בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gereke, M., Autengruber, A., Gröbe, L., Jeron, A., Bruder, D., Stegemann-Koniszewski, S. Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies. J. Vis. Exp. (70), e4322, doi:10.3791/4322 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במהלך השנים האחרונות, התרומה של תאי שומן מסוג II (אפיתל AECII) להיבטים שונים של רגולציה בחיסון הריאות הוכרה יותר ויותר. AECII הוכח להשתתף בייצור ציטוקינים בנשימה מודלקת ואפילו לפעול כהצגת אנטיגן תאים הוא בזיהום והתפתחות מחל תאי T תיווך 1-8. לכן, הם מעניינים במיוחד גם בהקשרים קליניים כגון-תגובתיות היפר נשימה לזרה ו- אנטיגנים עצמיים, כמו גם זיהומים שבמישרין או בעקיפין למקד AECII. עם זאת, ההבנה של הפונקציות החיסוניות המפורטות מוגשות על ידי תאי האפיתל סוג II במכתשיים הריאה הבריאה כמו גם בדלקת שלנו נשארת חלק. מחקרים רבים בנוגע לתפקוד AECII מתבצעים באמצעות עכבר או שורות תאי אפיתל מכתשיים אדם 9-12. עבודה עם שורות תאים בהחלט מציעה מגוון של הטבות, כגון זמינות של מספר גדול of תאים לניתוחים נרחבים. עם זאת, אנו מאמינים כי השימוש בAECII העכברי העיקרי מאפשר הבנה טובה יותר של התפקיד מסוג זה תא בתהליכים מורכבים כמו זיהום או דלקת אוטואימונית. AECII העכברי הראשי יכולה להיות מבודד באופן ישיר מבעלי חיים סובלים מתנאי נשימה כאלה, כלומר הם היו כפופים לכל הגורמים החיצוניים הנוספים ששחקו תפקיד בהגדרה נתחה. כדוגמה, AECII קיימא יכול להיות מבודד מעכברים נגועים intranasally עם שפעת וירוס, אשר בעיקר מטרות אלו תאים לשכפול 13. חשוב מכך, באמצעות זיהום vivo לשעבר של AECII המבודד מעכברים בריאים, מחקרים של תגובות התאיות רכובות על זיהום יכולים להיות רחוקים יותר מורחבים.

הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי העיקרי מתבסס על עיכול האנזימטית של ריאת העכבר ואחריו התיוג של השעית תא וכתוצאה עם נוגדנים ספציפיים לCD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 וCD16/CD32. AECII הגרעיני לאחר מכן זוהה כאוכלוסיית תא הפיזור ללא תווית וצידה הגבוה (SSC גבוה) ומופרד על ידי תא הפעיל פלואורסצנטי מיון 3.

בהשוואה לשיטות חלופיות של בידוד תאי האפיתל עיקריים מריאות עכבר, הפרוטוקול שלנו לבידוד cytometric זרימת AECII ידי בחירה שלילית פירוש לא נגע, בת קיימא והטהור ביותר AECII בזמן קצר יחסית. בנוסף, ובניגוד לשיטות מקובלות של בידוד על ידי צילום פנורמי ודלדול של לימפוציטים באמצעות קשירה של נוגדן בשילוב חרוזים מגנטיים 14, 15, מיון תא cytometric זרימה מאפשר אפליה באמצעות גודל תא וגרעיניות. בהתחשב בכך שהמכשור למיון תא זרימת cytometric זמין, ההליך המתואר ניתן ליישם בעלויות נמוכות יחסית. הבא לנוגדנים ואנזימים להתפוררות ריאות, ללא ריאגנטים נוספים כגון מגנטי רגיליםחרוזים נדרשים. התאים המבודדים מתאימים למגוון רחב של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים, הכוללים בתרבות מבחנה ומבחני גירוי תאי T, כמו גם transcriptome, Proteome או ניתוחי secretome 3, 4.

Protocol

פרטים בדבר חומרים כימיים וחומרים נדרשים מפורטים בטבלה בסוף הפרוטוקול להלן. לפני תחילת עבודה, להכין 15 צינורות מ"ל (אחת לעכבר) המכילים 4 מ"ל של dispase ומראש חמים להם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בבלוק חימום, זמן קצר לחמם aliquots הקטן של 1-% להמס agarose הנמוך (במים) עד 95 מעלות צלזיוס עד שנוזלים ובהמשך קריר עד 45 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

1. הכנת הריאות המאוסות

  1. להקריב את העכבר על ידי 2 חנק CO. הערה: אין לבצע עקירת צוואר רחם כמו זה יהיה לפגוע בקנה הנשימה, כך שביצוע פעולות של הפרוטוקול, כגון התקנה של הריאות עם נוזל, לא ניתן לבצע בהצלחה. ודא אובדן הרפלקסים nociceptive.
  2. רסס את העכבר עם אתנול ולעשות עוד חתך לאורך קו אמצע הגחון של הגוף. משוך את הפרווה ועור גחון ובהמשך גם לחתוך בזהירות ולהסיר את הצפק.
  3. לגרום לדימום מחודשעכבר על ידי חיתוך ורידי צוואר שמאל וימין (Vena jugularis), כמו גם את עורק הכליה (renalis Arteria). הסר זרימת דם ברקמה.
  4. זהירות לנקב ולאחר מכן להסיר את הסרעפת לחשוף את הלב וריאות על ידי גזירה מהצלעות. קח טיפול מיוחד לא לפגוע ריאות.
  5. עם צינורית 26G ומזרק מ"ל 10 מלא בפוספט הקר נאגר מלוחים (PBS), לנקב החדר הימני של הלב והריאות תנקבנה עם PBS עד חופשי של דם.
  6. לחתוך ולהסיר את בלוטות רוק כדי לחשוף את קנה הנשימה. גם לחתוך בזהירות את השריר המקיף את קנה הנשימה.
  7. הכנס צינורית שכינת 22g לקנה הנשימה, הוצא את המחט ולדחוף קטטר הפלסטיק לכיוון הריאות. תקן את הקטטר על ידי קשירת חתיכה קטנה של חוט סביב קנה נשימה וקטטר.

2. עיכול אנזימתי של רקמת הריאה

אם ירצה, מדגם שטיפת רונכואלוואולרית יכול להיותשהוכן על ידי שטיפת הריאות בעזרת הצנתר בקנה הנשימה עם PBS או בינוני לפני השלב הבא.

  1. שימוש במזרק מ"ל 2, להחדיר בזהירות נפח מקסימאלי של 2 מ"ל של dispase (מ4 aliquot המ"ל) לתוך הריאות דרך הצנתר, כך שכל האונות הם התרחבו באופן מלא. תחליף את המזרק עם מזרק 1 מ"ל מכיל 0.5 מ"ל של הנוזלים agarose וגם להחדיר לתוך הריאות.
  2. השאר את המזרק על קטטר כדי למנוע חזרה זרימה של agarose ולכסות את הריאות עם נייר וקרח רקמות מעבדה באופן מיידי. בואו ג'ל agarose במשך כמה דקות.
  3. הסר את ממחטת נייר, קרח, המזרק וקטטר, לחתוך את קנה הנשימה ובלו הריאות, לב והתימוס מהחזה. לאחר מכן לשטוף את הריאה בצלחת עם PBS ולהסיר את הלב, התימוס וקנה הנשימה שנותר.
  4. שימו את הריאות ל2 מ"ל הנותר של dispase ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות.

3. הכנה של הריאותהשעית תא

  1. הסר את הריאות מdispase ולהעביר אותו לצלחת המכילה 7 מ"ל של anti-CD16/32 נוגדן (מיקרוגרם 1 / ריכוז סופי מ"ל) במדיום DMEM ו100 DNase μl.
  2. באמצעות מלקחיים, מתפורר לחלוטין רקמת הריאה על ידי משייכתו לגזרים ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ואילו בעדינות מתנדנד על כסא נדנדה להגדיר עד 200 סל"ד. אם תרצה, השעית התא לאחר מכן ניתן לאחסן ב 4 ° C עד לשלב הבא.
  3. סנן את השעית התא דרך משתלב ניילון ראשון עם 100 מיקרומטר ולאחר מכן עם 70 מיקרומטר, 48 מיקרומטר ו 30 מיקרומטר נקבוביים. הקפד לשטוף את כל רשת, כמו גם את הצינורות ומנות ביסודיות עם DMEM כדי למזער פגיעה בתאים ולמקסם את התשואה. אם אתה איגום דגימות, זו יכולה להיות מושגת על ידי עובר כאן בהמשך תרחיפי תאים מעכברים של קבוצה אחת דרך אותו המסנן. לחדש את המסנן במקרה של סתימה.
  4. תלוי בכמות, להעביר לתסנין 50 צינורות מ"ל אחד או יותר וסרכזת במשך 15 דקות ב160 XG ו4 ° C. הסר את supernatant.
  5. Resuspend תא הגלול במאגר 2 מ"ל כדורי אדום תמוגה (0.15 4 Cl M NH, 0.01 מ 3 KHCO, 0.1 המ"מ EDTA, 7.2 pH) ולסיים במהירות תמוגה ידי תוספת של 13 מ"ל של מדיום DMEM. להעביר את הפתרון לצינור וצנטריפוגה מ"ל 15 ל 12 דקות ב 160 XG ו4 ° C.

4. כתמי נוגדן למיון תא Cytometric תזרים

  1. Resuspend התאים בקוקטייל 3 מיליליטר נוגדן ראשוני, שהוכן במדיום DMEM בדילולים מתאימים לcytometry זרימה. (נוגדנים היו בעבר עבור טיטרציה דילולי עבודה אופטימליים ע"י השאירו 1 10 6 splenocytes x בנפח של 100 μl. שימוש 3 מ"ל של קוקטייל הנוגדן הראשוני המכיל את הריכוזים האופטימליים עבור כל אחד מהנוגדנים המשמשים לתאים מנקווה עד חמישה עכברים. אם יותר עכברים הם אספו לדגימה אחת, להתאים את עוצמת קול).
  2. לכתמים, דגירת התאים למשך 10 דקות בחושךב 4 ° C.
  3. לשטוף את התאים על ידי מילוי צינור המ"ל 15 עם בינוני וצנטריפוגה DMEM ל12 דקות ב160 XG ו4 ° C.
  4. במקרה הנוגדנים כשהתיר או biotinylated שמשו ב4.1: הסירו את supernatant ו resuspend התאים ב2 - קוקטייל נוגדנים 3 מ"ל משני. כתם עבור 10 דקות ב 4 ° C בחושך.
  5. לשטוף את התאים באמצעות מילוי הצינורית עם DMEM וצנטריפוגה במשך 12 דקות ב160 XG ו4 ° C.
  6. Resuspend התאים ב1 מ"ל של DMEM ומראש דרך המסנן של 50 מיקרומטר סינון לתוך צינור למיון תא. אופציונלי: ספירת התאים כדי להשיג את מספר התא הכולל בהשעית תא הריאות.

5. מיון תא

  1. מערבב את התאים על ידי vortexing לפני המיון. השתמש נחיר מיקרומטר 100 למיון תא של AECII. לחץ נוזל סיכוך ופליטת ליזר ואורכי גל גילוי תלוי במכשיר המשמש למיון תא cytometric זרימה, כמו גם את השימוש בfluorochromes antibody הליך הכתמה.
  2. שער על התאים הגבוהים SSC שהם שליליים לfluorochromes משמש לצביעה וסוג לתוך צינור המכיל DMEM. השתמש קדימה גובה פיזור (FSC-H) לעומת אזור (FSC-) וגובה צידת פיזור (SSC-H) לעומת אזור (SSC-) חלונות כדי לכלול את כל כפילויות או אגרגטים סלולריים (ראה פירוט באסטרטגית gating איור 1).
  3. על מנת לאסוף צנטריפוגה התאים הממוינים ל20 דקות על 280 XG ו4 ° C.
  4. Resuspend התאים בתרבית בינונית או חיץ כנדרש לניתוח שלאחר מכן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעת מיון השעיות תאי ריאה שבודדו מעכברים בריאים, שער AECII יהיה בדרך כלל מהווה כ 42 ± 10% מכל האירועים. אחוז זה יכול להיות ניכר נמוך יותר כאשר עכברים עם תנאי נשימה כגון זיהום ויראלי משמשים, כהשעית תא הראשונית תכיל שיעור גבוה משמעותי של לימפוציטים ותאים אחרים של מערכת חיסון שגויסו לדרך הנשימה. לAECII מבודד מריאות נגועות IAV ביום 3 הזיהום הבא שנצפינו הפחתת התדירות של תאים בשער AECII על ידי בערך 50%.

סוג טיפוסי, כמו גם ניתוח מחדש של התאים הממוינים מתואר בדמויות 1 B ו 1 ג. כפי שצוין, את הטוהר של התאים המבודדים מהווה בערך 92 ± 5%. ב2a דמות, אנו מראים כי ההפרדה המוצלחת של אוכלוסיות תאים טהורות יכולה להיות מאושרת על ידי צביעה לפעילה שטח C-חלבונים, המתבטא באופן בלעדי על ידי16 AECII, 17.

אנו צפינו כי מספר AECII המבודד לחיה אחת מאוד תלוי בעכבר הזן בשימוש. בעוד עכברי BALB / ג בדרך כלל יניבו 1 x 10 6 AECII / עכבר, מתח C57Bl / 6 בלבד התשואות 1-3 x 10 5 AECII / עכבר. מספר העכברים המשמשים לניסוי ולכן תלוי בעכבר הזן, כמו גם הסוג של הניתוחים הבאים שיש לבצע.

לגבי כדאיות של AECII להיאסף, ואנחנו בדרך כלל למצוא שיעורי כדאיות של סביב 90% לאחר מיון תא cytometric זרימה. שיעור גבוה זה של תאי קיימא לאחר מכן מאפשר ניתוח פונקציונלי ישיר, כמו גם תרבות לטווח הקצר של AECII העכברי העיקרי המבודד.

איור 1
איור 1. סקירת over אסטרטגית gating משמשת לבידוד cytometric זרימת AECII העכברי העיקרי של סלקציה שלילית. () סקירה סכמטי על אסטרטגית gating. (ב) חלקות מייצגות של סוג השעית תא ריאות. (ג) תוצאת נציג ניתוח מחדש של התאים הממוינים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. אפיון וניתוח מולקולרי של AECII העכברי העיקרי מיון. () Cytospins של AECII מסודר הוכתמו על שטח חלבון C (SPC). בהשוואה למיקרוסקופיה לעומת שלב, כמעט 100% מתאים נמצאו SPC חיובי. (ב) פרופיל הנציג RNA של AECII העכברי העיקרי מסודר לאחר RNA-בידוד. פסגות ספציפיות ול18S RNA ריבוזומלי -28 יחד עם גורם רין המחושב מייצגות RNA ntegrity ואיכותי לרנ"א מבודד ללא פגע מAECII.

איור 3
איור 3. ניתוח של וירוס nucleoprotein ביטוי (NP) בAECII העכברי העיקרי מבודד מעכברים נגועים השפעת. C57Bl / 6 עכברים מנוהלים intranasally פוספט נאגר מלוח או שפעת וירוס PR8/A/34 בימים 1, 2 או 3 לפני בידוד AECII . () חלקות יציגות של השעיות תאי ריאה מאינה נגוע, כמו גם מוכתם שלושה ימים נגועים C57Bl / 6 עכבר למיון. (ב) שפעת ביטוי NP וירוס בAECII מסודר נותחה באמצעות צביעה תאית עם נוגדן NP-ספציפי ולאחר מכן ניתוח הזרימה cytometric. (ג) הלוח עולה עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של הכתמת NP.

s "> איור 4
איור 4. ניתוח של שפעת nucleoprotein וירוס (NP) ביטוי בvivo לשעבר הנגועים AECII העכברי העיקרי. () ניתוח תזרים-cytometric נציג vivo לשעבר שפעת PR8/A/34 AECII נגוע בוירוס על ידי צביעה תאית לשפעת וירוס 6 NP שעות לפרסם זיהום. (ב) סיכום של תוצאות מייצגות מן NP-מכתים של vivo לשעבר שפעת נגועה בוירוס זיהום הודעה AECII 6 שעות עם דילולי וירוסים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי על ידי הזרימה cytometry מציע דרך מהירה לגישה לתאים ראשוניים מריאת העכבר למגוון שלם של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים. ההליך המתואר תשואות אוכלוסיות קיימא והטהורות ביותר של AECII כי הם די במספר ניתוחים שלאחר מכן ישירות, כגון בידוד RNA (ראה דמות 2b) ומחקרי transcriptome. ליישומים פונקציונליים, אפשר גם לתרבות התאים המבודדים, המאפשר לדוגמה את הדור של מדיום מותנה AECII או ניסויי שיתוף תרבות. כהטבה במיוחד ללימודים פונקציונליים אלה, הבידוד של תאים ראשוניים על ידי סלקציה שלילית כפי שמתואר כאן מניב תאי תוליים בם לא הייתי כפוף לנוגדן מחייב. עם זאת, למרות היתרונות של לימודים בAECII העיקרי על אלו שבוצעו בתאי קווים, יש מגבלות מעשיות לשימוש בתאים הראשוניים אלה. לצד המגבלה בכמות מספרים, אשר לא יכול לענות על הדרישות של מחקרים הדורשים הקרנה נרחבת, AECII העיקרי לשרוד בתרבות רק לזמן מוגבל שיש לנו כדי שנצפה ממוצע סביב 48 שעות. בניסויי התרבות קצר טווח אלה, יש לנו בסיס הבחירה של מדיום התרבות על הטבע של המבחנים עוקבים מדיום המותנה AECII שמש ובהשיגו תוצאות משביעות רצון עם IMDM (IMDM Glutamax, Gibco חתול. מס '31980) בתוספת 10% FCS, אנטיביוטיקה סטנדרטית ו0.25 מ"מ β-mercaptoethanol.

הפרוטוקול המתואר כאן מציג דרך יחסית קלה ומהירה של בידוד הקיימא וAECII העכברי הראשוני טהור במספרים טובים. הטוהר של התאים הניבו אחרי פרידה ביקורתית תלוי בהליך של מיון תא. כתמים בהירים וחזקים של אוכלוסיות התאים שאמורות להיות כלולים באותה מידה חשובה כgating מחמיר על אירועי SSC הגבוהים, כך שזיהומים עם תאי הלימפה כסוג טובאני תאי אפיתל הוא מזערי. לגבי התשואה של תאים מופרדים, יש לנו ציינו כי זה מוגדל על ידי שטיפה נרחבת של צינורות, meshes סינון וצלחות במהלך תקופת ההכנה של השעית התא הגולמית כמו גם על ידי התפרקות מוחלטת של הרקמה בעקבות עיכול אנזימטי. יתרון עיקרי בעבודה עם אחד מAECII העיקרי הוא שהם יכולים להיות מבודדים באופן ישיר ממארחים הסובלים ממחלות של דרך הנשימה. AECII כזה נחשף לכל הגורמים המצויים בסביבת מייקרו הטבעי שלהם ולכן גם משקפים את המצב בגוף חי. בניגוד לאדם AECII 18, 19, זה יכול להיות מורחב למגוון רחב של מערכות ניסיוניות בעת עבודה במודלים עכבריים. אנחנו כבר מנצלים את זה במחקרים לגבי דלקת אוטואימונית כמו גם זיהום נגיפי של הריאה. וכך מצאנו AECII שמעכברים הסובלים מסוג CD4 + T תא מתווך דלקת בדרכי נשימה לבטא מגוון רחב של inflammatגני אורים אשר ממחיש את הפוטנציאל שלהם לויסות תגובות חיסוניות ריאות 3. יתר על כן, אנחנו יכולים להראות שתצוגת AECII עצמי אנטיגנים דרך מולקולות גדולות מורכבות histocompatibility כיתה-II אשר תוצאות ההפעלה הפונקציונלית של רכב מסוג CD4 + תאי T מגיב. בו בזמן לשמור על סובלנות AECII ריאות על ידי גורמי מפרישים מקדמים גיוס של Foxp3 + תאי T רגולטוריים 4.

לגבי זיהום ויראלי של הריאות, יש לנו בהצלחה מבודדת AECII העיקרי מעכברים נגועים בשפעת וירוס. כאמור, כאן חשבון AECII לשיעור נמוך יותר של השעית תא הריאה כולה, כמספרי ניכר של תאים חיסוניים מגויסים לריאות בתגובה לזיהום (ראה 3a דמות). מכתימים תאית של שפעת nucleoprotein וירוס (NP) בתוך התאים המבודדים תערוכות ביטוי גובר של החלבון הנגיפי במהלך הזמן כפי שמוצג ב > דמויות גרם 3b ו3c. AECII אלה, מופעל על ידי וירוס in vivo, להציג כלי רב ערך למחקרים בתחום פנוטיפ המולקולרי והפונקציונלי של האפיתל הנשימה במהלך זיהום ויראלי בדרכי נשימה, כמו גם במהלך ההתאוששות. עם זאת, כפי AECII הם היעד העיקרי של שפעת וירוס ויש הרס ניכר של רירית אפיתל, שיעור התאים הניב מעכברים נגועים יורד במשך קורס ועם חומרת הזיהום. כמו כן, כווירוס משכפל שוב ושוב ומדביק תאים חדשים, AECII המבודד לא היה כפוף לזיהום בנקודה אחת בזמן מוגדר. לכן, מחקרים אלה באופן אידיאלי כהשלמת ניסויים באמצעות vivo לשעבר נגועים AECII העכברי העיקרי מעכברים בריאים שבו זיהום מסונכרן טוב יותר ואשר, כפי שהוערך על ידי צביעת NP נגיפית תאית אפשר לראות בתרשימי 4 א ו -4 ב, יכולה להניב שיעורים גבוהים יותר של זיהום בהתאם מינון נגיפי בשימוש.

jove_content "> יחדיו, הסלקציה שלילית cytometric זרימה כפי שמתוארת כאן מציגה דרך מהירה של בידוד AECII העכברי ראשוני טהור ובת קיימא. תאים אלו מתאימים למגוון רחב של ניתוחים והם כלי חשוב להרחבת הידע של תפקיד AECII בויסות מערכת חיסונית בדרכי הנשימה בגוף החייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

ברצוננו להודות למ Hoxter לקבלת סיוע טכני במיון AECII העכברי העיקרי בין 2 דגימות רמת biosafety.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר הגרמניה (DFG) לDB (SFB587, TP-B12 וBR2221/1-1) ומלגה מבית הספר למחקר ביו הנובר (DFG GSC 108) לרמה של AA. DB נתמך על ידי היוזמה של הנשיא וקרן רשת של הלמהולץ איגוד מרכזי מחקר הגרמני (HGF) תחת W2/W3-029 מספר החוזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
indwelling cannula Introcan 22G Braun REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) BD Biosciences 354235 aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose Biozym 840101 1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial Sigma-Aldrich D4263 freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM Gibco 22320-022 used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm) BD Falcon 352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm) Bückmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter PARTEC 04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32 BioLegend 101302 clone 93; purified
anti-mouse F4/80 BioLegend 123116 clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b BioLegend 101208 clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c BioLegend 117310 clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45 BioLegend 103102 clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19 eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG BD Pharmingen 550767 polyclonal, PE coupled

Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
  2. Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
  3. Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
  4. Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
  5. Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
  6. Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
  7. Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
  8. Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
  9. Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
  10. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
  11. Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
  12. Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
  13. Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
  14. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
  15. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
  16. Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
  17. Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
  18. Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
  19. Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics