाधान के वांछित राशि जोड़ें कि आप एक ट्यूब (तालिका 1) के अनुसार करने के लिए बनाना चाहते हैं, 0.5M NaOH इस कोलेजन समाधान के लिए जोड़ने के एक हल्के गुलाबी colo तकr 7.5 का एक pH संकेत है. Pipetting और नीचे धीरे मिक्स और बुलबुला गठन से बचने के. फिर Matrigel जोड़ने और बहुत धीरे लेकिन अच्छी तरह से मिश्रण. अंत में, मिश्रण / कोलेजन Matrigel (उचित मात्रा के लिए देखें तालिका 1) जीएम जोड़ने.

नोट: - बर्फ पर प्रत्येक कदम प्रदर्शन! Matrigel और कोलेजन आसानी से तापमान में वृद्धि पर जेल होगा.
- ध्यान रहे कि वास्तव में रंग गुलाबी है! पीएच में वृद्धि भी तेजी से जमाना प्रेरित करेगा.
कोलेजन के अंतिम एकाग्रता: 1.6 मिग्रा / मिली.

  1. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर कोशिकाओं के वांछित राशि अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने.

नोट: - कक्षों का निर्माण प्रति कोशिकाओं की संख्या में समायोजित करने की आवश्यकता की गतिविधि पर निर्भर करता है. आमतौर पर, कोशिकाओं की संख्या के बीच 750.000 और 1,250,000 कोशिकाओं का निर्माण प्रति निहित है.

  1. जेल के मिश्रण के कुछ का उपयोग सेल गोली resuspendऔर शेष मिश्रण में कोशिकाओं हस्तांतरण और मिश्रण अच्छी तरह से है, लेकिन हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना.
  2. Preheated अच्छी तरह प्लेटें इनक्यूबेटर और 0.35 वेल्क्रो 1 में मिश्रण जेल सेल -0.4 मिलीलीटर विंदुक के बाहर ले जाओ. फिर, लगाव साइटों के बीच केंद्र से मिश्रण विंदुक और वेल्क्रो का विस्तार करने के लिए शुरू करते हैं. अंत में, दो वेल्क्रो वेल्क्रो टुकड़े के आसपास और एंकर विंदुक के बीच की खाई को भरने के लिए जेल के शेष का उपयोग करें.
  3. ध्यान से 5-10 मिनट के बाद जांच अगर जैल काफी ठोस को हस्तांतरित किया जा रहे हैं, यानी धीरे बर्तन नल और नेत्रहीन का निरीक्षण अगर जेल कठोर है. यदि हां, तो एक मशीन में ध्यान व्यंजन जगह है. आमतौर पर, वे दस मिनट के बाद ऊपर उठाया जा सकता है. फिर, 1-2 घंटे के बाद, धीरे गर्म जीएम के 4 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक जेल उपरिशायी.

नोट: किसी भी जोरदार आंदोलनों नहीं है जब प्लेटों से निपटने.

  1. भेदभाव माध्यम से जीएम बदलें (मध्यम विकासचूजे के भ्रूण निकालने के बिना) के 24 घंटे के बाद, और ताजा मध्यम हर 2-3 दिन के साथ की जगह. 7 दिन परिपक्व उन्मुख मांसपेशी फाइबर प्राप्त किया है चाहिए, के रूप में जुड़े मांसपेशी फाइबर में पार striation विकास के लिए धुंधला के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है. "

3. बिजली की उत्तेजना

  1. 70% इथेनॉल और बाद में एक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी के तहत सूखा के साथ उपयोग पहले ionoptix थाली से इलेक्ट्रोड (अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें) जीवाणुरहित. Constructs के साथ संस्कृति की थाली पर इलेक्ट्रोड के साथ प्लेट रखें और संस्कृति की थाली और एक मशीन के हस्तांतरण से ढक्कन के साथ कवर. उपयुक्त केबल के साथ कनेक्ट Ionoptix सी तेज गेंदबाज.

नोट: इलेक्ट्रोड समानांतर मांसपेशी का निर्माण (2 चित्रा) के बगल में रखा जाता है.

  1. उत्तेजना प्रोटोकॉल लागू के रूप में प्रत्याशित.

नोट: हम आम तौर पर 4 वी / मुख्यमंत्री का उपयोग करने के लिए,2Hz के एक आवृत्ति पर 6ms दालों. संस्कृति के माध्यम उत्तेजना के दौरान हर 24 घंटे बदलें.

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Representative Results

अंत उत्पाद के रूप में 3 चित्र में संकेत मांसपेशी constructs होगा. ऊतक के आकार लगभग 8 मिमी लंबे, 2 मिमी चौड़े और 0.5 मिमी मोटी हो जाएगा. भेदभाव के दौरान विद्युत उत्तेजना मायोसिन भारी चेन isoforms की अभिव्यक्ति बदल जाएगा, लेकिन भेदभाव प्रक्रिया बहुत नहीं बढ़ाने के रूप में भेदभाव 8 माध्यम से प्रेरित है, लेकिन बिजली की उत्तेजना भी प्रक्रिया के अंत में मांसपेशियों की कार्यक्षमता की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है , क्योंकि sarcomeres साथ एक मांसपेशी पूरी तरह से विकसित करने के लिए एक विद्युत स्पंद पर अनुबंध करने में सक्षम हो जाएगा.

भेदभाव और परिपक्वता भी जीन अभिव्यक्ति और मांसपेशी परिपक्वता या तो ऊतकों या पूरे माउंट दाग ऊतकों के नमूनों से बनाया वर्गों पर या पार striation विकास मार्कर (अल्फा actinin के लिए जैसे धुंधला हो जाना) के लिए मूल्यांकन धुंधला के लिए मात्रात्मक पीसीआर का विश्लेषण का उपयोग किया जा सकता है. मांसपेशियों की परिपक्वता और भेदभाव असलीटेड जीन और मायोसिन भारी श्रृंखला अभिव्यक्ति जैसे MyoD, myogenin, MFR4 और MLP, और MYH 1, 2, 4 और 8 8 शामिल हैं. सबूत है कि मांसपेशियों के ऊतकों है कि वास्तव में गठन किया है मांसपेशियों के ऊतकों, जीन की अभिव्यक्ति, immunohistochemical stainings और बिजली की उत्तेजना से संकुचन प्रेरण पर आधारित है, 8 पहले प्रकाशित किया गया है और मांसपेशी myoblast पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और C2C12 कोशिकाओं से बना ऊतकों के दाग पार वर्गों के साथ एक आंकड़ा से इस कागज चित्रा 4 में प्रदर्शित होता है.

समाधान Μl में वॉल्यूम (10 मांसपेशियों अगर)
कोलेजन (3.2 मिलीग्राम / एमएल, 0.02% एसिटिक एसिड के साथ पतला) 2570 (51.3%)
NaOH (0.5M) 10 (0.2%)
Matrigel 430 (8.6%)
विकास का माध्यम +२,००० (39.9%)
संपूर्ण 5010 (spilling और pipetting हानि के लिए पर्याप्त के साथ पर्याप्त होना चाहिए)

तालिका 1 कोशिकाओं और एक ऊतक इंजीनियर मांसपेशी की पीढ़ी के लिए जेल के मिश्रण का निर्माण.

चित्रा 1
चित्रा 1. वेल्क्रो के टुकड़े काटना.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक मांसपेशी के नीचे से एक तस्वीर ली गई एक छह अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड के स्थान दिखा प्लेट की एक अच्छी तरह से निर्माण इलेक्ट्रोड (सफेद तीर के साथ संकेत) समानांतर मांसपेशी constructs के लिए रखा जाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक ऊतकवेल्क्रो के टुकड़ों के बीच एक संस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली में दो मांसपेशी इंजीनियर.

चित्रा 4
चित्रा 4. (A) C2C12 और MPC में पार striations की विशिष्ट उदाहरण इंजीनियर कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों में (बी). गैर उत्तेजित mBAMs (भेदभाव के 8 दिन) जमे हुए वर्गों (लाल) sarcomeric α-actinin, sarcomeric मायोसिन (हरा दाग थे ) और नाभिक (नीला). (एए अब और बीए Bb) में बॉक्सिंग क्षेत्रों के Magnifications (ए, बी) α Actinin (लाल) और sarcomeric मायोसिन (हरा). 8 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

मांसपेशियों के ऊतकों के इंजीनियरिंग दवा स्क्रीनिंग के लिए एक रोग मॉडल, पुनर्योजी चिकित्सा में, के रूप में और मांस उत्पादन के लिए उपयोग करने के लिए महान क्षमता है. हालांकि, इन अनुप्रयोगों के लिए आवश्यकताओं में भिन्नता है. हम कोलेजन और Matrigel एक संयोजन के साथ काम करने के लिए चुना है, क्योंकि कोलेजन सेल संरेखण के लिए अनुमति देता है और क्योंकि myoblast पूर्वज कोशिकाओं तहखाने झिल्ली प्राप्त प्रोटीन की उपस्थिति की आवश्यकता के रूप में पिछले 2 डी 12 अध्ययनों में निर्धारित है. इसके अलावा, आतंच जैल हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण किया गया है और के लिए C2C12 और myoblast पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का समर्थन नहीं के रूप में कोलेजन और Matrigel ™ का मिश्रण होता है, और विशेष रूप से ऊतक 14 संघनन के लिए नेतृत्व नहीं लगता. मॉडल के रूप में यहाँ वर्णित दबाव अल्सर नुकसान पर अध्ययन में किया गया है पहले से ही प्रयोग किया जाता है, जबकि एक सेल 15 लाइन का उपयोग कर. पुनर्योजी दवा अनुप्रयोगों के लिए, मानव उपग्रह कोशिकाओं के लिए अनुवाद हाल ही में 6,16 बना दिया गया है. इसके अलावा,मांस की खपत के लिए एक वैकल्पिक स्रोत के रूप में तकनीक महान क्षमता 1 है. हमारी राय में हालांकि, मौजूदा प्रौद्योगिकी के अगले चरण के लिए अग्रिम की खपत के लिए क्लिनिक में अपने उपयोग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आगे की जरूरत है. उदाहरण के लिए, भेदभाव नवजात मंच के आसपास में बंद हो जाता है और भी बल उत्पादन एक मांसपेशी vivo में उत्पादन की तुलना में बहुत कम है. इसके अलावा, हालांकि माउस, चूहा, और मानव स्टेम सेल 3D constructs, अलगाव में लागू किया जा सकता है और विशेष रूप से भेदभाव और खेत मांसपेशी स्टेम सेल व्युत्पन्न जानवर की परिपक्वता है कि अभी तक 1 अभी तक विकसित नहीं है. इसके अलावा, की जरूरत है Matrigel और पशु व्युत्पन्न सीरम के उपयोग 1 छोड़े गए. पुनर्योजी चिकित्सा में आवेदन को आगे बढ़ाने के लिए, ऊतक आकार को बढ़ाना होगा, और vascularization (नव) और छिड़काव bioreactor सिस्टम का उपयोग करने के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों प्रसार सीमाओं पर काबू पाने की आवश्यकता है. छोटे constructs घंटे पर कुछ प्रारंभिक vascularization अध्ययनएवेन्यू पिछले 9,17,18 वर्षों में किया गया है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

लेखकों के लिए चित्रा 2 में प्रस्तुत ऊतकों के संवर्धन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ Yabin वू, चित्र Bart वैन Overbeeke द्वारा लिया गया था. काम आर्थिक SenterNovem, अनुदान आईएसओ 42022 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel-growth factor reduced Beckton and Dickinson
DMEM (high glucose)* Gibco 42430
Advanced DMEM Gibco 12491
Horse serum Gibco 65050-122
Fetal bovine serum Greiner 758075
0.45 and 0.22 μm syringe filter* Whatmann (Schleicher and Scheull) 10462100
L-glutamine Gibco 25030024
Penicillin/streptomycin Gibco 10378016
Amphotericin Gibco 15290-018
Culture plastic Greiner Includes culture flasks and pipets
Chick embryo extract United States Biological C3999
Pasteur pipet* Hilgenberg Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm
Pasteur pipet* Hilgenberg Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm
Pasteur pipet VWR 612-1702
Collagenase type I* Sigma C0130-16
40 μm cell strainer* BD Falcon 352340
19G needle
Elastomer Dow Corning corporation 3097358-1004 Silastic MDX 4-4210#
Curing agent Dow Corning corporation Silastic MDX 4-4210#
Velcro Regular store You can buy this at a regular store, only use the soft side
Collagen type I, rat tail BD Biosciences 3544236
C-Pace EP Culture Pacer Ionoptix
6-well culture dishes for electrical stimulation Beckton Dickinson-Falcon BD Falcon #353846
C-Dish culture dish electrodes Ionoptix
* Needed for the isolation of cells (point 1.1)
# Together in one kit

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References

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