Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Immunology and Infection

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Summary

Se describe el aislamiento rápido de células primarias de murino de tipo II alveolares epiteliales (AECII) por citometría de flujo negativo de selección. Estos AECII mostrar una alta viabilidad y pureza, y son adecuados para una amplia gama de estudios funcionales y molecular respecto a su función en condiciones respiratorias tales como enfermedades autoinmunes o infecciosas.

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Gereke, M., Autengruber, A., Gröbe, L., Jeron, A., Bruder, D., Stegemann-Koniszewski, S. Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies. J. Vis. Exp. (70), e4322, doi:10.3791/4322 (2012).

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Abstract

A lo largo de los últimos años, la contribución de las células alveolares de tipo II epiteliales (AECII) a diversos aspectos de la regulación inmune en el pulmón se ha reconocido cada vez más. AECII se han mostrado participar en la producción de citoquinas en las vías respiratorias inflamadas y actuar incluso como células presentadoras de antígeno tanto en la infección de células T y la autoinmunidad mediada por 1-8. Por lo tanto, son especialmente interesantes también en contextos clínicos como la hiper-reactividad de las vías respiratorias al exterior y de auto-antígenos, así como infecciones que directa o indirectamente se dirigen AECII. Sin embargo, nuestra comprensión de las funciones inmunológicas detalladas servidos por células alveolares de tipo II epiteliales en el pulmón sano, así como en la inflamación sigue siendo fragmentaria. Muchos estudios sobre la función AECII se realizan a través del ratón o humano líneas de células epiteliales alveolares 9-12. Trabajo con líneas de células sin duda ofrece una serie de beneficios, tales como la disponibilidad de un gran número of células para análisis extensos. Sin embargo, creemos que el uso de AECII murino primaria permite una mejor comprensión de la función de este tipo de células en procesos complejos tales como la infección o inflamación autoinmune. AECII murino primaria se pueden aislar directamente a partir de animales que sufren de tales condiciones respiratorias, lo que significa que han sido objeto de todos los factores extrínsecos adicionales que juegan un papel en el ajuste analizado. Como ejemplo, AECII viable puede ser aislado de ratones por vía intranasal infectadas con virus de influenza A, que se dirige principalmente a estas células para la replicación 13. Es importante destacar que, a través de la infección ex vivo de AECII aislado de ratones sanos, los estudios de las respuestas celulares montados sobre la infección puede ser extendido.

El protocolo para el aislamiento de AECII murino primario se basa en la digestión enzimática del pulmón de ratón seguido de etiquetado de la suspensión celular resultante con anticuerpos específicos para CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 y CD16/CD32. AECII granulares se identifica entonces como la dispersión de alta sin marcar y lateral (SSC alta) población de células y son separadas por fluorescencia de células activadas por la clasificación 3.

En comparación con otros métodos de aislamiento de células epiteliales primarias de los pulmones del ratón, nuestro protocolo de aislamiento de citometría de flujo de AECII por selección negativa produce intacta, altamente viable y puro AECII en tiempo relativamente corto. Además, y en contraste con los métodos convencionales de aislamiento por lavado en batea y el agotamiento de los linfocitos a través de la unión del anticuerpo acoplado-perlas magnéticas 14, 15, de citometría de flujo de clasificación de células permite la discriminación por medio de tamaño de celda y granularidad. Dado que la instrumentación para la clasificación de células por citometría de flujo está disponible, el procedimiento descrito se puede aplicar a costes relativamente bajos. Al lado de anticuerpos estándar y enzimas para la desintegración, pulmón, ausencia de reactivos adicionales tales como magnéticaperlas se requiere. Las células aisladas son adecuadas para una amplia gama de estudios funcionales y moleculares, que incluyen el cultivo in vitro de células T y ensayos de estimulación, así como transcriptoma, proteoma o análisis de secretoma 3, 4.

Protocol

Los detalles relativos a los reactivos y materiales necesarios se enumeran en la tabla al final del protocolo a continuación. Antes de empezar el trabajo, preparar tubos de 15 ml (una por ratón) que contienen 4 ml de dispasa y pre-calentamiento a 37 ° C en un baño de agua. En un bloque de calentamiento, poco calentar pequeñas alícuotas de bajo punto de fusión al 1% de agarosa (en agua) a 95 ° C hasta que la miel y, posteriormente, enfriar a 45 ° C hasta su uso.

1. Preparación del pulmón de ratón

  1. Sacrificar el ratón por asfixia de CO 2. Nota: No realice dislocación cervical, ya que esto lesionar la tráquea de modo que siguiendo los pasos del protocolo, como la instalación de los pulmones con líquido, no se puede realizar con éxito. Asegúrese de que la pérdida de los reflejos nociceptivos.
  2. Pulverizar el ratón con etanol y hacer un corte largo a lo largo de la línea media ventral del cuerpo. Tire de la piel y la piel ventral y posteriormente también cuidadosamente cortar y quitar el peritoneo.
  3. Exsanguinate laratón cortando la vena yugular izquierda y la derecha (Vena yugular), así como la arteria renal (renalis Arteria). Quite la sangre que fluye con el tejido.
  4. Con cuidado, punción y retire el diafragma para exponer el corazón y los pulmones cortando las costillas. Tenga especial cuidado de no lesionar el pulmón.
  5. Con una cánula 26G y una jeringa de 10 ml llena con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS), la punción del ventrículo derecho del corazón y perfundir el pulmón con PBS hasta que esté libre de sangre.
  6. Corte y retire las glándulas salivales para exponer la tráquea. También con cuidado corte el músculo que rodea la tráquea.
  7. Insertar una cánula permanente 22G en la tráquea, retirar la aguja y empujar el catéter de plástico hacia el pulmón. Fijar el catéter mediante la vinculación de una pequeña pieza de lana alrededor de la tráquea y el catéter.

2. La digestión enzimática del tejido pulmonar

Si se desea, una muestra de líquido de lavado broncoalveolar puede serpreparado por el lavado de los pulmones a través del catéter insertado en la tráquea con PBS o medio antes de la siguiente etapa.

  1. Usando una jeringa de 2 ml, cuidadosamente infundir un volumen máximo de 2 ml de dispasa (de la alícuota ml 4) en el pulmón a través del catéter de modo que todos los lóbulos están totalmente expandido. Intercambiar la jeringa con una jeringa de 1 ml que contiene 0,5 ml de la agarosa licuada y también infundir en el pulmón.
  2. Deje la jeringa en el catéter para evitar el flujo de retorno de la agarosa y cubrir inmediatamente el pulmón con papel de laboratorio del tejido y hielo. Deje que el gel de agarosa durante un par de minutos.
  3. Quitar el papel de seda, hielo, jeringas y catéteres, cortar la tráquea y escindir el pulmón, corazón y timo del pecho. Luego enjuague el pulmón en un plato con PBS y quitar el corazón, el timo y la tráquea restante.
  4. Ponga el pulmón hacia el restante 2 ml de dispasa y se incuba a temperatura ambiente durante 45 min.

3. Preparación del pulmónSuspensión celular

  1. Retire el pulmón de la dispasa y la transfiere en un plato que contiene 7 ml de anticuerpo anti-CD16/32 (1 mg / ml concentración final) en medio DMEM y 100 l DNasa.
  2. Utilizando fórceps, se desintegran completamente el tejido pulmonar tirando de él aparte y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente mientras agitando suavemente en un agitador ajustado a 200 rpm. Si se desea, la suspensión de células se pueden almacenar a 4 º C hasta el siguiente paso.
  3. Se filtra la suspensión celular a través de mallas de nylon primero con 100 micras y 70 micras, posteriormente con 48 micras y 30 micras poros. Tomar cuidado de enjuagar cada malla, así como los tubos y las placas concienzudamente con DMEM para minimizar la pérdida de células y maximizar el rendimiento. Si está puesta en común de muestras, esto se puede lograr aquí pasando posteriormente por suspensiones de células de ratones de un grupo a través del mismo filtro. Cambiar el filtro en caso de obstrucción.
  4. Dependiendo del volumen, transferir el filtrado a uno o más tubos de 50 ml ycentrifugar durante 15 min a 160 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
  5. Resuspender el pellet de células en 2 ml de tampón de lisis de eritrocitos (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M de KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) y terminar rápidamente la lisis por adición de 13 ml de medio DMEM. Transferir la solución a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 12 min a 160 xg y 4 ° C.

4. Antibody tinción para citometría de flujo en células de clasificación

  1. Resuspender las células en 3 ml de cóctel de anticuerpos primaria, preparado en medio DMEM en diluciones adecuadas para la citometría de flujo. (Los anticuerpos fueron ajustado previamente para diluciones de trabajo óptimas mediante la tinción de 1 x 10 6 esplenocitos en un volumen de 100 l. Uso 3 ml del cóctel de anticuerpo primario que contiene las concentraciones óptimas para cada uno de los anticuerpos utilizados para células agrupadas de hasta cinco ratones. Si más ratones se agruparon para una muestra, ajustar el volumen).
  2. Para la tinción, incubar las células durante 10 min en la oscuridada 4 ° C.
  3. Se lavan las células por el tubo de llenado 15 ml con medio DMEM y centrifugación durante 12 min a 160 xg y 4 º C.
  4. En el caso de anticuerpos biotinilados o no acoplados se utilizaron en 4,1: Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 2 a 3 ml de cóctel de anticuerpo secundario. Teñir durante 10 min a 4 ° C en la oscuridad.
  5. Se lavan las células a través de rellenar el tubo con DMEM y centrifugación durante 12 min a 160 xg y 4 ° C.
  6. Resuspender las células en 1 ml de DMEM y pre-filtro a través de un filtro de 50 micras en un tubo para la clasificación de células. Opcional: Contar las células para obtener el número total de células en la suspensión de células de pulmón.

5. De clasificación de células

  1. Mezclar las células mediante agitación en vórtex antes de la clasificación. Use una boquilla de 100 micras para la célula de clasificación de AECII. La presión de fluido de funda, así como de emisión láser y longitudes de onda de detección dependen del instrumento utilizado para la citometría de flujo de clasificación de células, así como los fluorocromos utilizados en la antibody procedimiento de tinción.
  2. Puerta en las células SSC altos que son negativos para los fluorocromos utilizados para la tinción y ordenar en un tubo que contiene DMEM. Utilice altura dispersión hacia adelante (FSC-H) vs área (FSC-A) y la altura de dispersión lateral (SSC-H) vs área (SSC-A) de Windows para excluir los dobletes o agregados celulares (ver detalles de la estrategia de puerta en Figura 1 a).
  3. Con el fin de recoger la centrífuga ordenados células durante 20 min a 280 xg y 4 º C.
  4. Resuspender las células en medio de cultivo o tampón como se requiere para su posterior análisis.

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Representative Results

Al ordenar suspensiones celulares pulmonares aislados de los ratones sanos, la puerta AECII típicamente representan alrededor del 42 ± 10% de todos los eventos. Este porcentaje puede ser notablemente inferior cuando los ratones con enfermedades respiratorias tales como una infección viral se utilizan, como la suspensión de células inicial contendrá una proporción mucho mayor de los linfocitos y otras células inmunitarias reclutados para las vías respiratorias. Para AECII aisladas de los pulmones IAV infectados en el día 3 después de la infección se ha observado una reducción de la frecuencia de células en la puerta AECII por aproximadamente 50%.

Una especie típica, así como re-análisis de las células clasificadas se representa en las figuras 1b y 1c. Como se ha indicado, la pureza de las células aisladas representa aproximadamente el 92 ± 5%. En la figura 2a, se muestra que la separación exitosa de poblaciones de células puras puede ser confirmada por la tinción de proteínas de surfactante C, la cual se expresa exclusivamente porAECII 16, 17.

Hemos observado que el número de AECII aislado por cada animal depende fuertemente de la cepa de ratón utilizada. Considerando ratones BALB / c generalmente producen 1 x 10 6 AECII / ratón, la cepa C57BL / 6 sólo cede 1 a 3 x 10 5 AECII / ratón. El número de ratones utilizados por experimento por lo tanto, depende de la cepa de ratón, así como el tipo de análisis posteriores a realizar.

En cuanto a la viabilidad de la AECII recuperada, solemos encontrar las tasas de rentabilidad de alrededor del 90% después de citometría de flujo de células de clasificación. Esta alta proporción de células viables después permite directos análisis funcionales, así como a corto plazo la cultura de los aislados AECII murino primaria.

Figura 1
Figura 1. Visión general over la estrategia gating utilizado para el aislamiento de citometría de flujo de AECII murino primaria por selección negativa. (A) Presentación esquemática sobre la estrategia de activación periódica. (B) representa una especie de representación de pulmón suspensión celular. (C) Resultado Representante de un nuevo análisis de las células clasificadas. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2
Figura 2. Caracterización y análisis molecular de ordenados AECII murino primaria. (A) Cytospins de AECII según se tiñeron para la proteína surfactante C (SPC). En comparación con la microscopía de contraste de fase, casi el 100% de las células resultaron ser SPC positivo. (B) Representante de ARN perfil ordenados AECII primaria murino después de ARN aislamiento. Picos específicos para 18S y 28S ribosomal RNA, junto con la cantidad, calculada factor de RIN representan ARN I ntegridad y de calidad para intactas de ARN aislado de AECII.

Figura 3
Figura 3. Análisis de la influenza A virus nucleoproteína (NP) de expresión en AECII primaria murino aislado de ratones infectados. C57Bl / 6 ratones se les administró por vía intranasal solución salina tamponada con fosfato o influenza A virus PR8/A/34 los días 1, 2 o 3 antes del aislamiento AECII . (A) parcelas representativos de suspensiones de células de pulmón de una persona no infectada, así como de tres días teñidas infectada ratón C57BL / 6 para la clasificación. (B) Influenza A virus expresión NP en AECII según se analizó mediante tinción intracelular con un anticuerpo específico de NP y el posterior análisis de citometría de flujo. (C) La tabla muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la tinción de NP.

s "> Figura 4
Figura 4. Análisis de la influenza A virus nucleoproteína (NP) de expresión en infectados ex vivo primaria murino AECII. (A) Representante de citometría de flujo análisis ex vivo de la influenza A virus PR8/A/34 AECII infectado por tinción intracelular para el virus de la gripe A NP 6 horas después de la infección. (B) Resumen de los resultados representativos de NP-tinción ex vivo de la influenza A virus infectó AECII 6 h después de la infección con diluciones de virus diferentes.

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Discussion

El protocolo para el aislamiento de murino AECII por citometría de flujo ofrece una forma rápida de acceder a las células primarias del pulmón de ratón para toda una serie de estudios funcionales y moleculares. El procedimiento descrito se obtiene poblaciones altamente viables y puro de AECII que son suficientes en número para directos análisis posteriores, tales como el aislamiento de ARN (ver figura 2b) y transcriptome estudios. Para aplicaciones funcionales, también es posible cultivar las células aisladas, por ejemplo, permitiendo la generación de medio de AECII acondicionado o experimentos de co-cultivo. Como una ventaja especialmente para estos estudios funcionales, el aislamiento de células primarias por selección negativa como se ha descrito aquí produce células intactas que no han sido sometidas a la unión del anticuerpo. Sin embargo, a pesar de las ventajas de los estudios en AECII primaria sobre las que se realizan en líneas celulares, hay limitaciones prácticas en el uso de estas células primarias. Junto a la mera limitación en números, Que puede no cumplir los requisitos de los estudios que requieren una amplia clasificación, principal AECII sobrevivir en cultivo solamente por un tiempo limitado que se ha observado un promedio de alrededor de 48 hr. En estos experimentos de cultivo a corto plazo, se ha basado la elección del medio de cultivo sobre la naturaleza de los ensayos posteriores se utilizó el medio acondicionado en AECII y han logrado resultados satisfactorios con IMDM (IMDM Glutamax, Gibco, núm. N º 31980) suplementado con 10% de FCS, antibióticos estándar y 0,25 mM β-mercaptoetanol.

El protocolo aquí descrito muestra una manera relativamente fácil y rápido de aislar viable y puro AECII primaria murino en buen número. La pureza de las células produjo, después de la separación depende críticamente del procedimiento de clasificación de células. Una tinción clara y fuerte de las poblaciones de células que van a ser excluidos es tan importante como gating estrictos sobre los acontecimientos SSC altas, de modo que la contaminación con células linfoides como el tipo asíMe células epiteliales se reducen al mínimo. En cuanto a la producción de células separadas, hemos observado que este se maximiza mediante lavado extensivo de tubos, mallas de filtro y las placas durante la preparación de la suspensión celular en bruto, así como por la desintegración completa del tejido después de la digestión enzimática. Una ventaja principal de trabajar con primaria AECII es que pueden aislarse directamente de hosts que sufren de enfermedades del tracto respiratorio. AECII tal habrá sido expuesto a todos los factores presentes en su entorno natural, micro-y por lo tanto bien reflejar la situación in vivo. A diferencia de los humanos AECII 18, 19, esta se puede extender a una amplia variedad de sistemas experimentales cuando se trabaja en modelos murinos. Hemos estado tomando ventaja de esto en los estudios sobre la inflamación autoinmune así como la infección viral del pulmón. De esta manera se encontró que AECII a partir de ratones que sufren de CD4 + células T mediada por la inflamación respiratoria expresar una amplia gama de inflammatgenes ory lo que demuestra su potencial para la regulación de las respuestas inmunes de pulmón 3. Por otra parte, hemos podido demostrar que la exhibición AECII antígenos propios a través de complejo mayor de histocompatibilidad clase II moléculas que se traduce en la activación funcional de las células CD4 + de automóviles células T reactivas. Al mismo tiempo AECII mantener la tolerancia de pulmón por secretar factores que promueven la inducción de Foxp3 + células T reguladoras 4.

En cuanto a la infección viral del pulmón, hemos aislado con éxito AECII primaria de ratones infectados con influenza A virus. Como se mencionó anteriormente, aquí cuenta AECII para una proporción menor de la suspensión de pulmón de células enteras, como un número considerable de células inmunes son reclutados a los pulmones en respuesta a la infección (ver figura 3a). Tinción intracelular de la influenza A virus nucleoproteína (NP) dentro de las células aisladas muestra aumento de la expresión de la proteína viral en el transcurso del tiempo como se muestra en la g> figuras 3b y 3c. Estos AECII, provocada por el virus in vivo, muestra una herramienta valiosa para los estudios sobre el fenotipo molecular y funcional de las vías respiratorias epitelio durante la infección viral respiratoria, así como durante la recuperación. Sin embargo, como AECII son el objetivo principal de la influenza A virus y se produce la destrucción sustancial de la capa epitelial, la tasa de células obtenidas a partir de ratones infectados disminuye a lo largo del curso y con la gravedad de la infección. También, como el virus se replica repetidamente e infecta las células nuevas, el aislado AECII no han sido sometidas a la infección en un solo punto definido en el tiempo. Por lo tanto, estos estudios están perfectamente complementado mediante experimentos con infectados ex vivo AECII murino primaria de ratones sanos donde la infección está mejor sincronizados y que, según se evaluó por tinción intracelular NP viral se muestra en las figuras 4a y 4b, pueden producir altas tasas de infección en función de la dosis viral usado.

jove_content "> Tomados en conjunto, de citometría de flujo de selección negativa tal como se describe aquí se muestra una forma rápida de aislar puro y viable AECII murino primaria. Estas células son adecuadas para una amplia gama de análisis y son una herramienta valiosa para ampliar nuestros conocimientos de la función de AECII en la regulación inmune en el tracto respiratorio en vivo.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a M. Höxter para la asistencia técnica en la clasificación AECII murino primaria de bioseguridad de nivel 2 muestras.

Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a DB (SFB587, B12 y BR2221/1-1 TP) y una beca de la Escuela de Investigación Biomédica de Hannover (DFG GSC 108) a AA. DB con el apoyo de la Iniciativa del Presidente y del Fondo de Redes de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación alemán (HGF), bajo contrato W2/W3-029 número.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
indwelling cannula Introcan 22G Braun REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) BD Biosciences 354235 aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose Biozym 840101 1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial Sigma-Aldrich D4263 freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM Gibco 22320-022 used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm) BD Falcon 352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm) Bückmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter PARTEC 04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32 BioLegend 101302 clone 93; purified
anti-mouse F4/80 BioLegend 123116 clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b BioLegend 101208 clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c BioLegend 117310 clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45 BioLegend 103102 clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19 eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG BD Pharmingen 550767 polyclonal, PE coupled

Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.

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