Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Neuroscience

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Summary

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente Vorläuferzellen

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Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).

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Abstract

Differenzierung von humanen neuronalen Vorläuferzellen in neuronale und gliale Zelltypen ein Modell zu studieren und Vergleichen molekulare Regulation von neuronalen Zellstammbaums Entwicklung. In vitro Expansion von neuralen Vorläuferzellen aus fötalem ZNS-Gewebe ist gut charakterisiert worden. Trotz der Identifizierung und Isolierung von glialen Vorläuferzellen aus adulten menschlichen subkortikalen weißen Substanz und Entwicklung verschiedener Kulturbedingungen direktem Differenzierung von fötalen neuralen Vorläuferzellen in Myelin Herstellung Oligodendrozyten, Erhaltens ausreichender menschlichen Oligodendrocyten für in vitro Experimente ist weiterhin schwierig. Differenzierung Galactocerebrosid + (GalC) und O4 + Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder Vorläuferzellen (OPC) aus neuralen Vorläuferzellen wurde berichtet, mit zweiten Trimester fetalen Gehirns. Allerdings sind diese Zellen nicht proliferieren in Abwesenheit von Stützzellen einschließlich Astrozyten und Neuronen und schnell über die Zeit in Kultur verloren. Der Bedarf bleibt für eine Kultur-System an Zellen des Oligodendrozyten Linie geeignet für in vitro Experimente erzeugen.

Kultur von primären humanen Oligodendrozyten könnte beispielsweise ein nützliches Modell für die Pathogenese von neurotropen Infektionserreger wie das menschliche Polyomavirus, JCV, die in vivo infiziert jene Zellen zu studieren. Diese kultivierten Zellen konnten auch Modelle von anderen demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Primary, humanen fötalen brain-derived vermehren multipotente neurale Vorläuferzellen in vitro unter Beibehaltung der Fähigkeit, sich in Neuronen (Vorläuferzellen abgeleiteten Neuronen, PDN) und Astrozyten (Vorläuferzellen abgeleitete Astrozyten, PDA) Diese Studie zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden kann differenzieren durch viele der Stufen oligodendrocytic Linie Entwicklung (Vorläuferzellen abgeleitete Oligodendrozyten, PDO) zu unterscheiden. Wir Kultur neuralen Vorläuferzellen in DMEM-F12 serum-freien Medien unterstütztumgesetzt mit basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), neurotrophen Faktor 3 (NT-3), N-2 und Trijodthyronin (T3). Die kultivierten Zellen werden bei 2.5e6 Zellen pro 75cm Flaschen etwa alle 7 Tage passagiert. Mit diesen Bedingungen behält die Mehrzahl der Zellen in Kultur eine Morphologie von wenigen Prozessen und Express Marker des Pre-Oligodendrozyten-Zellen, wie A2B5 und O-4 ist. Wenn wir die vier Wachstumsfaktoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) entfernen und konditionierten Medien von PDN, beginnen die Zellen zu mehreren Prozesse und Express Marker spezifische Differenzierung der Oligodendrozyten, wie GalC und Myelin erwerben basisches Protein (MBP). Wir führten phänotypischen Charakterisierung mit multicolor Durchflusszytometrie einzigartige Marker der Oligodendrozyten zu identifizieren.

Protocol

Anmerkung: Für routinemäßige Kultivieren der neuralen Vorläuferzellen und oligodendrocytic Abstammungslinie Zellen, Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre durchgeführt. Alle 2 Tage, wird das Medium ausgetauscht Verwendung von 50 bis 100% des frischen Mediums ist, wenn die Kultur 40 bis 70% konfluent. Zum Zeitpunkt der Nähe der Konfluenz werden die Kulturen bei 2-2.5e6/T75 Kolben normalerweise auf einem Wochenprogramm passagiert.

Ein. Herstellung des beschichteten Flask

  1. Zur Vorbereitung beschichteten Kolben zu verdünnen 5 mg Poly-D-Lysin (PDL) in 100 ml deionisiertem Wasser (DI-Wasser), dann Mantel T75-Flaschen mit 50 ug / ml PDL bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln. Nach 1 ½ Std. absaugen PDL und spülen Sie die Flaschen einmal mit DI-Wasser. Lassen Sie die Flaschen trocken vor der Aussaat der Zellen (Tabelle 1).

2. Ab Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Progenitor-derived Oligodendrozyten (PDO)

Das Protokoll istOlate menschlichen ZNS Vorläuferzellen in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Menschlichen ZNS Vorläuferzellen wurden aus dem Telencephalon eines 8-Schwangerschaftswoche fötalem Gehirn, in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien erhalten wurde, isoliert.

  1. Wachsen multipotenten Population von neuralen Vorläuferzellen auf PDL beschichteten Flaschen in Neurobasalmedium mit 25 ng / ml bFGF und 20 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) (Abbildung 1A) ergänzt. Verwenden Sie sie nicht, wenn höher als Durchgang 11 (p11).
  2. Start, um die neuronalen Vorläuferzellen zu unterscheiden, wenn die Kultur von etwa 70% konfluent.
  3. Make vollständige Differenzierung Oligodendrozyten Medium mit serumfreien DMEM / Hams F12-Medium mit 1.01 Rinderserumalbumin, L-Glutamin, Gentamicin, N2 Komponenten, T3, Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA (Tabelle 1) ergänzt . Dieses Medium wird als Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren (Oligo mittel + GF) definiert werden.
  4. Entfernen progenitor Medien aus den Flaschen spülen Zellen einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), dann fügen Oligo mittel + GF (Details unter 2.3 beschrieben) zu Oligodendrozyten Differenzierung beginnen. Nur Zellen, die sich für die oligodendrocytic Linie wachsen wird (Abbildung 1B). Kultur der Zellen in diesem Medium für 3 Wochen.
  5. Jede Woche, wenn die Zellen bei 90-95% Konfluenz mit Trypsin ihnen Durchgang (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml für eine T75-Flasche). Übertragen das Medium von den Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen passagiert werden, dies konditionierte Medium wird verwendet, um das Trypsin zu quenchen werden. Achten Sie darauf, nicht zu trocknen die Zellen. Dann fügen Trypsin.
  6. Inkubieren Zellen in Trypsin für 5 min bei RT, leichtes Antippen der Kolben mehrmals Zellablösung helfen.
  7. Quench das Trypsin durch Zugabe von 4-5 ml des konditionierten Mediums in den Kolben mit den abgelösten Zellen.
  8. Übertragen des Mediums und die Zellen auf den gleichen 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge das Medium und die Zellen bei 1.200 rpm (~300 xg) für 5 min bei RT.
  9. Überstand, Zellpellet vorsichtig Kippen der Röhre, und fügen Sie dann frische Oligo mittel + GF. Gently Pipette und Zellen nach oben und unten, um eine einheitliche Zellsuspension.
  10. Zählen Sie die Zellen, und die Übertragung 2.5e6 in jede neue PDL-beschichteten T75-Flasche.

3. Letzter Schritt in der Differenzierung von Oligodendrozyten

  1. Nach 3 Wochen der Kultur in Oligo-Medium + GF, wenn die Zellen bei 70-80% Konfluenz sind, starten Sie den abschließenden Prozess der Differenzierung (Abbildung 1C).
  2. Planen Medium in der gleichen Weise wie die Oligo-Medium + GF, aber ohne Zugabe der vier GF: Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA. GF - Dieses Medium ohne die vier GF wird als Oligo Medium definiert werden.
  3. Saugen Sie die Oligo-Medium + GF aus der Flasche, einmal mit PBS spülen und fügen Sie dann ein Gesamtvolumen von 16 ml des Mediums, von denen ¾ (12 ml) Oligo Medium - GF und ¼ (4 ml) ist PDN konditioniertes Medium für 6-10 Tage). Die Verwendung von konditioniertem Medium aus PDN ist nicht kritisch für die Differenzierung oder das Überleben der Zellen. Wir tatsächlich beobachtet, dass nur direkten Kontakt mit PDO PDN Zellen in Co-Kultur-Experimente eine Wirkung auf die Länge der PDO Überleben hatte. Die Überlebenszeit in Oligo Medium - GF könnten auf zwei oder drei Wochen verlängert werden, wenn die Zellen mit PDO PDN Zellen co-kultiviert. Das Protokoll für die menschliche neurale Vorläuferzellen in PDN zu differenzieren ist in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Wachstumsfaktorentzug aus dem Kulturmedium führt fortschreitend differenziert Kultur von Zellen mit mehreren Prozessen (1D).

4. Durchflusszytometrie Assay

Die Durchflusszytometrie-Assay vergleicht den Erwerb von Oligodendrozyten Marker während der Differenzierung in der Beziehung mit denen ihrer Eltern Bevölkerung.

  1. Verwenden neuronalen progenitors als Kontrolle. Saatgut PDO Zellen bei 2.5x10 6 Zellen in zwei T75-Flaschen, beschichtet mit Poly-D-Lysin in Oligo-Medium + GF.
  2. Eine Woche später, ersetzen Medium mit frischem Oligo mittel + GF in Flaschen als Kontrolle Kultur für die Lebensfähigkeit der Zellen, während andere Flaschen hatten Oligo mittel - GF.
  3. Um PDO-Zellen in beiden Medien distanzieren verwenden 20 U / ml Papain und nicht Trypsin. Dies liegt daran, Papain eine sanftere Wirkung auf die Zellen während der Dissoziation die Erhaltung der zellulären Morphologie.
  4. 5 ml Balanced Salt Earle-Lösung (EBSS) zu einem Papain Fläschchen. Die Küvette bei 37 ° C für 10 min oder bis das Papain vollständig gelöst und die Lösung klar erscheint. Dies ist der Papain-Lösung verwendet, um die Zellen zu dissoziieren.
  5. 0,5 ml EBSS einem Deoxyribonuclease I (DNase) Fläschchen (Tabelle 1). Vorsichtig mischen. 0,25 ml dieser Lösung in der Durchstechflasche gelöst Papain. Diese Zubereitung enthält eine Endkonzentration von etwa 20 E / ml und 0 Papain0,005% DNase.
  6. Ort Papain-Lösung (wie oben beschrieben) auf die Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 15-30 min; überwachen die Ablösung der Zellen mit einem Mikroskop. Stoppen der Reaktion mit 5 ml Medium mit oder ohne GF und Zentrifuge bei 1.200 rpm für 7 min.
  7. Übertragen Zellpellets aus beiden Kolben in zwei unterschiedlichen 5 ml Polypropylen-Röhrchen und waschen Sie sie mit normalen physiologischen Medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 10 mM Hepes und 10 mM Glucose) mit 1 mg / ml ergänzt Rinderserumalbumin (NPM + BSA).
  8. Führen Oberfläche Immunfärbung bei 4 ° C für 20 min unter Verwendung von spezifischen und entsprechend titriert Primärantikörper für A2B5, O4, GalC (Tabelle 2).
  9. Waschen der Zellen mit NPM + BSA bei 4 ° C für 5 min und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper bei 4 ° C für 20 min (Tabelle 2).
  10. Um intrazelluläre Antigene einschließlich Nestin, saure Gliafaserprotein (GFAP), Klasse III & sein färbenta;-Tubulin und basischem Myelinprotein (MBP) (Tabelle 2), zu fixieren die Zellen in 2% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT und permeabilisieren mit kaltem 70% igem Ethanol 15 min bei -20 ° C.
  11. Waschen der Zellen mit 1x PBS und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper (Tabelle 2).
  12. Um zwischen intakten Zellen und subzellulären Schmutz während der Durchflusszytometrie diskriminieren, Fleck Zellen mit 4,6-Diamino-2-phenyllindole, Dihydrochlorid (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
  13. Bei der Optimierung des obigen Protokoll, führten wir alle geeigneten Kontrollversuchen um die Spezifität jedes Immunreagenz bestätigen. Kurz gesagt, für direkt markierten Antikörpern, die geeignete Negativkontrolle ein direkt konjugierten Antikörper des gleichen Isotyps Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) und Fluorochrom-Konjugat als primärer Antikörper (dh die Isotyp-Kontrolle). Für indirekte Immunfärbung primärer Antikörper, die entsprechende negative Kontrolle wals sekundärer Antikörper, konjugiert an dem Fluorochrom von Interesse, dass speziell die Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) von dem Wirt, in dem der primäre Antikörper erzeugt wurde angestrebt. Wenn primäre Antikörper von mehreren Hosts (Maus, Kaninchen, Huhn) zusammen verwendet wurden, nutzten wir die sekundären Antikörper gegen den primären Antikörper jeden Host und jeden sekundären Antikörper verwendet wurde typischerweise gegen die Immunglobuline aus den anderen Hosts-adsorbiert überqueren, um cross-Minimierung Gastgeber Immunreaktivität. Die positiven Kontrollen einbezogen direkten oder indirekten Immunfärbung von Zellpräparaten bekannt, die Antigene von Interesse exprimieren entweder mit direkten oder indirekten Immunreaktionen mit den primären Antikörpern, die spezifisch für diese Antigene. Die obigen Optimierungsmethoden wurden einmal für jeden Typ von Immunfärbung Experimente durchgeführt. Steuerung Immunreaktionen zeigten keine signifikante Cross-Epitop Immunreaktivität unter primären und sekundären Antikörpern. Durchflusszytometrie wurde auf einheitlich durchgeführtsuspendiert fluoreszenzmarkierte Zellen unter Verwendung eines FACVantage SE Zellsortierer (BD Biosciences, San Jose, CA) mit drei Laser, welche Anregungslicht Wellenlängen abgestimmt zu 488 nm, 647 nm bereitzustellen ausgestattet, und eine breite UV (351-364 nm) (Abbildung 2) .

5. Immunofluoreszenzassay

Hinweis: Für Immunfluoreszenz Experimenten PDO sind in Oligo-Medium + GF oder Oligo ausplattiert - GF bei 2.5e5 in 6-Well-Platten mit PDL beschichtet. Die Zellen werden in 2% PFA zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren fixiert. Der Antikörper Fleck ist auf Kunststoff-6-Well-Platten anstelle von Deckgläsern durchgeführt.

  1. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie die 2% PFA. Inkubieren für 10 min bei RT. Entsorgen PFA. Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 min. Seien Sie vorsichtig, nicht zu trocknen die Zellen.
  2. Permeabilisieren Zellen für intrazelluläre Marker mit 0,25% Triton-Lösung in PBS für 10 min bei RT.
  3. Um unspezifische Bindung, Block Zellen verhindern foder 10 min mit HHG (1 mM HEPES-Puffer, 2% Pferdeserum und 10% Ziegenserum in balanced salt Hanks-Lösung). Verdünnte spezifischen primären Antikörper (Tabelle 2) zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG. Zeigen verdünnte Antikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf dem Schüttler oder bei 4 ° C über Nacht.
  4. Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min. Verdünnte geeigneten sekundären Antikörpern (Tabelle 2) mit einem Fluorochrom zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG gekoppelt. Legen Sie die Mischung von verdünntem Sekundärantikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf einem Schüttler im Dunkeln.
  5. Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min.
  6. Um zu vermeiden, Ausbleichen hinzufügen 10 ul verlängern Gold mit DAPI zu den Zellen und setzen Sie ein Deckglas auf sie. Visualisieren Sie markierten Zellen mit einem Axiovert 200M Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) (Abbildung 3).

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Representative Results

Es ist sehr wichtig, um die Differenzierung von einer 70% -80% konfluente Zellkultur neuralen Vorläuferzellen (1A) zu starten. Viele Zellen sterben nach dem Wechseln des Kulturmediums aus Vorläuferzellen zu Oligo Medium, da es bestimmte Wachstumsfaktoren enthält. Dies zeigt, daß das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen nicht zu einem Phänotyp oligodendrocytic begangen wird nicht von dem neuen Medium (1B) gestützt werden. Inkubation in Oligo-Medium + GF für eine Woche in Folge einer Zwischenposition aufweisen Kultur einen engen, bipolare Morphologie (1B). Die Zellen werden in Medium + GF Oligo für 3-4 Wochen (1C) gehalten. Wachstumsfaktorentzug aus dem Kulturmedium in Folge progressiv differenziert Kultur von Zellen mit mehreren Prozessen (1D). Durchflusszytometrie zur quantitativen Darstellung der Daten verwendet wird.

Die 2A, 2B und 2C zeigen, dass die Mehrheit der neuralen Vorläuferzellen die neuroepithelialen Stammzellen Nestin exprimiert, während nur kleine Subpopulationen ausgedrückt Linie einschränkendes Marker wie der Astrozyten Marker GFAP (2A), den neuronalen Marker Klasse III β-Tubulin (2B) oder die Oligodendrozyten Marker O4 (Abbildung 2C). Wenn Kulturmedium mit Oligo mittel + GF ersetzt wurde und die Zellen wurden für 1 Woche kultiviert, verringerte Nestin Expression und erhöhte A2B5 Expression beobachtet werden können (Abbildung 2D) werden. A2B5 ist eine Vorstufe neuroglialen Marker. Im Vergleich dazu Medium 2 Wochen nach Ersatz wurde Nestin Expression noch weiter und verringert A2B5 allein eine erhöhte Expression (2E) sowie der Expression eines anderen Oligodendrozyten Marker O4 (2F). Zwei Tage nach Wachstumsfaktorentzug, erhöhte O4 Expression sowie die Expression von GalC, einEnde Oligodendrozyten Marker (2G). Sechs Tage nach Wachstumsfaktorentzug erhöhte die Co-Expression von O4 und GalC (2H) und ist vergleichbar mit der Koexpression von GalC und MBP (2I). Die Multi-Epitop-Immunfärbung zeigt, dass mehr als die Hälfte der Zellen in Kultur exprimieren, MBP (2J). Ein weiterer Beweis für PDO Differenzierung wurde charakterisiert, unter Verwendung eines Immunfluoreszenztest, durch den zeitlichen Anstieg des MBP-Expression in diesen Zellen nach Wachstumsfaktorentzug (3A-C). Zusammenfassend sind humanen fötalen neuralen Vorläuferzellen können in vitro vermehren, während die Fähigkeit, sich in drei großen Gehirn Zelltypen (Abbildung 4) unterscheiden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Phasenkontrast-Mikroskopie of (A) neuralen Vorläuferzellen in Vorläuferzellen kultiviert, (B) neuralen Vorläuferzellen in Oligo-Medium + GF für eine Woche wachsen zeigen eine veränderte schmalen, bipolare Morphologie, (C) differenzierte Vorläuferzellen abgeleiteten Oligodendrozyten für 3 Tage im Medium gezüchtet Oligo Nach Wachstumsfaktorentzug Ausstellung Oligodendrozyten Morphologie durch mehrere Prozesse gekennzeichnet. 20-facher Vergrößerung.

Abbildung 2
Abbildung 2 Durchflusszytometrie Analyse neuronaler Vorläuferzellen Co-Exprimieren des Vorläufers-Zellmarker Nestin (alle vertikalen Achsen) mit:. (A) die astrozytären Marker GFAP; (B) die neuronalen Marker β III-Tubulin, und (C) die oligodendrocytic Marker O4; (D) neuralen Vorläuferzellen für eine Woche in Oligo Medien gezüchtet + GF co-express nestin und A2B5; (E) Nestin und A2B5 Co-Expression nach zwei Wochen neuralen Vorläuferzellen Wachstum in Oligo-Medium + GF (F) A2B5 und O4 Co-Expression nach zwei Wochen neuralen Vorläuferzellen Wachstum in Oligo-Medium + GF; (G) zwei Tage nach Wachstumsfaktor Rückzug werden verschiedene Oligodendrozyten Marker der Differenzierung, O4 und GalC, ausgedrückt. Sechs Tage nach Wachstumsfaktorentzug (H) ein erhöhter Anteil von Zellen sind doppelt positiv für O4 und GalC; (I) doppelt positiv für GalC und MPB und (J) doppelt positiv für O4 und MBP. AJ sind repräsentativ für vier unabhängigen Experimenten. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Indirekte immunofluorescence Färbung von Vorläuferzellen abgeleiteten Oligodendrozyten für MBP (A) 2 Tage, (B) 5 Tage, und (C, D) 9 Tage nach Wachstumsfaktorentzug. (D) Stellt die Phase Bild der 9 Tage Kultur in Oligo mittel - GF und (E) ist eine Erweiterung der White-Box des gleichen Bildes (A, B) 20-facher Vergrößerung; (C, D) 32x Vergrößerung..

Abbildung 4
Abbildung 4. Schematische Darstellung unserer Zellkultur-Modell. Primary, humanen fötalen brain-derived, multipotente neurale Vorläuferzellen in vitro vermehren unter Beibehaltung ihrer Plastizität. Mit unterschiedlichen Kulturbedingungen, neuralen Vorläuferzellen können in Neuronen (PDN), Astrozyten (PDA) und Oligodendrozyten differenzieren (PDO), geändert durch spezifische angezeigt differentiatIonen-Markern.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Ableitung fetaler Oligodendrozyten aus primären humanen neuralen Vorläuferzellen und zu charakterisieren ihren Phänotyp sowohl mit Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz. Der Ausbau und das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen aus fetalem ZNS wurde sehr gut 1-4 beschrieben. Allerdings erhalten ausreichende personelle Oligodendrozyten in vitro Experimente bleibt schwierig, obwohl es möglich ist, zu identifizieren und zu isolieren, glialen Vorläuferzellen aus adulten menschlichen weißen Substanz 5-13. Es wurden verschiedene Versuche bei der Entwicklung von verschiedenen Kulturbedingungen direktem Differenzierung von fötalen neuralen Vorläuferzellen in Myelin Herstellung Oligodendrozyten 14-21. Dieses Protokoll beschreibt ferner positive Nestin neuralen Vorläuferzellen exprimieren das Marker O4 (Abbildung 2), wenn sie für 3 Wochen in einem serumfreien Medium mit ausgewählten Wachstumsfaktoren (PDGF-AA, bFGF, Shh und NT-3), t, gezüchtetHut sind essentiell für die Proliferation und das Überleben von Oligodendrozyten Vorstufen 22-24. Entfernen dieser Wachstumsfaktoren in den O4 +-Zellen führte zu einer weiteren Differenzierung und Expression von Myelin Komponenten (Galactocerebrosid und MB). Darüber hinaus fällt der Ausdruck Oligodendrozyten Differenzierungsmarker mit morphologischen Veränderungen von Zellen, die auf den ersten erschien schmal und bipolar (Abbildung 1B), um Zellen zu multipolaren mit gut entwickelten Prozesse (1C) zu werden. Die Entfernung von Wachstumsfaktoren zur weiteren können die letzten Schritte der Differenzierung auf Studien sowohl in Maus und Mensch 15,25 getan basiert. Die Anwesenheit von Trijodthyronin (T3) für das Überleben und die Differenzierung von Oligodendrozyten 26 wichtig, während man beobachtet, dass die Entfernung der vier Wachstumsfaktoren gegebenenfalls auf die Expression von Markern für Differenzierung endgültigen war. Dies wurde im Vergleich zu Zellen in Oligo-Medium + GF hielt einsa Kontrolle.

Wir sind nicht die ersten, die die Differenzierung von multipotenten neuralen Vorläuferzellen zu Oligodendrozyten beschreiben als Reaktion auf Signale wie Shh und bFGF 24. Frühere Berichte haben gezeigt, dass kortikale oligodendrogenesis beginnt um 10 Wochen Gestationsalter beim Menschen 24 mit einer Kapazität von humanen fötalen Oligodendrozyten zu myelinisieren Erhöhung proportional mit Gestationsalter 22. Differenzierung Galactocerebrosid + und O4 + Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus neuralen Vorläuferzellen wurde berichtet, mit zweiten Trimester fetalen Gehirns 21,27. Allerdings sind diese Zellen nicht proliferieren in Abwesenheit von Stützzellen einschließlich Astrozyten und Neuronen, und werden schnell mit der Zeit in Kultur 21 verloren. Unser System unterstützt die Bildung von GalC + und MBP +-Zellen aus humanen fötalen Kultur von 8 Wochen der Schwangerschaft. Außerdem haben wir beschrieben, dass die differentiated Oligodendrozyten konnte in vitro ohne die Notwendigkeit von Stützzellen als Astrozyten oder Neuronen kultiviert werden, obwohl die Co-Kultivierung mit Nervenzellen das Überleben der differenzierten Oligodendrozyten verlängern könnte. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Möglichkeit, eine große Anzahl von Zellen, die den Marker, O4 + gewachsen und können passagiert werden in Kultur für Wochen unter Beibehaltung ihres Phänotyps kultivieren. In diesem Moment diese O4 +-Zellen können weiterhin in den letzten Schritt der Differenzierung, wenn die Wachstumsfaktoren aus dem Medium entfernt werden geschoben werden. Das Protokoll in diesem Papier skizzierten adressiert den Bedarf an Oligodendrozyten Linien geeignet für in-vitro-Experimente. Darüber hinaus glauben wir, dass die Identifizierung von Faktoren, die die Differenzierung Kaskade von neuralen Vorläuferzellen zur Vorläuferzellen abgeleitete Oligodendrozyten induziert ist wichtig für das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen der EntwicklungÜbergänge. Es kann auch als ein wichtiges Instrument dienen Studium demyelinisierenden Erkrankungen und Virus-Wirt-Zell-Interaktionen beziehen sich auf die Pathogenese der menschlichen neurotropen Viren wie JCV.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Intramural Research Program des National Institutes of Health, NINDS unterstützt. Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Labors für Molekulare Medizin und Neurowissenschaften, Rick Dreyfuss für die Hilfe bei Mikroskopie und Pamela C. Sieben für die Hilfe bei der Bearbeitung danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI
Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.

Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500)
Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000)
Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)
Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100)
Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10)
Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.

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References

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