غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب

Published 3/08/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

قد وضعت مؤخرا تقنيات التصوير باستخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة مضان (NIRF) المساعدة في الكشف عن دور الجهاز الليمفاوي ورم خبيث يلعب في السرطان، والاستجابة المناعية، وإصلاح الجرح، وغيرها من الأمراض المرتبطة اللمفاوية.

Cite this Article

Copy Citation

Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الأوعية الدموية اللمفية هو عنصر هام من عناصر جهاز الدورة الدموية التي تحافظ على التوازن السائل، ويوفر المراقبة المناعي، وتتوسط امتصاص الدهون في الأمعاء. لكن على الرغم من وظيفتها الجوهرية، هناك فهم قليل نسبيا لكيفية تكيف الجهاز اللمفاوي لخدمة هذه الوظائف في الصحة والمرض 1. مؤخرا، لقد أثبتنا القدرة على حيوي صورة العمارة اللمفاوي والليمفاوية "ضخ" العمل في مواضيع الإنسان العادي وكذلك في الأشخاص الذين يعانون ضعف اللمفاوي باستخدام إدارة أثر للصبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) الفلورسنت والعادة، الجنرال III- تكثيف نظام تصوير 2-4. وأظهرت NIRF التصوير تغييرات جذرية في بنية ووظيفة اللمفاوية مع الأمراض التي تصيب البشر. يبقى من غير الواضح كيف أن هذه التغيرات تحدث ويتم تطوير نماذج حيوانية جديدة لتوضيح أساس الجينية والجزيئية. في هذا البروتوكول، نقدم NIRF اللمفاوي، قمول التصوير باستخدام الحيوانات 5،6 خضرة الإندوسيانين (ICG)، وهي الصبغة التي استخدمت لمدة 50 عاما لدى البشر وصبغ المسمى NIRF دوري المجال ملزمة الزلال (CABD-IRDye800) الببتيد التي ترتبط بشكل تفضيلي الماوس و 8 الألبومين البشري . ما يقرب من 5.5 مرات أكثر إشراقا من ICG، CABD-IRDye800 لديه إزالة اللمفاوي مماثلة الشخصي ويمكن حقن جرعات أقل من في ICG لتحقيق إشارات كافية للتصوير NIRF 8. لأن كلا من ربط CABD-IRDye800 وICG لالزلال في الفضاء الخلالي كلاهما قد تصور بالموقع النقل والبروتين إلى داخل الأوعية اللمفاوية. تدار داخل الأدمة (ID) الحقن (5-50 ميكرولتر) من ICG (645 ميكرومتر) أو CABD-IRDye800 (200 ميكرومتر) في المياه المالحة إلى الجانب الظهري من كل مخلب هند و / أو الجانب الأيسر والأيمن من قاعدة ذيل ماوس isoflurane-تخدير. تركيز صبغة مما أدى إلى الحيوان هو 83-1،250 ميكروغرام / كغ للICG أو 113-1،700 ميكروغرام / كغ للCABD-IRDye800. مباشرة بعد الحقن، ويجري التصوير الوظيفي للموارد البشرية اللمفاوي 1 حتى باستخدام صغيرة مخصصة نظام التصوير NIRF الحيوان. يمكن كله القرار الحيوان المكانية تصوير الأوعية اللمفاوية الفلورسنت من 100 ميكرون أو أقل، وصور الهياكل يصل إلى 3 سم في عمق يمكن الحصول عليها 9. يتم الحصول على الصور باستخدام برنامج V + + وتحليلها باستخدام برامج MATLAB أو يماغيج. أثناء التحليل، يتم رسمها المناطق متتالية من الفائدة (رويس) يشمل القطر بأكمله على طول السفينة سفينة الليمفاوية معين. يتم الاحتفاظ الأبعاد لكل ROI المستمر لسفينة معينة وكثافة NIRF يتم قياس العائد على الاستثمار لكل إجراء تقييم كمي "الحزم" من خلال الأوعية الليمفاوية تتحرك.

Protocol

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا لمعايير من جامعة تكساس مركز العلوم الصحية (هيوستن، TX)، قسم الطب المقارن، ومركز التصوير الجزيئي بعد مراجعتها والموافقة عليها من البروتوكول كل منها رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC) أو رعاية الحيوان اللجنة (AWC).

1. إعداد الحيوانات 24 ساعة قبل التصوير

ويجب أن يتم الخطوات التالية (حسب الحاجة) في اليوم قبل التصوير اللمفاوي يحدث.

  1. المكان الحيوانية في مربع تحريض وقور مع isoflurane.
  2. وبمجرد أن الحيوان هو في حالة من التخدير العميق (مراقبة مع إصبع القدم مناورة قرصة)، والحيوان مخدرا مكان على وسادة حفاضات / زغب والأنف موقف في مخروط الأنف متصل الغاز isoflurane.
  3. كليب كل الشعر / الفراء (إن وجدت) في جميع أنحاء المنطقة المراد تصويرها.
  4. تطبيق مزيل الشعر عامل (NAIR) إلى منطقة قص وترك الأمر سن الجلد لمدة تصل إلى 3 دقائق.
  5. قم بمسح جميع من وكيل مزيل الشعر مع الشاش، دافئة رطبة أو منشفة ورقية.
  6. شطف الجلد بلطف بالماء الدافئ والجاف بلطف المنطقة مع الشاش أو منشفة ورقية.
  7. السماح لاستعادة الحيوانات على وسادة التدفئة أو تحت مصباح الحرارة، والعودة إلى قفص.

2. يوم التصوير

  1. إعادة التصوير مع وكيل الماء المعقم، ثم استخدام تمييع، طبيعية معقمة (0.85٪) لتحقيق المالحة 645 ميكرومتر (5 μg/10 ميكرولتر) لICG ميكرومتر أو 200 (6.8 ميكرولتر μg/10) لCABD-IRDye800. نضع الحلول في الظلام شروط واستخدام الموارد البشرية من خلال 6 إعادة.
  2. المكان الحيوانية في مربع تحريض وقور مع isoflurane.
  3. وبمجرد أن الحيوان هو في حالة من التخدير العميق (مراقبة مع إصبع القدم مناورة قرصة)، والحيوان مكان مخدرا على جانبها على لوحة حفاضات / زغب والأنف موقف في مخروط الأنف متصل الغاز isoflurane.
  4. إطفاء الأنوار (حتى الغرفة هوالظلام). إذا لزم الأمر، يمكن استخدام الهالوجين مكتب صغير للضوء كمية صغيرة من الضوء لمعرفة الحقن.
  5. حقنة الانسولين باستخدام بإبرة 31-قياس، حقن 5 ميكرولتر ID إلى 50 ميكرولتر من ICG أو CABD IRDye800 في الجانب الظهري من كل مخلب هند و / أو على الجانب الأيسر والأيمن من قاعدة الذيل، اعتمادا على مجال الاهتمام (انظر المناقشة). كل جرعة حقن قد تتراوح ،083-1،25 مغ / كغ (ICG) أو ،113-1،7 مغ / كغ (CABD-IRDye800). سوف تختلف مع حجم الضخ سلالة الحيوانات وموقع الحقن. بالنسبة للفئران athymic، يمكن أن يكون حجم حقن 5 ميكرولتر (مخلب هند) أو 10 ميكرولتر (قاعدة الذيل). إذا الحيوانية ليست تحت نظام التصوير للحقن (ق)، ضع الحيوانات تحت نظام التصوير مباشرة بعد حقن (ق).
  6. إذا اعتبر أي امتصاص الصبغة في الأوعية اللمفاوية، وخطوة 2،5 يحتاج إلى تكرار حسب الحاجة في بروتوكول الحيوانية.
  7. مرة واحدة وينظر الأوعية اللمفاوية، تغطية مكان الحقن مع الشريط الكهربائي أسود أو أسود السلطة الفلسطينيةفي.
  8. الحصول على صور اللمفاوية لمدة تصل إلى 1 ساعة باستخدام V + + برامج والحيوانات الصغيرة، والتصوير NIRF النظام. (يتم تحت التخدير isoflurane مع الحيوانات ويتم مراقبة التنفس بينما تكتسب الصور.) بينما الحيوانات الصغيرة، والتصوير NIRF متاحة تجاريا، ونحن الاستفادة من صغيرة مخصصة نظام التصوير NIRF الحيوان يتكون من ليزر ديود 785 نانومتر (1005-9MM-78503 ، مكثفة، شمال برونزويك، NJ) تجهيزه مع عدسة شبه كروي (C24TME-B، Thorlabs، نيوتن، NJ)، الناشر (ED1-C20، Thorlabs)، والتصفية (LD01-785/10-25، Semrock، روتشستر، نيويورك ) لإنشاء حقل الإثارة موحدة الذي يضيء الحيوانية في الحادث معدل فلوينس من أقل من 1.4 ميغاواط لكل سنتيمتر مربع 10. اتهم بضرب الإلكترون، إلى جانب جهاز (EMCCD، PhotonMax512، برينستون الصكوك، ترينتون، NJ) نظام الكاميرا مع مرشحات 830 نانومتر اثنين (AND11333، أندوفر شركة، سالم، NH) وعدسة نيكور 28-مم (1992، نيكون، يستخدم ميلفيل، NY) لالتقاط الصور مع تيم التكامل اللمفاويوفاق من 200 ميللي ثانية للتصوير دينامية وميللي ثانية 800 للتصوير ثابت 5. انظر الشكل 1 لتكوين النظام، والجدول للحصول على تفاصيل إضافية من كل مكون، ومناقشة للمناقشة وجيزة من خصائص تصوير الرئيسية.
  9. السماح لاستعادة الحيوانات على وسادة التدفئة أو تحت مصباح الحرارة والعودة إلى القفص، أو الموت ببطء.
  10. تحليل الصور باستخدام يماغيج أو برامج MATLAB. انظر الشكل 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مثال على التصوير اللمفاوي NIRF في الفئران

عندما يتم حقن ICG أو CABD IRDye800-ID في قاعدة ذيل الماوس العادي، يجب أن الأوعية الدموية اللمفية بين موضع الحقن عند قاعدة الذيل والعقدة الليمفاوية الأربية (LN) يمكن تصور فورا. بعد وقت قصير من الحقن (بضع ثوان إلى دقائق)، ينبغي السفينة اللمفاوية الاربية بين LN ​​LN الإبطين وتصور كما رأينا في الشكل 2. منذ مفاوية في الفئران تختلف من حيوان إلى حيوان كما يفعلون في البشر، قد شهدت تباين في العمارة بين الحيوانات كما هو موضح في الشكل 3. عندما يتم حقن ICG أو NIRF CABD-ID على الجانب الظهري للهند مخلب من الماوس العادي، يمكن تصور الأوعية اللمفاوية 2 استنزاف المأبضي LN إلى كما هو موضح في الشكل 4. في بعض الحالات، فإنه من الصعب أن نميز كل السفن نظرا لقربها الوثيق مع بعضها البعض.

المتأثرة> الاحتياطات لتصوير الجهاز اللمفاوي NIRF

في بعض الأحيان، يتم تأخير التصور للمفاوية، والأكثر شيوعا نظرا لحقن تدار تحت الجلد (SC) بدلا من رقم. عندما تعطى الحقن SC، قد لا يكون النقل اللمفاوي تصور فورا كما رأينا في الشكل 5 (أ) بسبب الوقت الإضافي اللازم لالصبغة الوصول إليها، ويتم تناوله من قبل الشعيرات الدموية اللمفية في الجلد. هذا هو السبب في أنه من المهم لحقن ID بدلا من SC. في بعض الأحيان، ويلاحظ الأوعية اللمفاوية غير طبيعي، كما رأينا في الشكل 5 (ب)، في مجال الجرح مثل لدغة أو قطع من الشعر كليبرز / الفراء. ينبغي الحفاظ على درجة حرارة الجسم الحيوان داخل المعدل الطبيعي، وتغيير درجة حرارة الجسم يمكن أن يؤدي إلى وظيفة اللمفاوي غير متناسقة. القيود المفروضة على تقنية التعمية تشمل الأوعية اللمفاوية من الفلورسنت من تصبغ الجلد، وعدم القدرة على الصورة العميقة القنوات اللمفاوية الصدرية بسببنثر الضوء في الأنسجة، وتأثير غير معروف من التخدير على وظيفة اللمفاوي.

عموما، فإنه يأخذ من مستودع ID ICG أو CABD IRDye800-تصل إلى 2 يوما لمسح الكبد والمثانة، وتصل إلى 3 أيام لمسح موضع الحقن. عندما إشارة الفلورسنت المتبقية طهر، ويمكن تكرار بروتوكول التصوير، مما يسمح التصوير الطولي اللمفاوي لتقييم التغييرات في بنية أو وظيفة الليمفاوية بعد تدخل بعض.

تحليل وظيفة الجهاز اللمفاوي

يمكن تحميل الصور إلى يماغيج المكتسبة أو MATLAB لتحليل البيانات. ثابت منطقة، ويتم اختيار رويس دائرية أو "رسمها" على طول للسفينة اللمفاوية الفلورسنت كما فعلت لحقوق الحيوان (10) والتصوير اللمفاوي 5 كما هو مبين في الأرقام 6 (أ) و الشكل 6 (د). يتم اختيار رويس بحيث قطر على ما يقرب من القطر من صورة يتألقNT السفينة. يتم رسم كثافة مضان يعني في كل ROI بوصفها وظيفة من الوقت لتقييم التصوير السرعة الدافعة وتواتر من "الحزم" من صبغ لادن دفعت الليمفاوية على طول الأوعية اللمفاوية كما هو موضح في أرقام 6 (ب) والشكل 6 (ه ). لتقييم سرعة الانتشار اللمفاوي وتيرة الدفع اللمفاوية، يتم رسم 2 ROI، مع ماكسيما واضحة المعالم أو الاختلافات الدنيا شدة الفلورسنت تمثل نشر الحزم من الليمفاوية، التي تم اختيارها وملفاتهم الشخصية شدة الفلورسنت كما هو موضح في أرقام 6 (ج) و 6 (و). يتم حساب سرعة انتشار من خلال اتخاذ نسبة المسافة بين اثنين وROI في الوقت عبور للعلبة الليمفاوية للنشر بينهما. من خلال تقييم عدد النبضات الفلورسنت أو "الحزم" التوصل إلى ROI واحد لكل الوقت، يتم حساب التردد مقلص. بينما هذه التقنية يوفر الوسيلة الوحيدة لنكتSS التردد وسرعة الدفع من الدفع اللمفاوي "حزمة"، وتقييم الآخرين بشكل غير مباشر عن طريق قياس اللمفاوي النقل والتخليص وكيل مستودع التصوير وبالتالي حساب الثوابت معدل إزالة 11. الانبثاث السرطان في 10 و العدوى في وقت مبكر، نجد فقدان الدفع اللمفاوية في الحيوانات. التبليغ عن أي تغييرات في الآخرين انقباض استجابة لالتهاب المفاصل 12. في البشر، ونحن التقرير زيادة الدفع بعد العلاج وذمة لمفية بما في ذلك الصرف ضغط هوائي 13 و دليل التصريف اللمفاوي (التدليك) 14.

الشكل 1
الشكل 1. ونظام التصوير NIRF هو العرف الصنع للشركات الصغيرة الحيوانية التصوير اللمفاوي. الجهاز يتكون من ليزر ديود 785 نانومتر تجهيزه مع عدسة شبه كروي، diffusإيه، والمرشحات لإنشاء حقل الإثارة موحدة الذي ينير الحيوان وكاميرا EMCCD، عدسة التركيز، والمرشحات الضوئية لالتقاط الصور من الفلورسنت الليمفاوية 10.

الشكل 2
الشكل 2. عندما يتم حقن 10 ميكرولتر من ICG أو CABD IRDye800-ID في قاعدة ذيل الفأر العادي باستخدام إبرة قياس 31-، والأوعية الدموية اللمفية بين موضع الحقن عند قاعدة الذيل وLN الليمفاوية الأربية يجب أن تكون تصور على الفور. يتم الحصول على الصور مضان ديناميكية مباشرة بعد الحقن ولمدة تصل إلى 20 دقيقة حقن التالية. بعد وقت قصير من الحقن (بضع ثوان إلى دقيقة)، الأوعية اللمفاوية بين مكان الحقن وLN الأربية وبعد ذلك إلى منطقة الإبطين LN هي تصور على طريقة العرض الجانبي. لقد التقطت الصورة هو موضح في الشكل 2 5 دقائق. بعد الحقن وايال 10 ميكرولتر من ICG ID في قاعدة الذيل. النقطة المضيئة بين المناطق الأربية والإبطين هو الكبد.

الشكل 3
الشكل 3. منذ مفاوية في الفئران تختلف من حيوان إلى حيوان كما يفعلون في البشر، قد شهدت تباين في العمارة بين الحيوانات ومستقرة على مر الزمن. تم حقن فأرة رقم 124 مع ICG في قاعدة الذيل وتصويرها على الفور في اليوم 1. لوحة الأعلى يحتوي على الصورة التي تم الحصول عليها في يوم 1، وكذلك الحصول على صورة 2 أيام في وقت لاحق (يوم 3) باستخدام الماوس نفسه وحقن / بروتوكول التصوير. لوحة أسفل يحتوي على الصور التي تم الحصول عليها من آخر الماوس (# 127) مع حقن ICG وعلى الفور التقط يوم 1 و تصوير في وقت لاحق في اليوم 3. في حين أن العمارة اللمفاوي (نمط الأوعية اللمفاوية) تتراوح ما بين شهراستخدام # # 124 و 127، والصور التي تم الحصول عليها باستخدام NIRF تتفق لكل الماوس في أيام 1 و 3.

الشكل 4
الشكل 4. عندما يتم حقن ميكرولتر 5-10 من ICG أو NIRF CABD-ID على الجانب الظهري للهند مخلب من الماوس العادي، ينبغي الأوعية اللمفاوية 2 تصور استنزاف المأبضي LN إلى. يتم الحصول على الصور مضان ديناميكية مباشرة بعد الحقن ولمدة تصل إلى 20 دقيقة حقن التالية. في بعض الحالات فإنه من الصعب التمييز بين كل من السفن بسبب قربها كما هو موضح في صورة مكبرة ممثلة في مربع متقطع. لممثل الماوس هو موضح هنا، تم حقن 10 ميكرولتر من ICG في الجانب الظهري للمخلب، هند اليسار (أول موقع الحقن) وفي الجانب الأيسر من قاعدة الذيل (الثاني مكان الحقن). هذه الصورة كانت كاليفورنياptured حوالي 2 - 3 دقائق بعد الحقن الأولى والثانية حوالي 30 حتي 1 دقيقة بعد الحقنة الثانية.

الشكل 5
الشكل 5 (أ) يتم تأخير التصور أحيانا للمفاوية أو ضعف، والأكثر شيوعا نظرا لحقن تدار SC بدلا من الهوية. عندما يتم حقن 10 ميكرولتر من ICG أو CABD IRDye800-SC في قاعدة ذيل الفأر العادي باستخدام إبرة قياس 31-، سوف لا يكون النقل اللمفاوي تصور على الفور بسبب الوقت الإضافي اللازم لالصبغة الوصول إليها، واتخاذها من قبل الشعيرات الدموية اللمفية في الجلد. أيضا، وذلك بسبب الحقن العميق SC نسبيا، قد يكون هناك امتصاص اللمفاوي وبالتالي لا تصور الأوعية والغدد الليمفاوية. في (أ 5 الشكل )، تم حقن فأرة مع 10 ميكرولتر من ICG في قاعدة الذيل وSC الصور تم الحصول عليها 5 دقائق بعد الحقن. يمكن الصبغة في موقع الحقن ويمكن تصور أي الأوعية اللمفاوية أو الغدد الليمفاوية يمكن تصور. هذا هو السبب حقن ID مهمة. (ب) من التصور الجانب البطنية من الحيوان الأوعية اللمفاوية الشاذة الناجمة عن الجرح صادف يوم واحد في وقت سابق خلال إزالة الفراء مع كليبرز (الأنسجة وأشار موقع الإصابة على الجانب الأيمن الحيوان). تم التقاط الصورة تقريبا 5 دقائق بعد 10 ميكرولتر من ICG كانت تدار ID في قاعدة الذيل على الجانب كل اليسار واليمين. على الجانب (اليسار الحيوان) غير المصابين، ويمكن للLN الأربية يمكن تصور وكذلك على التوالي نسبيا سفينة اللمفاوية صادر عن استنزاف نحو LNS الإبطين. على الجانب الماوس، الحق، ومع ذلك، انقطع العادي الأوعية الدموية اللمفية وإصابة بسبب يظهر الشاذة بسبب إصلاح الأنسجة (scabbing).

المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 6
الشكل 6. التحليل الكمي وظيفة اللمفاوي مقلص يتكون من اختيار رويس على طول الأوعية اللمفاوية من استنزاف LN (أ) إلى الأربية LN الإبطين و (د) في موقع الحقن على الجانب الظهري للمخلب إلى LN المأبضي. صورة مكبرة (أقحم في الفقرة (أ)) من مستطيل أحمر متقطع يوضح اختيار رويس على طول السفينة الفلورسنت. تجميع للكثافة مضان المتوسط ​​بوصفها وظيفة من الوقت لجميع رويس من (أ) و (د) ممثلة في مؤامرة زائفة اللون هو مبين في (ب) و (ه) على التوالي. والاضطرابات في كثافة مضان عبر بكسل تمثل اللمفاوي "نبض" من خلال نشر رويس وع بالتوازي مع السهام ه. وتظهر كثافة مضان لمتوسط ​​رويس واحدة 22 و 45 من (ب) في (ج) وكثافة مضان لمتوسط ​​رويس واحدة 18 و 34 من (ه) وترد في (و). ملامح كثافة مضان بوصفها وظيفة من الزمن (كما هو مبين في (ج) و (و)) تيسير التعرف على الحزم من نشر الليمفاوية واستخراج وقت العبور والمسافة بين اثنين رويس. يتم اختيار رويس اثنين في جزء منها على موقعها على طول السفينة اللمفاوية والوضوح الذي يتم عرض القيم العظمى والصغرى انتشار الليمفاوية تمثل. يتم احتساب السرعة على أنه نسبة المسافة بين اثنين رويس ووقت العبور التي يتم اتخاذها بين كثافة مضان الذروة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية

er.within صفحة = "دائما"> الشكل 7
الشكل 7. لتصور مفاوية تصريف من المنطقة الأربية للمنطقة الإبطين، وضخ الجانب الأيسر أو الأيمن من قاعدة الذيل. بشكل عام، لتصور الجانب الأيسر، وضخ في الموقع 5 و 6 و 9، أو 10، وعلى تصور الجانب الأيمن، وضخ في الموقع 7، 8، 11، أو 12. قد المواقع من 1 إلى 4 تكون أدنى مما ينبغي على الذيل لامتصاص الأمثل لتصور التصريف اللمفاوي من المنطقة الأربية للمنطقة الإبطين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نستخدم صغيرة مخصصة نظام التصوير الحيوان NIRF لالتقاط الصور من الأوعية الليمفاوية وصفت في الفئران. أفلام لبناء الحركة الليمفاوية، يتم جمع 300 أو أكثر الصور. لمفاوية من التحليل الوظيفي من الأفلام، ويتم رسمها يدويا رويس اثنين أو أكثر على طول سفينة الليمفاوية. يتم الاحتفاظ أبعاد رويس المستمر لكل سفينة وما يقرب من قطر السفينة. بينما القرار الحيوان كله يمكن تصور المكانية الأوعية اللمفاوية الفلورسنت من 100 ميكرون أو أقل، ويمكن أن تستخدم لmacrolens للصور أدق القرار 10. ويمكن أيضا الضوء الأبيض الصور التشريحية للرجوع إليها في الحصول عليها باستخدام مصباح الطاقة المنخفضة. تجدر الإشارة إلى أنه إذا وتتكون من وكلاء التصوير الأصباغ الفلورية الأخرى مع الإثارة مختلفة / مضان الانبعاثات الأطياف، ثم مرشحات المذكورة أعلاه يجب أن يكون تغيير للحفاظ على الأداء والتصوير، وكيل والجرعة قد تحتاج تعديل أيضا. أيضا، إذا كان الطول الموجي هو الإثارة جنيهSS من 750 نانومتر، ومن ثم قد يؤدي تألق ذاتي، إشارة الخلفية سوف تزيد، وحساسية التصوير سينخفض. وبالإضافة إلى ذلك، قد عدم استقرار وكلاء في حل يحول دون استخدام بعض الأصباغ NIRF، مثل Cyanine 7 (Cy7).

واختيار مكان الحقن المناسب تعتمد على التي يجري دراستها الأوعية اللمفاوية. لتصور مفاوية تصريف من المنطقة الأربية للمنطقة الإبطين، وسوف تحتاج لحقن الجانب الأيسر أو الأيمن من قاعدة الذيل، كما هو موضح في الشكل 7. لتصور مفاوية تصريف من المنطقة الفخمة، وسوف تحتاج لحقن الجانب الظهري للهند مخلب. فمن الضروري للحفاظ على درجة حرارة الجسم الحيوان داخل المعدل الطبيعي، وتغيير درجة حرارة الجسم يمكن أن يؤدي إلى وظيفة اللمفاوي غير متناسقة. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك بسبب مجموعة ديناميكية محدود من أجهزة المتقارنة بواسطة الشحنات الأكثر، ينبغي تغطية مواقع الحقن مع ورقة سوداء لمنع الضوء الفلورسنت therebذ تمكين تصور باهتة تجفيف الأوعية اللمفاوية. يجب أن يتم تنفيذ التصوير في غرفة مظلمة للحد من الإشارات غير المرغوب فيها الخلفية بسبب انبعاث الضوء في النطاق مضان من أضواء الغرفة. يجب أيضا أن الحيوان ملقى على خلفية سوداء بينما يتم تنفيذ التصوير للحد من تشتت ارتدادي الخفيفة.

قد NIRF التصوير اللمفاوي تمكين فهم أفضل للأمراض اللمفاوية اللمفاوية وكيف الهندسة المعمارية وظيفة التغييرات فيما يتعلق المرض أو الإصابة. على سبيل المثال، استخدم فريق البحث NIRF التصوير في الحيوانات الصغيرة لتوفير phenotyping اللمفاوية من الحيوانات و6،15 للكشف عن تغيرات في وظيفة اللمفاوي وسرطان الانبثاث مع العمارة 10. في البشر، وقد استخدم هذه التقنية للكشف عن العلامات المبكرة للذمة لمفية تقييم الاستجابة للعلاج وذمة لمفية 13،14،16، والنمط الظاهري أفراد الأسرة الذين يعانون من اضطرابات وراثية اللمفاوي. ومع ذلك، غير الغازية الخامسويقتصر isualization من الأوعية اللمفاوية العميقة (> 3 سم) في البشر من قبل من الضوء المبعثر في الأنسجة. وقد تم الحصول على صور من الهياكل اللمفاوية تصل إلى 3 سم في عمق الخنازير في 9 و التصوير الإنسان. في البشر، وقد استخدمت lymphoscintigraphy MRI وديناميكية لتحديد وقت العبور من عامل تباين من موقع الحقن إلى الغدد الليمفاوية في مرض. ومع ذلك، فإنها تفتقر كافية قرار الزمنية والمكانية لتصور الأحداث تصوير الدفع اللمفاوي بسهولة مع NIRF. وبالإضافة إلى ذلك، ليست صحية مفاوية تصور مع التصوير بالرنين المغناطيسي بسبب عدم وجود التباين. NIRF التصوير هو غير الغازية، على عكس مبائر، المجهر multiphoton، والتصوير intravital. تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر وعادة multiphoton الاستفادة الأنسجة جزئيا أو كليا مقطوعة. طرق Scintographic تستلزم استخدام النويدات المشعة والثانوية في بعض الأحيان كيفية تركيب الكانيولا في السفينة. طريقة أخرى لتصور الأوعية اللمفاوية ويشمل التصوير intravital خلالها الماوسالموت الرحيم ويتم سحبها مرة أخرى بعد الأدمة حقن ID من ايفانز الأزرق صباغة. ومع ذلك، وهذه الطريقة لا توفر التصوير الوظيفي أو طولية 17،18. ولا يمكن تصوير الانبثاث LN باستخدام Inveon سيمنز PET / CT، إلا أن هذه التقنية لا يسمح التصور من هيكل اللمفاوي أو وظيفة 19.

في حين أن الكتاب لا أنصح ولا تصادق على أي جهاز التصوير محددة التجاري، تجربتنا تشير إلى أن اختيار مصدر الضوء والمرشحات الضوئية قد يكون العامل الوحيد الأكثر أهمية الذي يحدد حساسية الجهاز. كما وصفها تشو وآخرون، للتصوير الناجح لتركيزات منخفضة من صباغة، يجب أن يكون هناك تداخل بين الحد الأدنى من الطيف انبعاث مصدر الضوء والطيف انتقال المرشحات الضوئية 20. وهناك اعتبار آخر هو المفتاح لطيف امتصاص وانبعاث للصباغة NIRF المستخدمة. في هذا ICG الورق وCABD IRDye800 يكون بين جمعية مهندسي البترول مماثلةCTRA وهكذا يمكن استخدام ليزر ديود وصف الطول الموجي وتركيبات لكل مرشح، ولكن إذا صبغ آخر لاستخدامه التي لا تمتص و / أو يتألق في هذه الأطوال الموجية، الطول الموجي للضوء ومصدر المرشحات الضوئية يجب أن يكون تبعا لذلك. ICG يمكن أن تكون كافية للعديد من التطبيقات، وبالفعل وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير. لا NIRF-CABD وافقت عليها الهيئة لاستخدامها في البشر، ولكن قد تكون مفيدة لتصوير الحيوانات. ICG لا يملك الكيميائية التي تربط بقايا لربط استهداف الأنصاف، ويجري حاليا وضع وكلاء الفلورسنت الأخرى كذلك، مثل NIRF-CABD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف، ولكن يتم سرد بعض الكتاب على براءة اختراع.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المنح التالية لSevick إيفا: NIH R01 R01 CA128919 وNIH HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats