Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gereke, M., Autengruber, A., Gröbe, L., Jeron, A., Bruder, D., Stegemann-Koniszewski, S. Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies. J. Vis. Exp. (70), e4322, doi:10.3791/4322 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Geçen yıllar boyunca, akciğer immün regülasyon çeşitli yönleriyle alveolar tip II epitel hücreleri (AECII) katkısı giderek kabul edilmiştir. AECII iltihaplı hava yollarında sitokin üretimini katılmak ve enfeksiyon ve T-hücre aracılı otoimmünite 1-8 hem de hücreler antijen sunan bile hareket etmek gösterilmiştir. Bu nedenle, bu tür hava yolu hiper reaktivitesi gibi klinik bağlamlarda da özellikle ilginç yabancı ve hem de self-antijenlere doğrudan veya dolaylı AECII hedef enfeksiyonlar. Bununla birlikte, sağlıklı akciğer yanı sıra enflamasyon alveolar tip II epitel hücreleri tarafından sunulan ayrıntılı immünolojik işlevlerini anlaşılmasında düzensizdir. AECII fonksiyonu ile ilgili birçok çalışma 9-12 fare, veya insan alveoler epitel hücre hatları kullanılarak yapılmaktadır. Hücre hatları ile çalışmak kesinlikle böyle büyük sayılar durumu o gibi, faydaları sunarkapsamlı analizler için f hücreler. Bununla birlikte, birincil murin AECII kullanımı ile enfeksiyon ya da otoimmün iltihabı gibi karmaşık işlemler olarak bu hücre tipinin rolü daha iyi anlaşılmasını sağlar inanıyoruz. Primer mürin AECII bunlar analiz ortamında bir rol oynayan ek dış faktörler işlemine tabi tutulmuştur, yani bu gibi solunum durumları olan hayvanlardan doğrudan izole edilebilir. Bir örnek olarak, uygun intranazal AECII öncelikle çoğaltma 13 için bu hücreler hedef grip A virüsü ile enfekte olan fareler izole edilebilir. Önemlisi, sağlıklı farelerin izole AECII ex vivo enfeksiyon yoluyla, enfeksiyon üzerine monte hücresel cevaplarının çalışmalar daha uzun olabilir.

Birincil mürin AECII ve izolasyon için protokol, CD11c, CD11b, F4/80 için spesifik antikorlar ile elde edilen hücre süspansiyonu etiketleme ardından fare akciğer enzimatik sindirim dayanmaktadırCD19, CD45 ve CD16/CD32. Granül AECII sonra yüksek etiketsiz ve yan dağılım (SSC yüksek) hücre popülasyonu olarak belirlenmiş ve 3 sıralama floresan aktive hücre ile ayrılır.

Fare akciğerlerinden primer epitelyal hücreler izole alternatif yöntemler karşılaştırıldığında, negatif seçimin AECII akım sitometri izolasyonu için bizim protokol nispeten kısa bir süre içinde dokunulmaz, son derece canlı ve saf AECII verir. Buna ek olarak, ve kaydırma ve lenfosit azalması ile izolasyon geleneksel yöntemlerin aksine, antikor-coupled manyetik boncuklar 14, 15 bağlayıcı aracılığı ile, akış sitometrik hücre-hücre boyut ayırma ve ayrıntı ile ayırt etme izin verir. Akım sitometrik hücre sıralama için enstrümantasyon kullanılabilir olduğunu göz önüne alındığında, açıklanan prosedür nispeten düşük maliyetle uygulanabilir. Standart antikor ve akciğer dağılma için enzimler, manyetik olarak herhangi bir reaktif madde yanındaboncuklar gereklidir. İzole hücrelerinin in vitro kültürü ve T-hücre uyarma deneylerinde de transcriptome, proteom veya secretome analizi 3, 4, olarak dahil işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Protocol

Gerekli reaktifleri ve materyalleri ilişkin ayrıntıları aşağıda protokolünün sonunda tabloda listelenmiştir. Çalışmaya başlamadan önce, 4 dispase ml ve ° C su banyosunda 37 öncesi ılık bunları içeren 15 ml tüpler (fare başına bir) hazırlamak. Bir ısıtma bloğu, kısaca 95-1% düşük erime agaroz (su) küçük alikotları ısıtmak ° C sıvılaştırılmış kadar ve kullanıma kadar 45 ° C ye sonradan serin.

1. Fare Akciğer hazırlanması

  1. CO 2 boğulma tarafından fare Kurban. Not: başarıyla yapılamaz, böyle bir sıvı ile akciğer kurulum gibi, protokol adımları izleyerek, böylece bu trakea yaralama gibi servikal dislokasyon yapmayın. Nosiseptif reflekslerinin kaybı olun.
  2. Etanol ile fare Sprey ve vücut ventral orta hat boyunca uzun bir kesim yapmak. Ventral kürk ve deri çekin ve daha sonra da dikkatlice kesilmiş ve periton çıkarın.
  3. ExsanguinateSağ ve sol juguler ven (laktasyonun) yanı sıra renal arter (Arteria renalis) keserek fare. Doku ile akan kan çıkarın.
  4. Dikkatlice sonra delinme ve kaburga keserek kalp ve akciğer maruz sökmek. Akciğer kesmemeye özel dikkat gösterin.
  5. Soğuk fosfat dolu bir 26G kanül ve 10 ml şırınga ile salin (PBS), ponksiyon kalbin sağ ventrikül tamponlu ve kan serbest kadar PBS ile akciğer serpmek.
  6. Trakea maruz tükürük bezlerinin kesin ve çıkarın. Ayrıca dikkatle trakea çevreleyen kas kesti.
  7. Trakea içine 22G kanüllerin yerleştirin, iğneyi çıkarın ve akciğer doğru plastik kateter itin. Trakea ve kateter etrafında iplik küçük bir parça bağlayarak kateter Fix.

2. Akciğer Doku Enzimatik Sindirim

İsterseniz, bronkoalveoler lavaj sıvısı örneği olabiliradımdan önce PBS veya orta trakea takılı kateter yoluyla akciğerlere kızarma tarafından hazırlanmıştır.

  1. 2 ml'lik şırınga yardımıyla, her lobun tam olarak genişletilmiş, böylece kateter yoluyla akciğer içine dispase 2 ml (4 ml bir örnek gelen) bir maksimum hacim aşılamak. Sıvılaştırılmış agaroz 0.5 ml içeren 1 ml şırınga ile şırınga değişim ve aynı zamanda akciğer içine aşılamak.
  2. Agaroz geri akışını önlemek ve hemen laboratuar kağıt mendil ve buz ile akciğer karşılamak için kateter üzerinde şırınga bırak. Birkaç dakika için agaroz jel olsun.
  3. , Kağıt mendil, buz, şırınga ve kateter çıkarın trakea ve tüketim akciğer, kalp ve göğüs timus kesti. Sonra PBS ile bir tabak içinde akciğer durulayın ve kalp, timus ve kalan trakea çıkarın.
  4. Dispase geri kalan kısmı 2 ml akciğer içine yerleştirin ve 45 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir.

3. Akciğer hazırlanmasıHücre Süspansiyon

  1. Dispase gelen akciğer çıkarın ve DMEM ortamı ve 100 ul içinde DNase anti-CD16/32 antikor 7 ml (1 ug / ml nihai konsantrasyon) ihtiva eden bir çanak içine aktarın.
  2. Forseps kullanarak, tamamen ayrı çekerek akciğer doku parçalanır ve yavaşça 200 rpm ayarlanmış bir rocker üzerinde sallanan ise oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Arzu edildiği takdirde, hücre süspansiyonu daha sonra bir sonraki adıma kadar 4 ° C de muhafaza edilebilir.
  3. 100 mikron ve daha sonra 70 mikron, 48 mikron ve 30 mikron gözenek ile ilk naylon kafesleri yoluyla hücre süspansiyonu filtre. Hücre kaybını en aza indirmek ve verimi en üst düzeye çıkarmak için de DMEM ile tüpler ve iyice yemekleri gibi her örgü durulama özen gösterin. Eğer örnek birleştirilmesi, bu daha sonra aynı filtre ile bir grup farelerden alınan hücreler süspansiyonlar geçerek burada elde edilebilir. Tıkanma durumunda filtre yenileyin.
  4. Hacmine bağlı olarak, bir tane ya da daha fazla 50 mL tüpler ve süzüntü aktarmak160 x g 'de 15 dakika, 4 ° C'de santrifüj Süpernatantı.
  5. 2 ml eritrosit lizis tamponu (0.15 M NH4CI, 0.01 M KHCO 3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2) içinde yeniden süspanse edin ve hücre peleti hızla DMEM ortamı 13 ml ilavesiyle lizis sona erer. 160 x g'da 12 dk, 4 ° C'de bir 15 ml tüp ve santrifüj çözelti aktarın

4. Akış Sitometrik Hücre-sıralama için Antikor Boyama

  1. Akış sitometrisi için uygun dilüsyonlarda DMEM ortamı içinde hazırlanmış, 3 ml birincil antikor kokteyli, hücrelerin yeniden süspanse edin. (Antikorlar, önceden 100 ul bir hacim içinde 1 x 10 6 splenositlerin lekeleme ile optimum çalışma dilüsyonları için titre edilmiştir. Kullanımlar beş fare kadar birikintilerini hücreler için kullanılan antikorların her biri için optimum konsantrasyonu ihtiva eden birincil antikor kokteyli 3 ml. Daha fazla fareler bir örneğe toplanmış ise,) seviyesini ayarlamak.
  2. Boyanması için, karanlıkta 10 dakika için hücreler inkübe4 ° C'de
  3. 12 160 x g'de ve 4 dakika için santrifüjleme ile DMEM ortam ile 15 ml tüp doldurma ile yıkayın hücrelerini ° C.
  4. Halinde ya da bağlanmamış biotinlenmiş antikorları 4.1 kullanılmıştır: süpernatantı ve 2 hücreleri tekrar süspansiyon - 3 ml ikincil antikor kokteyli. Karanlıkta 4, 10 dakika ° C'de Leke.
  5. 160 x g'da 12 dk, 4 ° C ve DMEM ve santrifüjleme ile tüp doldurma yoluyla yıkayın hücrelerini
  6. Hücre-sıralama için bir tüp içine bir 50 um filtre aracılığıyla DMEM ve ön-filtre, 1 ml hücre yeniden süspanse edin. İsteğe bağlı: akciğer hücre süspansiyonu toplam hücre sayısını elde etmek için hücreleri saymak.

5. Hücre-sıralama

  1. Sıralama önce vorteks hücreleri karıştırın. AECII hücre-sıralama için 100 mikron nozul kullanın. Kılıf sıvı basıncı hem de lazer emisyon ve saptama dalga boyları akış sitometrik hücre-sıralama gibi antib kullanılan florokromlar için kullanılan cihaza bağlıdırody boyama işlemi.
  2. DMEM içeren bir tüpe boyama ve sıralama için kullanılan florokromlar için negatif SSC Yüksek hücreleri üzerinde Kapısı. (SSC-A) pencereler (içinde yolluk stratejisinin ayrıntılarını gördüğünüz herhangi çiftler veya hücre agrega dışlamak için dağılım yüksekliği (FSC-H) vs alanı (FSC-A) ve yan dağılım yüksekliği (SSC-H) vs alanında ileri kullanın 1) Şekil.
  3. 20 280 xg'de dk ve 4 kriteri hücreler santrifüj toplamak amacıyla ° C.
  4. Daha sonraki analiz için gerekli olan kültür ortamı ya da tampon olarak hücreler yeniden süspanse edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sağlıklı farelerden izole akciğer hücre süspansiyonları sıralama yapılırken AECII kapısı genellikle yaklaşık 42 hesap verecek ± tüm olayların 10%. Bu yüzde, başlangıçtaki hücre süspansiyonu solunum yolları için işe lenfositler ve diğer bağışıklık hücrelerinin oldukça yüksek oranda içerecek şekilde, örneğin bir viral enfeksiyon gibi solunum koşullar ile farelerin kullanılması durumunda belirgin ölçüde daha düşük olabilir. Günde 3 Aşağıdaki enfeksiyonu IAV enfekte akciğerlerden izole AECII için biz kabaca% 50 oranında AECII kapısı hücrelerin sıklığı bir azalma gözlemledik.

Sıralanmış hücreleri tipik bir tür hem de yeniden analiz Şekiller 1 b ve 1 c de tarif edilmiştir. Belirtildiği gibi, izole edilmiş hücreler saflığı yaklaşık 92 oluşturmaktadır ±% 5 idi. Şekil 2a olarak, saf hücre popülasyonlarının başarılı bir ayırma tarafından özel olarak ifade edilir sürfaktan proteinleri C için boyama ile teyit edilebilir göstermekAECII 16, 17.

Biz tek hayvan başına izole AECII sayısını büyük ölçüde kullanılan fare zorlanma bağlıdır gözlemledim. BALB / c fareler genelde 1 x 10 verim ise 6 AECII / fare, C57BL / 6 gerginlik sadece verimi 1 - 3 x 10 5 AECII / fare. Her deneme için kullanılan farelerin sayısı, bu nedenle fare suşu olarak yapılacak daha sonraki analizler türüne bağlıdır.

Alınan AECII canlılığı ile ilgili olarak, biz genellikle akım sitometrik hücre-sıralama sonrasında% 90 civarında canlılığı oranları bulabilirsiniz. Yaşayabilir hücrelerin bu yüksek oran daha sonra direkt işlevsel analizleri ile izole edilmiş primer fare AECII kısa süreli kültür izin verir.

Şekil 1
Şekil 1. Bakış over negatif seçimin birincil fare AECII akım sitometri izolasyonu için kullanılan gating stratejisi. yolluk stratejisi üzerinde (A) şematik gösterimi. (B) bir akciğer hücre süspansiyonu tür Temsilcisi araziler. (C) kriteri hücrelerin yeniden analiz Temsilcisi sonucudur. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Karakterizasyonu ve kriteri Primer mürin AECII moleküler analizi. (A) kriteri AECII arasında Cytospins sürfaktan protein C (SPC) için boyandı. Faz kontrast mikroskobu ile karşılaştırıldığında, hücrelerin yaklaşık% 100 SPC pozitif bulunmuştur. RNA izolasyonu sonrası kriteri primer fare AECII (B) Örnek RNA profili. Hesaplanmış RIN faktörü ile birlikte 18S ve 28S ribozomal RNA için özel zirveleri i RNA temsil AECII gelen sağlam izole RNA ntegrity ve kalite.

Şekil 3
Şekil 3,. Grip enfekte farelerden izole primer murin AECII A virüsü nükleoprotein (NP) İfade Analizi. C57BL / 6 farelerin intranazal fosfat verildi öncesinde AECII izolasyon gün 1, 2 veya 3 salin veya influenza A virüsünün PR8/A/34 tamponlu . (A) 'dan bulaşmamış akciğer hücre süspansiyonlarının Örnek grafikleri olarak sıralama için üç günlük enfekte C57BL / 6 fare lekeli. (B) İnfluenza kriteri AECII A virüsü NP ifade NP-spesifik antikor ve sonraki akış sitometri analizi ile hücre içi boyama yoluyla analiz edilmiştir. (C) tablo NP boyama ortalama floresan yoğunluğu (MFI) gösterir.

s "> Şekil 4,
Şekil 4. Influenza A virüsünün nükleoprotein (NP) Birincil fare AECII enfekte ex vivo olarak ifade Analizi. Ex vivo influenza, influenza A virüsünün NP 6 hücre içi boyama A virüsü PR8/A/34 enfekte AECII (A) Örnek akış sitometrik analizi hr enfeksiyonu sonrası. Ex vivo influenza virüsünün farklı dilüsyonlarda AECII 6 saat sonrası enfeksiyon enfekte A virüsünün NP-boyanması temsilcisi sonuçlar (B) Özeti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flow sitometri ile murin AECII ve izolasyonu için bizim protokol fonksiyonel ve moleküler çalışmalar bir dizi için fare akciğer primer hücrelerin erişmenin hızlı bir yol sunar. Açıklanan prosedür böyle bir RNA izolasyonu (şekil 2b bakın) ve transcriptome çalışmaları gibi doğrudan sonraki analizler için sayıca yeterli AECII son derece canlı ve saf popülasyonlarının verir. Fonksiyonel uygulamalar için, AECII şartlandırılmış ortam ya da ko-kültür deneylerinden elde edilen üretim örneğin sağlayan, kültür izole edilmiş hücreler için de mümkündür. Özellikle bu fonksiyonel çalışmalar için bir fayda olarak, burada açıklandığı gibi negatif seçimin birincil hücrelerin izolasyonu antikor bağlanma konu olmamıştır bakir hücreleri üretir. Bununla birlikte, hücre hatları üzerinde icra edilen birinci AECII çalışmaların daha avantajlı olmasına rağmen, bu birincil hücrelerin kullanımı için pratik bir sınırlama yoktur. Sayıları sadece sınırlama yanında, Yoğun tarama gerektiren çalışmaların gereksinimlerini karşılamak olmayabilir, hangi ilköğretim AECII sadece biz 48 saat etrafında ortalama gözlemledim kısıtlı bir süre için kültür hayatta. Bu kısa süreli kültürü deneyleri olarak, AECII şartlı ortamında kullanılan sonraki analizler doğasına bağlı kültür ortam seçiminden göre olan ve IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Cat. No 31980) ilave edilmiş ile tatmin edici sonuçlar elde ettik % 10 FCS, standart antibiyotik ve 0.25 mM β-merkaptoetanol.

Burada açıklanan protokol canlı ve iyi sayılar saf primer fare AECII tecrit nispeten kolay ve hızlı bir şekilde görüntüler. Ayrıldıktan sonra elde edilmiştir hücrelerin saflık kritik hücre ayırma usulü bağlıdır. Dışlanacak olan hücre popülasyonlarının bir açık ve güçlü boyama, SSC Yüksek olaylara sıkı yolluk gibi eşit derecede önemli olduğunu, böylece iyi türü olarak lenfoid hücreler ile kontaminasyonlarıBen epitel hücreleri minimize edilmektedir. Ayrılan hücrelerin verimi ile ilgili olarak, biz bu ham hücre süspansiyonu hazırlanması yanı sıra enzimatik sindirim sonrasında doku tam dağılmasıyla sırasında tüpler, filtre kafesleri ve tabak geniş kızarma tarafından maksimize olduğunu gözlemledik. Primer AECII ile çalışan bir ana yararı, solunum yolu hastalıkları olan ana doğrudan izole edilebilir olmasıdır. Böyle AECII doğal mikro-çevrede bulunan ve bu nedenle de in vivo durum yansıtmak tüm faktörler maruz kalmış olacaktır. Sıçan modellerinde çalışırken insan AECII 18, 19 farklı olarak, bu deney sistemlerinin geniş bir şekilde uzatılabilir. Biz, otoimmün iltihabı gibi akciğer viral enfeksiyon ile ilgili çalışmalarda bu yararlanarak edilmiştir. Böylece CD4 olan farelerin gelen AECII yararlı + T hücre solunum yolu iltihabı inflammat geniş bir ifade aracılıAkciğer immün yanıtlar 3 düzenleyen potansiyellerini göstermektedir ORY genler. Ayrıca, self-antijenleri otomatik reaktif CD4 fonksiyonel aktivasyon + T hücreleri ile sonuçlanan büyük doku uygunluk kompleksi sınıf II molekülleri aracılığıyla bu AECII ekranda gösterebilirsiniz. Aynı zamanda AECII Foxp3 indüksiyonu + düzenleyici T hücreleri 4 teşvik salgılayan faktörler tarafından akciğer toleransı sürdürmek.

Akciğer viral enfeksiyon ile ilgili olarak, biz başarıyla influenza A virüsü ile enfekte farelerden alınan birincil AECII izole ettim. Bağışıklık hücrelerinin önemli miktarda (şekil 3a) enfeksiyonuna yanıt olarak, akciğerlere olarak seçilmekte bütün akciğer hücre süspansiyonu daha küçük bir bölümü için yukarıda belirtildiği gibi, burada AECII hesap. De gösterildiği gibi grip izole edilmiş hücreler içinde bir virüs nükleoprotein (NP) hücre içi boyama süre boyunca viral proteinin artan ekspresyonu gösteren g> şekil 3b ve 3c. Bunlar AECII, in vivo virüs tarafından tetiklenen, moleküler ve fonksiyonel solunum yolu viral enfeksiyonu sırasında hava yolu epitel fenotipi yanı sıra sırasında kurtarma ile ilgili çalışmalar için değerli bir araç görüntüler. Ancak, AECII olarak influenza A virüsünün birincil hedef ve epitel önemli tahribat olduğunu, hücrelerin oranı enfekte farelerden alınan vermiştir boyunca ve enfeksiyon şiddeti azalır. Virüs sürekli çoğaltır ve yeni hücreleri enfekte olarak da, izole AECII zaman içinde tek bir tanımlanmış noktada enfeksiyona maruz olmamıştır. Böylece, bu çalışmalar ideal, rakamlar 4a ve 4b de gösterilmiştir intrasellüler viral NP boyama ile değerlendirilen enfeksiyon iyi, senkronize ve bir sağlıklı farelerde primer murin AECII enfekte ex vivo kullanarak deneyler ile tamamlanmaktadır bağlı enfeksiyon oranlarının daha yüksek verim alınabilir viral doz kullanılır.

jove_content "> birlikte ele alındığında, hem akım sitometri negatif seçim saf ve canlı birincil fare AECII tecrit hızlı bir şekilde görüntüler burada açıklanan. Bu hücreler analizler geniş bir aralığı için uygundur ve AECII rolü bilgimizin genişletilmesi için değerli bir araçtır in vivo olarak solunum yolu, bağışıklık düzenleme içinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Biz biyogüvenlik düzeyi 2 örneklerinden birincil fare AECII sıralama içinde teknik yardım için M. Höxter teşekkür etmek istiyorum.

Bu çalışma DB Alman Araştırma Topluluğu (DFG) (SFB587, TP B12 ve BR2221/1-1) ve Hannover Biyomedikal Araştırma Okulu (DFG GSC 108) AA bir nakit hibe ile desteklenmiştir. DB Başkan Girişimi ve sözleşme numarası W2/W3-029 altında Alman Araştırma Merkezleri Helmholtz Derneği (HGF) ve Ağ Fonu tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
indwelling cannula Introcan 22G Braun REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) BD Biosciences 354235 aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose Biozym 840101 1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial Sigma-Aldrich D4263 freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM Gibco 22320-022 used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm) BD Falcon 352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm) Bückmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter PARTEC 04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32 BioLegend 101302 clone 93; purified
anti-mouse F4/80 BioLegend 123116 clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b BioLegend 101208 clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c BioLegend 117310 clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45 BioLegend 103102 clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19 eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG BD Pharmingen 550767 polyclonal, PE coupled

Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
  2. Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
  3. Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
  4. Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
  5. Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
  6. Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
  7. Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
  8. Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
  9. Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
  10. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
  11. Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
  12. Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
  13. Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
  14. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
  15. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
  16. Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
  17. Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
  18. Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
  19. Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics