Plaque-Assay für Murine Norovirus

Immunology and Infection
 

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

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Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque Assay for Murine Norovirus. J. Vis. Exp. (66), e4297, doi:10.3791/4297 (2012).

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Abstract

Murine Norovirus (MNV) ist das einzige Mitglied des Norovirus Gattung, die effizient wächst in Gewebekultur 1, 2. Zelllyse und cytopathischen Effekt (CPE) während MNV-1-Infektion von murinem dendritische Zellen oder Makrophagen 1 beobachtet. Diese Eigenschaft der MNV-1 kann verwendet werden, um die Anzahl der infektiösen Partikel in einer bestimmten Probe durch Durchführen einer Plaque-Assay 1 zu quantifizieren. Die Plaque-Assay beruht auf der Fähigkeit von MNV-1 an Zellen zu lysieren und die Löcher in einer konfluenten Zellmonolayer, die aufgerufen werden 3 Plaques bilden.

Mehrere Techniken können verwendet werden, um virale Infektionen in Gewebekultur, geerntet Gewebe, klinischen und Umweltproben nachzuweisen, aber nicht alle Maßnahme die Zahl der infektiösen Partikel (zB qRT-PCR). Ein Weg, um infektiöse virale Partikel zu quantifizieren ist, um eine Plaque-Assay 3, welche im Detail unten beschrieben wird ausgeführt. Eine Variation des MNV Plaque-Assay ist die fluorescent Fokus Assay, wobei MNV Antigen in Zellmonoschichten 4 immungefärbt wird. Dieser Assay kann schneller sein, da virale Antigen-Expression vorausgeht Plaquebildung. Es ist auch nützlich zum Titrieren Viren nicht in der Lage, Plaques zu bilden. Jedoch erfordert das fluoreszierende Fokus Assay zusätzliche Ressourcen über die des Plaque-Assay, wie Antikörper und einem Mikroskop, um Fokus-bildenden Einheiten zu zählen. Infektiöse MNV kann auch durch Bestimmung der 50% Gewebekultur infektiöser Dosis (TCID 50) 3 quantifiziert werden. Dieser Assay misst die Menge des Virus erforderlich ist, um CPE in 50% der Gewebekulturzellen inokuliert durch Titrationsverdünnung 5 herzustellen. Allerdings ist seine Nachweisgrenze höher im Vergleich zu einem Plaque-Assay 4.

In diesem Artikel beschreiben wir einen Plaque-Assay-Protokoll, das verwendet wird, um effektiv die Anzahl von infektiösen MNV vorhandenen Partikel in biologischen oder Umweltproben 1, 4, 6 kann. Diese Methode ist based auf die Herstellung von 10-fache serielle Verdünnungen von MNV-haltigen Proben, die verwendet werden, um eine Monoschicht von permissiven Zellen (murine Makrophagen RAW 264.7-Zellen) zu inokulieren werden. Virus läßt auf die Zellmonoschicht für einen gegebenen Zeitraum befestigen und dann abgesaugt vor dem Abdecken Zellen mit einem Gemisch von Agarose und Zellkulturmedien. Der Agar ermöglicht die Ausbreitung von viralen Nachkommen zu benachbarten Zellen bei gleichzeitiger Begrenzung Ausbreitung auf weit entfernten Zellen. Folglich werden infizierten Zellen lysiert und Form Löcher in der Monoschicht als Plaques bekannt. Bei ausreichender Ausbreitung des Virus, Plaques sichtbar geworden folgenden Färbung der Zellen mit Farbstoffen, wie Neutralrot, Methylenblau, Kristallviolett oder. Bei niedrigen Verdünnungen, stammt jedes Plaque von einem infektiösen Viruspartikel und seiner Nachkommen, die auf benachbarte Zellen ausbreiten. Somit Zählen der Anzahl der Plaques erlaubt es, Plaque-bildenden Einheiten (PFU) in der unverdünnten Probe 3 zu berechnen.

Protocol

Ein. Kultivierung der Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7

  1. Pflegen RAW 264.7-Zellen (ATCC, Katalog # TIB-71) in DMEM-10 Medien, die von hoher Glucose DMEM besteht mit 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (<10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin. Zellen werden typischerweise in 175 cm 2 Gewebekulturflaschen mit 35 ml Medium pro Kolben gehalten und bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Gewebekultur-Inkubator. Jedoch kann eine beliebige Größe Kolben mit einem Volumen von Medien, die für die Größe des Fadens verwendet werden.
  2. Um Zellen aufgeteilt: absaugen die alten Medien, fügen Sie 10 ml frisches DMEM-10 Medien zu den Zellen, und dann kratzen die Zellen aus dem Boden des Kolbens mit einem Zellschaber. Anschließend werden die Zellen in eine homogene Lösung durch Aufstellung Zellen in einer 10 ml Pipette und kräftig Zusammendrücken der Zellen durch die Pipettenspitze prEssed gegen den Boden des Kolbens. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 3 mal so die Zellen nicht mehr verklumpen. Überprüfen durch Lichtmikroskopie, dass eine einzelne Zellsuspension generiert wurde. Dann wird 1 ml (1:10 Verdünnung oder ~ 1x10 7 Zellen) - 2 ml (1:5 Verdünnung oder ~ 2x10 7 Zellen) der Zellsuspension auf eine neue 175 cm 2-Kolben, und bringen das Endvolumen von Medien bis 35 ml.
  3. Split Zellen, wenn sie nahezu konfluenten (~ 1x10 8 Zellen total/175 cm 2-Kolben) sind: alle drei Tage, wenn beginnend mit einer 1:10-Verdünnung oder alle zwei Tage, wenn beginnend mit einer 1:5-Verdünnung. Verwenden Lichtmikroskopie die Zellmorphologie vor der Spaltung Zellen zu überprüfen. Die meisten der Zellen aussehen sollte rund und nicht aktiviert. Aktivierte Zellen Granulat und / oder verlängerten spindly Morphologie mit Anhängsel. Lassen Sie sich nicht Zellen überwuchern wie diese Zellen normalerweise nicht bilden kann Plaques. Verfolgen Sie die Passage-Nummer und häufig beginnen durch Auftauen einen unteren Durchgang Aliquot von Zellen. (Wir verwenden Durchgang 30 als Cut-off).

2. Infect RAW 264,7 Zellen mit MNV Inokulum

  1. Seed RAW 264,7 Zellen in 6-Well-Platten (3,5 cm Durchmesser) mit einer Dichte von 1x10 6 lebensfähigen Zellen / ml in DMEM-10 Medien, und 2 ml dieser Suspension in jede Vertiefung. Es ist wichtig zu Zellen gleichmäßig verteilt in Vertiefungen entweder durch Schwenkplatten von Hand wenigstens 10 mal oder durch Verwendung einer Vorrichtung zum Schaukeln ~ 10 min. Nicht schwenken die Platten, da dies die Zellen-Cluster führen in der Mitte des Brunnens. Ort Platten in eine Gewebekultur-Inkubator (bei ​​37 ° C und 5% CO 2). Erlauben Zellen über Nacht oder für mindestens 4 Stunden befestigen bei 37 ° C Zellen sollten 60 - 80% konfluent für die Plaque-Assay und gleichmäßig durch die gut verteilt.
  2. Am nächsten Tag bereiten die Virusinokulum, die aus MNV-infizierten Zellen in Gewebekultur oder aus homogenisiertem Gewebe oder Stuhlproben von MNV-infizierten Mäusen sein kann. Bei der Verwendung von Gewebeproben, erbsengroße piECEs von Gewebe werden in 2 ml Schraubverschluss Röhrchen mit sterilem Silicakügelchen in 1 ml DMEM-10 unter Verwendung eines gewebespezifischen Homogenisator (; Roche zB MagnaLyser) homogenisiert. Kotproben für sollte nicht mehr als 3 fäkalen Pellets in 1 ml Medium homogenisiert werden. Alle Proben werden dann eingefroren (bei -80 ° C) und einmal vor der Durchführung des Plaque-Assay aufgetaut.
  3. Planen 10-fachen Verdünnungen des Virus Inokulum in komplettem DMEM-5-Medium, das aus DMEM / High Glucose, 5% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (<10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 besteht U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin.
  4. Zehnfachen Reihenverdünnungen in 24-Well-Platten werden hergestellt: Eine Repetierpipette dient 1,35 ml Medium in mehreren Mulden zu verzichten, wird der 10 -1 Verdünnung durch Mischen 1,35 ml Medium und 0,15 ml Virus-enthaltende Probe gemacht, und dann 0,15 ml der 10 -1 Verdünnung auf 1,35 ml Medium zugegeben, um das 10 -2 dilutio machenn und so weiter. Es ist wichtig, zu ändern Tipps jedes Mal, wenn Sie eine neue Verdünnung. Ein Mehrkanalpipette können die Verdünnungen von mehreren Proben zu einem Zeitpunkt machen mit zwei Spitzen Einpassen in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte übertragen ein Gesamtvolumen von 0,15 ml pro Vertiefung (siehe 3A) werden.
  5. Eine typische Verdünnungsbereich für Gewebehomogenaten und fäkale Ãœbersetzungssystem 10 -1 bis 10 -3. Allerdings neigen Plaques aus diesen Proben kleiner zu sein im Vergleich zu denen aus Gewebekultur Proben. Weiterhin kann in einigen Fällen eine 1:100 Verdünnung von Kotproben benötigt wird, um ausreichend verdünnt heraus keine toxischen Bestandteile der Fäkalien, die Zellmonoschicht stören kann und behindern so die Fähigkeit, Plaques zu zählen. Die Verdünnung von Gewebekultur Lysaten hängt vom Zeitpunkt des Interesses während des viralen Lebenszyklus. Verdünnungen, die nach oben bis 10 -9 kann an der Spitze der Infektion benötigt werden.
  6. Nachdem die serielle Verdünnungen hergestellt werden, beschriften Sie die 6-Well-Plattes mit RAW 264,7 Monoschichten (aus Abschnitt 2.1) mit der Probe Namen und Verdünnungen als überzogen. Eine Platte zu einer Zeit, entfernen Sie alle Medien durch Ausklopfen it out oder Absaugen es. Unmittelbar danach 0,5 ml einer verdünnten Probe zu einem gut, dann mit einem doppelten gut wiederholen, bevor Sie mit dem nächsten Verdünnung. Sobald alle drei Verdünnungen werden mit einer Platte, Schwenkscheibe hin und her von Hand hinzugefügt, um sicherzustellen, dass alle Zellen wurden abgedeckt. Behandeln einer Platte zu einem Zeitpunkt, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen.
  7. Nach Zugabe von 0,5 ml der Verdünnungen in jede Vertiefung, stapeln Platten aufrecht und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Da das Volumen jeder Vertiefung hinzugefügt, um nicht ausreicht, um die Monoschicht vollständig abzudecken, müssen die Platten sanft hin und her geschwenkt werden von Hand alle 10-15 min oder auf einer schaukelnden Vorrichtung (~ 18 Schwingungen pro min). Dies verhindert, dass Zellen vor dem Austrocknen.

3. Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (SeaPlaque) Overlay Vorbereitung

  1. Den Gehalt an Überlagerung für das Gesamtvolumen der Platten erforderlich, bevor die Inkubation 1 Stunde beendet ist. Das Volumen benötigt wird, 2 ml / well oder 12 ml/6-well Platte. Bereiten Agarose (siehe Abschnitt 3.2) und Medien (siehe Abschnitt 3.3) getrennt.
  2. Um die Agarose vorzubereiten, auszusetzen 3 g SeaPlaque Agarose in einem Gesamtvolumen von 100 ml destilliertem Wasser (3% w / v) in einer Glasflasche. Autoklaven für 20-30 min. (Wenn Agarose wurde bereits vor Hand, re-melt Agarose in der Mikrowelle zubereitet.) Es ist wichtig, SeaPlaque Agarose auf 42 ° C im Wasserbad vor Gebrauch, denn wenn die Agarose zu heiß ist, wird es die Zellen zu töten äquilibrieren. Stellen Sie sicher Wasserstand ist gleich oder höher als das Niveau der Agarose zu unerwünschten Verfestigung zu vermeiden.
  3. Um die Medien vorzubereiten: make 100 ml 2x MEM-Medium, das sich aus2x MEM, 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (<10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin. Äquilibrieren Medien auf 37 ° C im Wasserbad.
  4. Mischen sowohl die Agarose und die SeaPlaque 2x MEM-Medien gemeinsam in eine sterile Flasche im Verhältnis 1:1 unmittelbar vor Überlagern der infizierten Zell-Monolayer. Wenn mehr als 200 ml Overlay wird benötigt, Split Volumen in mehrere Flaschen und halten in 37 ° C warmes Wasserbad bis zum Gebrauch.
  5. Am Ende des 1-stündigen Inkubation (siehe Abschnitt 2.7), absaugen Inokulum off jeder Vertiefung. Langsam 2 ml Overlay an den Rand jeder Vertiefung durch Platzieren der Pipettenspitze gegen die Wand von jeder Vertiefung. Bis zu 5 Platten gleichzeitig ohne Austrocknen Zellen behandelt werden.
  6. Erlauben der Overlay für etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur vor dem Setzen in die aufrechte Platten Gewebekultur-Inkubator verfestigen. Inkubieren Platten für 48 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2.
  7. NachDie Inkubationszeit, Plaketten schwach sichtbar, die mit bloßem Auge sind, so überprüfen ungefärbten Platten auf das Vorhandensein von Plaques. Wenn keine Plaques sichtbar sind, für weitere 4 Stunden inkubieren und erneut prüfen. Allerdings sollte die maximale Inkubationszeit nicht mehr als 72 Stunden.

4. Visualisierung der Plaques durch Neutral Red Staining

  1. Zu jedem 97 ml 1 × PBS (Gewebekultur Grade, Mg 2 + -,; zu Plaques sichtbar zu machen, wird die neutrale rote Färbung Lösung durch Zugabe von 3 ml Neutralrot (Sigma, Katalog # N2889 0,33% w / v in DPBS) hergestellt Ca 2 + - frei; Gibco, Katalog # 10010). Berechnen des Volumens der Neutralrot Färbelösung für das Experiment benötigt: 12 ml Neutralrot Färbelösung werden für jede Platte mit 6 Vertiefungen notwendig. Dann fügen Sie 2 ml in jede Vertiefung. Obwohl einige Plaque Assayprotokolle die Agarose Stecker aus den Vertiefungen entfernt werden müssen, in diesem Protokoll das Neutralrot Färbelösung wird direkt auf der Auflage aufgenommen.
  2. Nach einer Stunde incubation bei 37 ° C, prüfen Sie, ob Plaques sichtbar mit Neutralrot Färbelösung noch im Brunnen. Wenn Plaques sind nicht ohne weiteres ersichtlich, ermöglichen die Färbung für einen anderen hr fortsetzen. Weiter Inkubation bis Plaques sichtbar sind. (Hinweis:. Färbung für mehr als 3 Stunden ist nicht optimal, und wenn keine Plaques in der positiven Kontrollprobe sichtbar sind nach 3 Stunden der Färbung, die Plaque-Assay funktionierte nicht richtig) Nach der Färbung ist komplett absaugen Neutralrot Färbelösung , die Gewährleistung der Agarose Stecker ist nicht gestört, und fahren Sie dann mit Zählen der Plaques.
  3. Graf Plaques, indem Platte umgedreht auf einem Lichtkasten und Kennzeichnung einen Punkt auf gezählt Plaques um doppelte Zählungen zu vermeiden. Wählen Sie die Verdünnung auf Plaques in Brunnen, wo Plaques klar getrennt sind gezählt (dh keine sichtbare Anzeichen von Plaques Zusammenschmelzen). Wenn möglich, zählen Plaques an zwei Verdünnungen. Es ist wichtig anzumerken, dass Plaquegröße kann zwischen MNV Stämmen Virusinokulum variieren und hängt von derZustand der RAW 264,7 Zellen während der Plaque-Assay.
  4. Wenn keine Plaques sichtbar in einem Bohrloch, entweder es keinen Virus in der Probe oder die Menge des Virus war unter der Nachweisgrenze der Plaque-Assay. In diesem Fall die Vertiefungen färben Rot mit einer ähnlichen Farbe wie andere Plaque-enthaltenden Vertiefungen. Alternativ wird die Abwesenheit von Plaques auch beobachtet, wenn es zu viele Viruspartikel in einer gegebenen Verdünnung sind. Dies führt zur Lyse der gesamten Monoschicht und Brunnen erscheinen orange / gelb.
  5. Berechnen Virustiter. Fügen Sie die Anzahl der Plaques sowohl in Vertiefungen in einer einzigen Verdünnung und multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor (dh 1 ml, wenn 2 Brunnen mit 0,5 ml infiziert sind). Das ergibt die Menge der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) in Ihrem Inokulum Volumen von 1 ml. Zum Beispiel, wie in Abbildung 4 auf der 10 -2 Verdünnung, muss man auch (mit "II") 14 Plaques und die anderen auch (mit "V") hat 17 Plaques. Somit wird der Virustiter 14 seinx10 2 + 17x10 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml.

5. Repräsentative Ergebnisse

Infectious MNV-1-Partikel quantifiziert mit einem Plaque-Assay wie schematisch in Abbildung 1 dargestellt werden. 2A zeigt ein Brunnen mit einer Monoschicht von RAW 264,7 Zellen nur vor der Infektion, während 2B zeigt drei sichtbaren Plaques durch römische Zahlen angegeben I, II und III in einem Brunnen. Einzelne Schritte des Assays sind in den Figuren 3A bis F 3A zeigt die Herstellung der 10-fach Verdünnungsreihe einer virushaltigen Probe. 3B zeigt die Übertragung von Verdünnungen auf Wells einer 6-Well-Platte zu duplizieren. Abbildung 3C zeigt die Vorrichtung, die zum Schaukeln RAW 264.7-Zellen mit dem Inokulum bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert 3D zeigt Zellen mit dem SeaPlaque wobei überlagert:. MEMMischung. 3E zeigt eine Platte bei Raumtemperatur, damit das Overlay zu verfestigen, während 3F zeigt Zellen mit einem 0,01% Neutralrot-Lösung 48 h später angefärbt. Nach der Färbung Zellen für 1-3 h und Absaugen der Neutralrot Färbelösung sind Plaques sichtbar und können gezählt werden (Abbildung 4).

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung des MNV Plaque-Assay-Protokoll.

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative Bilder eines Well einer Monoschicht vor der Infektion und nach der Bildung von Plaques. A) RAW 264.7-Zellen wurden über Nacht kultiviert und bebilderten unter einem Lichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. B) Zellen wurden mit einer 0,01% Neutralrot-Lösung nach 48 h angefärbtr der Infektion und visualisiert unter einem Lichtmikroskop bei 4facher Vergrößerung. Römische Zahlen I, II und III zeigen drei sichtbaren Plaques.

Abbildung 3
Abbildung 3. Repräsentative Bilder der verschiedenen Plaqueassay Schritte. A) MNV-1 Inokulum wird in 10-fach-Verdünnungen zubereitet. B) Inokulum wird Zellmonoschichten in zwei Vertiefungen aufgenommen. C) Zellen und Inokulum werden durch Schaukeln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. D) Die Zellen werden mit einem 1:1 Gemisch aus Agarose und 2x SeaPlaque MEM-Medium überschichtet. E) Die Platten werden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, damit die Auflage sich zu verfestigen. F) Die Färbung der Zellen mit dem Neutralrot Färbelösung 48 Stunden nach der Infektion.

Abbildung 4
Abbildung 4. MNV-1 Formen Plaques in Zelle monolayers. Hier dargestellt ist eine repräsentative Plaqueassay Platte 48 h nach der Infektion, ausgesucht Plaques mit Neutralrot Färbelösung nach 1 Stunde Inkubation angefärbt. Die Platte zeigt Doppelbestimmung von drei 10-fache Verdünnungen. Wells mit römischen Zahlen I und IV der 10-1 Verdünnung entsprechen markiert; II und V der 10-2 Verdünnung entsprechen; III und VI des 10-3 Verdünnung entsprechen. Der virale Titer der Probe wird unten (siehe Abschnitt 4.5 für Einzelheiten der Berechnung) angegeben.

Discussion

Die Plaque Assay-Verfahren für MNV-1 dargestellt ist hier ein Weg zur Quantifizierung infektiösen MNV Teilchen. Durch Befolgen der Schritte Assay in 3 dargestellt, kann man erhalten reproduzierbare viralen Titern. Die Nachweisgrenze des Tests hängt von der ausgehend Verdünnung verwendet. Beim Starten mit einer 1:10 Verdünnung der Probe, wie oben beschrieben, ist die Nachweisgrenze des Plaque-Assay 10 pfu (dh 1 Plaque sichtbar am 10 -1-Verdünnung). Da jeder Plaque stellt einen einzigen Virus, kann die Plaque-Assay auch zur klonalen Populationen von MNV durch Abheben isolierte Plaques und Propagieren sie wie zuvor beschrieben 1 zu reinigen. Zusätzlich kann Plaqueaufreinigungen auch verwendet, um eine einzelne Viruspopulation aus gemischten Viruspopulationen abzutrennen. Eine Beschränkung der Verwendung eines Plaque-Assay zum Nachweis von MNV Infektion ist, dass nicht alle Stämme MNV Plaques bilden 4. Jedoch kann es möglich sein, die überwunden inability einiger MNV-Stämme, die von Tieren isoliert, um Plaques durch serielles Passagieren diese Viren in Gewebekultur 7 bilden. Eine Alternative zu dem Plaque-Assay ist, um infektiöse Partikel über die TCID 50-Technik 3, 4 zu messen. Dieser Assay quantifiziert die Menge des Virus benötigt, um CPE in 50% der inokulierten Gewebekulturzellen nach Endpunkt Verdünnungen und dauert 1 Woche für MNV 4 abzuschließen produzieren. Zusätzlich dazu, dass langsamer als ein Plaque-Assay ist die TCID 50-Test auch nicht so empfindlich (Nachweisgrenze = 200 TCID 50 / ml) auf Grund der Toxizität von Gewebeproben zu RAW 264.7 Zellen 4.

Obwohl kritischen Schritte im Protokoll über das Protokoll beschrieben wurden, bietet der folgende Abschnitt eine Zusammenfassung zur Fehlersuche zu erleichtern. Der wichtigste Schritt in der Protokoll stellt sicher, dass RAW 264.7 Zellen lebensfähig bleiben während des Assays zur Virusreplikation unterstützen. Dies kannin jeder Stufe des Assays über Lichtmikroskopie beobachtet werden. Zelllebensfähigkeit wird auf zweierlei Weise gewährleistet. Erstens sollte darauf geachtet werden, nicht zu lassen Zellen austrocknen beim Umgang Platten werden. Somit werden die Platten einzeln inokuliert geschaukelt während der Infektion Periode und zu schließen, wenn sie nicht behandelt werden, bleiben. Zweitens Lösungen auf Zellen gegeben sein sollte äquilibriert ~ 37 ° C. Weiterhin ist es von entscheidender Bedeutung für die Gesundheit der RAW 264.7-Zellen, um sie in Medien, die Serum endotoxinarm (<10 EU / ml), die Aktivierung von Zellen begrenzt zu halten. Darüber hinaus haben wir einen höheren Ausfallrate der Plaque-Assay unter Verwendung von Zellen beobachtet, wenn von dem Durchgang 30 oder höher. Obwohl dies wird wahrscheinlich von Labor zu Labor unterschiedlich ist, ist es wichtig, eine positive Kontrolle gehören (zB eine Probe mit einem bekannten viralen Titer), um reproduzierbare Titer zu gewährleisten, vor allem bei höheren Durchgang RAW 264,7 Zellen. Um die Verwendung von höheren Durchgang Zellen zu begrenzen, ist es ratsam, Fläschchen frühen passa einfrierenge-Zellen nach Erhalt der RAW 264,7 Zellen und starten Sie eine neue Kultur aus den gefrorenen Flaschen häufig. Starting over mit niedrigen Durchgang Zellkulturen wird auch hilfreich sein, wenn die Zellen veränderte Eigenschaften, wie Fehler zu haften, Veränderungen in der Zellmorphologie (zB von Runde zu spindly und ausbreiten), oder wenn Mykoplasmen-Kontaminationen festgestellt wurde ausstellen. Ein weiterer wichtiger Punkt, um die Aufmerksamkeit zu zahlen, ist zu gewährleisten, dass Pipettenspitzen zwischen den Proben und während Verdünnungen geändert werden. Dadurch wird sichergestellt, genaue Verdünnungsreihen und verhindern eine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Derjenige Schritt im Protokoll wo dieselbe Pipettenspitze wieder verwendet werden kann, wenn serielle Verdünnungen der gleichen Probe zu den Vertiefungen zugegeben. In diesem Fall, sollte man von den meisten verdünnten Inokulum für die am wenigsten zu starten, und kräftig und Abpipettieren bei der Ausarbeitung eines neuen Verdünnung.

Die Plaque-Assay-Protokoll ist änderbare mehrere Modifikationen. Eine Änderung, die vorgenommen, wenn t werdenhier sind nicht genügend Zellen zum Impfen Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung ist, lediglich einen einzigen Bohrung für jede Verdünnung zu inokulieren. Da jedoch das Inokulum Volumen 0,5 ml, die Zahl der Plaques muss dann um einen Faktor von 2 bis zu pfu / ml normalisieren multipliziert. Die Plaque-Assay kann auch für den Einsatz mit jedem anderen adhärenten Zelllinie, die die Replikation von MNV unterstützen angepasst werden, und dies hat für die murine Mikroglia BV-2-Zelllinie 8 beschrieben worden. Andere Modifikationen, die implementiert werden können, sind Anpassungen, die für Plaque-Assay-Protokolle für andere Viren entwickelt beschrieben wurden. Im Falle von MNV, haben die folgenden Änderungen bereits erfolgreich umgesetzt; die Verwendung von Methylzellulose statt Sea Plaque Agarose 9 und Färbung der Zellen mit Kristallviolett oder Methylenblau anstelle von Neutralrot 10, 11.

Insgesamt kann dieses Protokoll leicht angepasst je nach Bedarf auf andere Plaque-bildenden Viren zu quantifizieren oder für oth werdener Viren, die lytische Infektionen in RAW 264,7 Zellen verursachen, so dass es ein nützliches Werkzeug, um infektiöse Viruspartikel in der Regel quantifizieren.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Mitglieder der Wobus Labor für kritische Anmerkungen und Anregungen. Die Arbeit im Labor von CEW wurde von Start-up-Fonds von der University of Michigan, eine berufliche Entwicklung Zuschuss von der NIH / NIAID Regional Center of Excellence für die Bio-Verteidigung und Emerging Infectious Diseases Research (RCE) Program, Region V 'Great finanziert Lakes 'RCE (NIH Auszeichnung 1-U54-AI-057153) und NIH R01 AI080611. MBG-H. wurde durch die Experimentelle Immunologie (NIH T32 A1007413-16) und die molekularen Mechanismen in Mikrobielle Pathogenität (NIH T32 A1007528) Ausbildungsstipendien an der University of Michigan finanziert. JBC wurde von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brasilien finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/ High glucose Hyclone SH30243.02
2x MEM Gibco 11935
100x Penicillin and streptomycin Hyclone SV30010
10 mM Non-essential amino acids Hyclone SH30238.01
1M HEPES Hyclone SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine Hyclone SH30034.01
Fetal Bovine Serum Gibco, Hyclone 10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose Lonza 50100
Neutral Red 0.33% Sigma N2889
1x PBS Gibco 10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads BioSpec Products 11079110z
Model 35 Speed Rocker Labnet S2035
Magna Lyser Instrument Roche 03358968001
Raw 264.7 cell line ATCC TIB-71
Tissue culture incubator Sanyo MCO-18AIC

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References

  1. Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
  2. Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis. Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).
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Comments

2 Comments

  1. I am very happy to read your paper   here I have a question about Low Melting Point Agarose (SeaPlaque) Overlay Preparation   DMEM medium was used in RAW²64.7 cell culture and ²*MEM was used in overlay   why   Thank you!

    Reply
    Posted by: Shengnan T.
    April 22, 2013 - 10:52 PM
  2. Hi,
    I'm having a bit of trouble titering my virus. The virus is lysing the cells during the infection process but when I go to do plaque assay I have no plaques. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: Thomas Y.
    August 27, 2013 - 12:06 PM

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