Author Produced

Time-lapse fluorescensimagografi af Arabidopsis rodvækst med Rapid Manipulation af The Root miljøet ved hjælp af RootChip

Bioengineering
 

Summary

Denne artikel indeholder en protokol til dyrkning af Arabidopsis planter i RootChip, en mikrofluid billedbehandling platform, der kombinerer automatiseret kontrol af vækstbetingelser med mikroskopiske rod overvågning og FRET-baseret måling af intracellulære metabolit niveauer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grossmann, G., Meier, M., Cartwright, H. N., Sosso, D., Quake, S. R., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. J. Vis. Exp. (65), e4290, doi:10.3791/4290 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De rod fungerer som den fysiske anker af anlægget, og er det organ, ansvarlig for optagelse af vand og mineralske næringsstoffer som kvælstof, fosfor, sulfat og sporstoffer, at planter erhverver fra jorden. Hvis vi ønsker at udvikle bæredygtige tilgange til at producere højt høstudbytte, er vi nødt til bedre at forstå hvordan roden udvikler sig, tager et bredt spektrum af næringsstoffer, og interagerer med symbiotiske og patogene organismer. For at opnå disse mål, er vi nødt til at være i stand til at udforske rødder i mikroskopiske detaljer i perioder varierende fra minutter til dage.

Vi har udviklet RootChip, en polydimethylsiloxan (PDMS) - baseret mikrofluid enhed, som giver os mulighed for at vokse og billede rødder fra Arabidopsis planter og samtidig undgå fysisk stress til rødderne under forberedelserne til billedbehandling 1 (figur 1). Enheden indeholder en tvedelt kanal struktur byder mikromekaniske ventiler til at styre væskestrømmenfra opløsning indløb til hver af de otte observation kamrene 2. Dette perfusionssystem tillader roden mikromiljø, der skal kontrolleres og modificeres med præcision og hastighed. Volumenet af kamrene er ca 400 nl, hvilket således kræver kun minimale mængder af testopløsning.

Her giver vi en detaljeret protokol for at studere rod biologi på RootChip med imaging-baserede metoder med real time opløsning. Rødder kan analyseres over flere dage med tidsforskydningen mikroskopi. Rødder kan perfunderet med næringsopløsninger eller inhibitorer, og op til otte kimplanter kan analyseres parallelt. Dette system har mulighed for en bred vifte af anvendelser, herunder analyse af rodvækst i nærvær eller fravær af kemikalier, fluorescens-baseret analyse af genekspression og analyse af biosensorer, f.eks FRET nanosensorer 3.

Protocol

Bemærk: Udfør alle trin forberedende skridt under sterile forhold.

1. Udarbejdelse af plast kegler for frøspiring

  1. Fyld en 10 cm petriskål med vækstmedium indeholdende 1% agar til en tykkelse på 5 mm. Vi anvender en halv styrke modificeret Hoagland medium 4, men medium sammensætning skal vælges til at passe individuelle eksperimentelle betingelser.
  2. Mens mediet stadig er flydende, benytte en multi-kanal pipette til at fylde 10 ul pipettespidser med 5 pi medium fra petriskålen.
  3. Opbevar de fyldte tips i pipettespidsen kassen, indtil mediet er solid, derefter skæres til 4 mm lange plastik kegler og sted oprejst i en petriskål med solid vækst medium.

2. Seed Spiring og vækst af frøplanter

  1. Overfladen sterilisere frø i 5% NaOCl i 5 minutter, vaskes tre gange med sterilt vand, derefter placere et enkelt frø på toppen af ​​hver af mediet fyldt keglesek.
  2. Forsegl fad med Micropore tape (3M) og opbevares ved 4 ° C for at synkronisere spiring.
  3. Efter tre dage overføre pladerne til en vækst kabinet til at starte spiring. Vores vækstbetingelser er 23 ° C ved en 16h høj light/8h mørke cyklus (Lys intensitet: 100 uE m -2 s -1).
  4. Mellem 5 og 7 dage efter spiring, bør kimplanterne være klar til overførsel til RootChip. På dette tidspunkt bør rodspidser være nær bunden udløbene af plast kegler. Check sætteplante sundhed, rod længde og, hvis det er relevant, udtryk for en fluorescerende markør under et dissektionsmikroskop.
  5. Mark enkelte frøplanter for overførsel på chippen. Vælg ti eller deromkring planter i tilfælde ene er beskadiget under overførslen.

3. Overførsel af kimplanterne på RootChip

  1. At sterilisere RootChip for langsigtede eksperimenter, wrapindretningen i tissuepapiret, hældes i et glas petriskål, og autoklaven.
  2. Når RootChip er afkølet, dække det med flydende vækstmedium. Den RootChip skal være helt nedsænket, men væskeniveauet bør ikke være mere end 3 mm over RootChip overfladen.
  3. Med en 20 ul pipette, træk medium gennem roden indløbet og kammeret udløb at fylde observationskammeret med medium.
  4. Plug plastik kegler valgt i trin 2,5 i de RootChip indløb. Keglerne skal passe stramt i indløb. Idet RootChip er monteret på et tyndt lag af optisk glas, ikke anvendes for meget tryk på chippen.
  5. Inkubér RootChip natten over i flydende medium. For at forhindre flydende, placere to objektglas på chippen. Tilføje en magnetisk omrørerstav og lukke skålen.
  6. Overfør forsamling til en magnetomrører og ryst forsigtigt mediet.
  7. Den RootChip s indløb skærer kanalerne ved en 30 ° vinkel i forhold til indretningen vinkelret FACIlitate rodvækst i kanalerne (figur 1A). For yderligere at understøtte vækst i den ønskede retning, vippe indretningen let ved at anbringe et objektglas under petriskålen på den side af chippen modsatte af udløbene.
  8. At opretholde lys / mørke-cyklus, belyse kimplanterne med en ring lampe (lysintensiteten: 100 uE m-2s-1) forbundet til en timer.

4. Tilslutning af RootChip til Carrier

  1. Den følgende dag, udfylde en forseglelig, under tryk hætteglas med flydende vækstmedium (figur 1B).
  2. Vend chip-bæreren, og læg den på et stabilt underlag. Fjerne RootChip fra det flydende medium og indsætte det PDMS nedad ind i bunden åbningen af ​​chip-bæreren. Orientere chip, så at siden, der indeholder kontrol lag indløbene vender den side af trykledningen rør konnektorer i bærekartonen sidevæg.
  3. Tør dækslet glasset påBunden af ​​chippen ved forsigtigt blotting med silkepapir. Fastgør RootChip til transportøren med tape, og til højre hele forsamlingen.
  4. Rør stik fremstilles ved at skære fleksibel plast microbore rør (Tygon, 0,20 "ID x 0,060" OD) i 5 cm lange stykker og forbinde dem til rustfrit stål microbore rør (New England lille rør, 0,025 "OD x 0,013" diameter x 0,75 " lange). Fyld slangen stikkene med vand under anvendelse af en sprøjte, og prop hver slangeforbindelsesindretningen i den tilsvarende kontrol lag indløb på chippen. Vandet vil senere fylde kontrollag kanaler og blive anvendt til at overføre tryk til mikromekaniske ventilerne.
  5. Sæt den modsatte ender af linierne i de medier og flasken (s). Påføre tryk til opløsningen hætteglasset med en sprøjte luft. Den øget lufttryk i flasken vil tvinge væsken ind i linierne.

5. Montering af RootChip på mikroskopet

  1. Anbring transportkassen på Microscope fase. For at reducere muligheden for konstruktionen forskydning i løbet af forsøget på grund af vibrationer i rummet, skal bæreren passe nøjagtigt ind i udskæringer i trin insertet.
  2. Chip ventiler og strømmen af ​​mediet gennem chip styres af lufttryk. To linier med regulerende afgrenes fra en primær trykledning - en bruges til at styre mediet strømmer gennem kanalerne, og den anden er forbundet til magnetventiler luftventiler at aktivere trykknappen op ventiler af kontrol lag. De magnetventiler betjenes fra computeren via USB ventilstyring (udviklet af Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Luk begge trykregulatorer, før du tilslutter chip.
  3. Tilsættes nogle få ml vand til reservoirerne af bæreren for at holde luftfugtigheden høje i konstruktionen. Dette trin gentages i løbet af længere eksperimenter for at holde de planter mod udtørring. Holde volumenet lav til at minimere tHan væskemængde, der kan spildes på mikroskopet. For langsigtede eksperimenter, kan udstrømningen fra chippen udløb ledes ind i reservoirerne i bæreren ved at forbinde chip udløb til reservoirer med microbore rør (se trin 4.4). Alternativt kan udstrømningen, der akkumuleres på chipoverfladen opsamles ved pipettering.
  4. Forbered kvadreret ark af gennemsigtigt plastik fra ark beskyttere (C-Line). Fastgør gennemsigtig plast til luftfartsselskabet ved at dobbelt-tape for at opretholde en høj luftfugtighed i forsamlingen.
  5. Placere ringen lys over chippen og opretholde lys / mørke-cyklus. Ringen lys skal slukkes før påbegyndelse af en eksperiment, der anvender fluorescerende markører, som direkte belysning vil forstyrre billedet samling.

6. Drive RootChip hjælp af LabView grænseflade

Den RootChip controller interface til LabView software platform kankan downloades fra vores hjemmeside http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

  1. Ventilerne på chippen er lukket ved at påføre tryk til kontrol lag, i dette tilfælde ved at åbne magnetventilerne luftventiler. Regulatoren grænseflade tillader aktivering af ventilerne ved at klikke på knappen nedenfor ventilen nummer. Lysegrønt angiver anvendelsen af tryk og lukning af en chip ventil (figur 2B). Aktiver alle tre løsningen-indsugningsventiler i regulatoren grænseflade inden du åbner trykregulatorer. Bemærk: controller interfacet har en feedback-loop, som tillader overvågning af systemets status. Denne funktion kan aktiveres ved at klikke på "Readback" knappen i controller interface.
  2. Åbn trykregulator til kontrol lag og i første omgang sat til 15 psi, og åbn derefter regulator for strømmen lag og i første omgang sat til 5 psi. Afhænding af den ønskede strømningshastighed, kan trykkene justeres senere.
  3. Åbne indløbsventil for vækstmediet af valg at skylle kamrene med medium.
  4. Check strømningsveje under mikroskop. Typisk bliver luft fanget i strømningskanalerne og skal fjernes. Derudover kanalerne i kontrolgruppen laget stadig indeholde luft, der skal tvinges ud og erstattes af vand fra røret konnektorer dead-end fyldning). Begge opgaver opnås ved skylning hver af de otte kamre flere gange (5 psi), indtil al luft tvinges fra kanalerne ind i PDMS ("afgasning"). Bemærk: controller-interface kan programmeres til at automatisere eksperimenter. Sådanne rutiner kan også anvendes til at afgasse chippen.

7. Repræsentative resultater

Det primære formål RootChip er at kombinere en afbildning platform og en perfusion system i en enkelt anordning med en høj grad af integration. For at demonstrere manipulationaf mikromiljøet af rødder vi skyllet kamrene med mørk levnedsmiddelfarvestof (1:4 fortynding i hydroponiske medium) og målt udveksling af væske i kamrene. Den anbefalede tryk på 5 psi målte vi en fuldstændig udveksling inden for 10 sekunder ved en beregnet strømningshastighed på 1,5 ul / min (fig. 3).

Vi har også observeret rodvækst af kimplanter, i dette tilfælde dyrkes i mørke og forsynet med 10 mM glucose som en ekstern energikilde (figur 4). Afhængigt af vækstbetingelser, såsom lys og sammensætningen af ​​mediet, kan planter observeres i RootChip op til tre dage.

Den RootChip er blevet anvendt til at overvåge intracellulære glucose og galactose niveauer i rødderne udtrykkende genetisk indkodede nanosensorer, baseret på Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 5-7. Rødder i chippen blev perfunderet med firkantede impulser af glucose eller galactose opløsning (

Figur 1
Figur 1. RootChip princip.

  1. Den RootChip indeholder otte observation kamre for vækst og billeder af rødder. Frøene 1:e spire i plast kegler - fremstillet af plast pipettespidser - som er fyldt med fast medium. Den rodspids vokser gennem mediet, og når kammeret, hvor en kontinuerlig strøm af flydende medium holder betingelserne i kammeret konstant. Mikromekanisk ventiler (rød) kontrollere strømmen. Chippen er monteret på en optisk dækglas.
    Tegning ikke at skalere. (Tilpasset med tilladelse fra Grossmann et al., 2011 Plant Cell.)
  2. Scheme af en under tryk opløsning hætteglas med membranen (rød).

Figur 2
Figur 2. Tilslutning og montering af RootChip.

  1. Topbillede af helt tilsluttet RootChip og bæreren er monteret på et inverteret mikroskop.
  2. Ordningen illustrerer ventilsystem og styreenheden grænsefladen. Et eksempel på en ventil indstilling til at lede fluidstrømmen til en enkelt kammer er vist. Mens ventiler 4 til 8 virker som enkelte ventiler, ventiler 0 til 3 handler i grupper. Med dette system en enkelt kammer kan behandles ved at aktivere en kombination af ventiler.

Figur 3
Figur 3. Udveksling af løsninger i observationen lmAmbers. visualisering af udvekslingen af fluid i et observationskammer hjælp farveopløsning. Billedet er en overlejring af lyse område og falsk-farvet intensiteten af ​​farvesignalet.

Figur 4
Figur 4. På chippen rodvækst. Observation af en enkelt voksende rod udtrykke et fluorescerende FRET nanosensor for glukose / galactose i løbet af 20 timer. Tidsformat: tt: mm; skala bar: 100 um.

Figur 5
Figur 5. Måling af intracellulære sukker niveauer ved hjælp af FRET nanosensorer.

  1. Mængden af ​​sensoren er vist som citrin intensitet i rodspids (til venstre). Reaktionen af ​​intracellulære FRET nanosensor anvendelsen af ​​glucose eller galactose opløsning er vist som ratiometriske billeder. (Tilpasset med tilladelse fra Grossmann et al., 2011 Plant Cell) Målestok:. 100 um.
  2. Sporing FRET forholdet ændringer som reaktion på tre gentagne kvadratiske impulser med glucose (grøn) og galactose (rød).

Discussion

De væsentligste fordele ved RootChip forhold til konventionelle vækst metoder er minimalt invasiv forberedelse mikroskopi, evnen til reversibelt og gentagne gange at ændre roden miljøet og evnen til kontinuerlig overvågning af udviklingsmæssigt kompetent og fysiologisk sundt væv i løbet af en periode på adskillige dage. Tidligere blev kimplanter dyrket lodret gelerede medier og overføres til en perfusionssystem umiddelbart før forsøget, der kun tillades at måle en enkelt rødder på et tidspunkt 8. Mikrofluidenheder værktøjer er blevet brugt til Arabidopsis, men på et lavt integration niveau 9 eller uden perfusion kontrol 10. Det RootChip kombinerer en høj grad af integration med muligheden for at automatisere eksperimenter gennem præcis flow vejledning. En anden fordel ved denne platform, som er karakteristisk for alle mikrofluide anordninger 11, er, at kun minimale mængder af væske skal forsyne roden den nødvendige møtrikkenrients, selv for eksperimenter spænder over flere dage. Den RootChip øjeblikket udformet som en enkelt-brug enhed, men da produktionsomkostningerne for chips er lave, de små mængder af forbruges reagenser gør chippen stadig meget omkostningseffektiv.

Der er et par vigtige skridt, der skal træffes for at sikre sundheden for de planter:

Lydstyrken i plastic kegler er kun 3-4 pi, som vil begynde at tørre, når de udsættes for luft. Derfor er det kritisk, at keglerne overføres på chippen hurtigt og fugtighed holdes høj, indtil roden er nået observation kamre, der forsyner dem med tilstrækkeligt vand. Trin 4,2 til 4,5 skal udføres hurtigt og uden afbrydelse for at forhindre udtørring af frøplanter.

Trin 3.5 - 3.8 beskriver inkubering af chippen i flydende medier, hvor de rødder vokser ind i observation kamre. Dette trin kan springes ved at montere jeton i carrier straks begynder konstant perfusion med vækstmedium. Imidlertid anbefales gennemvædning i vækstmedium natten, da det har nogle fordele: 1) skaber et fugtigt miljø, så kimplanterne er mindre tilbøjelige til at blive tørret som de vokser i observationskammeret, 2) chippen gennemvædes i væsken, således afgasning (trin 6,4) vil være hurtigere.

Det er vigtigt at anvende medier med lave koncentrationer af opløst stof. Mere koncentrerede opløsninger kan udfælde, og tilstoppe kanaler, især hvis chippen anvendes over flere dage.

Når enheden er forbundet til lufttryk linie, er strømmen af ​​medium styres ved at ændre hydraulisk tryk i ventilerne. At sikre en korrekt lukning af mikromekaniske ventiler, er det vigtigt at vælge et styretryk, der er omkring tre gange større end strømningstryk. Strømningen trykket bør ikke overstige 15 psi, idet fluidet vil blive presset ud af de grundliggende indløbene. Højere tryk may også forårsage delaminering af chippen, som gør chip ubrugelig.

En begrænsning af RootChip at PDMS er porøs og hydrofob. Medens materialet er praktisk inert for vandige opløsninger, kan det absorbere organiske forbindelser 12. Dette kan interferere med en hurtig udveksling af opløsninger som organiske forbindelser kan lække fra det materiale, selv når forsyningen af ​​denne forbindelse er blevet stoppet ved indløbet. På grund af porøsiteten kan anvendes organiske opløsningsmidler forårsage kvældning af PDMS 12.

Vi fortsætter med at optimere RootChip og udvide sin funktion, for eksempel med rødder i afgrødeplanter. Vi mener, at ved at forbedre adgangen til roden for behandling og observation, vil mikrofluid værktøjer som RootChip åbne op for nye dimensioner af rod forskning.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Philipp Denninger for at få hjælp med video forberedelse og Bhavna Chaudhuri for at give plante-linjer udtrykker FRET sensorer. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation (MCB 1.021.677), Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) til WBF, National Institutes of Health, og Howard Hughes Medical Institute til SRQGG blev understøttet af en EMBO lang sigt fællesskab. MM blev støttet af Alexander von Humboldt Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chip carrier, software and other information. Carnegie Institution - DPB CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website.
RootChip Stanford Foundry Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip controller Home-built The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grossmann, G. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
  2. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  3. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells. Annu. Rev. Plant Biol. (2012).
  4. Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake. Nature. 446, 195-198 (2007).
  5. Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).
  6. Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).
  7. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).
  8. Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants. J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).
  9. Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip. Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).
  10. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).
  11. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  12. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).

Comments

2 Comments

  1. How can I get a chamber like that, can I buy it? where to ask for it?...Thanks a lot,
    Luis Cardenas

    Reply
    Posted by: luis c.
    September 3, 2012 - 5:28 PM
  2. Hi,
    chips can be ordered from the Stanford Microfluidics Foundry ( http://www.stanford.edu/group/foundry/). Select custom-made PDMS chips and refer to "RootChip Vs1". To set the system up in your lab you also need valves and controller for the pressure line. Instructions how to build these can be found under the links given in the article. Please feel free to contact me by email for further details.

    Guido

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2012 - 5:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics