Ikke-invasiv optisk billeddannelse af lymfatisk vaskulatur på en mus

Published 3/08/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Nyligt udviklede billeddannelsesteknikker hjælp nær-infrarøde fluorescens (NIRF) kan til at belyse den rolle, det lymfatiske system spiller i cancermetastase, immunrespons, sårreparation og andre lymfatiske-associerede sygdomme.

Cite this Article

Copy Citation

Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det lymfatiske kar-systemet er en vigtig del af kredsløbet, som opretholder fluid homeostasis, giver immunovervågning, og medierer fedtabsorption i tarmen. Men på trods af sin kritiske funktion, er der forholdsvis ringe forståelse af, hvordan lymfesystemet tilpasser sig betjene disse funktioner i sundhed og sygdom 1. For nylig har vi demonstreret evne til dynamisk billede lymfatisk arkitektur og lymfe "pumpe" handling hos normale forsøgspersoner samt i personer, der lider lymfatisk dysfunktion ved hjælp af spor administration af en nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) farvestof og en brugerdefineret, Gen III- intensiveret billeddannelsessystem 2-4. NIRF imaging viste dramatiske ændringer i lymfe arkitektur og funktion med sygdom hos mennesker. Det er fortsat uklart, hvordan disse ændringer sker og nye dyremodeller bliver udviklet for at belyse deres genetiske og molekylære grundlag. I denne protokol, præsenterer vi NIRF lymfatisk, small dyr billeddannelse 5,6 ved hjælp af indocyaningrøn (ICG), et farvestof, der har været anvendt i 50 år hos mennesker 7 og en NIRF farvestof-mærkede cykliske albumin bindingsdomæne (cABD-IRDye800) peptid, der fortrinsvis binder muse-og humant albumin 8 . Omkring 5,5 gange lysere end ICG, cABD-IRDye800 har en lignende lymfatisk clearance profil og kan injiceres i mindre doser end ICG at opnå tilstrækkelige NIRF signaler til billeddannelse 8. Fordi begge cABD-IRDye800 og ICG binder til albumin i det interstitielle rum 8, kan de begge viser aktivt protein transport til og inden lymfevejene. Intradermal (ID) injektion (5-50 pl) af ICG (645 uM) eller cABD-IRDye800 (200 uM) i saltvand indgives til det dorsale aspekt på hver bagpote, og / eller den venstre og højre side af bunden af hale af en isofluran-bedøvede mus. Den resulterende farvestofkoncentration i dyret er 83-1,250 ug / kg til ICG eller 113-1,700 ug / kg tilcABD-IRDye800. Umiddelbart efter injektioner, er funktionel lymfatisk billeddannelse udført i op til 1 time under anvendelse af en tilpasset, lille dyr NIRF imaging system. Hele dyr rumlig opløsning kan afbilde fluorescerende lymfekar på 100 mikrometer eller derunder, og billeder af konstruktioner på op til 3 cm i dybden kan erhverves 9. Billeder er erhvervet ved hjælp af V + + software og analyseres ved hjælp ImageJ eller MATLAB software. Under analyse bliver efterfølgende områder af interesse (ROI'er) omfatter hele fartøj diameter trukket langs en given lymfeknuder fartøj. Dimensionerne for hver ROI holdes konstant for et bestemt fartøj og NIRF intensitet måles for hver ROI til kvantitative vurderinger "pakker" af lymfeknuder bevæger sig gennem fartøjer.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de standarder, fra University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Institut for Sammenlignende Medicin og Center for Molekylær billeddannelse efter gennemgang og godkendelse af protokollen fra deres respektive institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC) eller Animal Welfare Committee (AWC).

1. Fremstilling af dyr 24 timer før Imaging

Nedenstående trin skal gøres (efter behov) dagen før lymfatisk billeddannelse finder sted.

  1. Placer dyr i en induktion kasse og adstadig med isofluran.
  2. Når dyret er i en tilstand af dyb anæstesi (overvåget med tå-pinch manøvre), place sederet dyr på en ble / fluff pad og position næse i en næsekegle forbundet til isofluran gas.
  3. Clip alle hår / pels (om nogen) omkring det område, der skal afbildes.
  4. Påfør hårfjerningsmidler agent (Nair) til den klippede område og overlade det on huden i op til 3 min.
  5. Tør forsigtigt off alle hårfjerningsmiddel agent med varm, fugtig gaze eller køkkenrulle.
  6. Forsigtigt skylle huden med varmt vand og forsigtigt tørre området med gaze eller køkkenrulle.
  7. Tillad dyr at inddrive på en varmepude eller under en varmelampe, og vende tilbage til deres bur.

2. Day of Imaging

  1. Rekonstituer billeddannende middel med sterilt vand, derefter fortyndet med sterilt, normal (0,85%) saltvand for at opnå 645 uM (5 μg/10 gl) til ICG eller 200 uM (6,8 μg/10 gl) til cABD-IRDye800. Hold opløsninger i mørke forhold og anvendelse inden for 6 timer efter tilberedningen.
  2. Placer dyr i en induktion kasse og adstadig med isofluran.
  3. Når dyret er i en tilstand af dyb anæstesi (overvåget med tå-pinch manøvre), place sederet dyr på siden på en ble / fluff pad og position næse i en næsekegle forbundet til gas isofluran.
  4. Sluk lyset (så Værelset ermørke). Hvis det er nødvendigt, kan en lille reception halogenlys anvendes til et lille mængde lys at se injektioner.
  5. Ved anvendelse af en insulinsprøjte med en 31-gauge nål injiceres ID 5 pi til 50 pi ICG eller cABD-IRDye800 i den dorsale aspekt af hver bagpote og / eller på venstre og højre side af haleroden, afhængigt af området af interesse (se Diskussion). Hver injicerede dosis kan ligge i området fra 0,083 til 1,25 mg / kg (ICG) eller fra 0,113 til 1,7 mg / kg (cABD-IRDye800). Injektionsvolumener vil variere med animalsk stamme og injektionsstedet. For athymiske mus, kan mængden af injektionen være 5 pi (bagpote) eller 10 pi (halerod). Hvis dyret ikke er under den billeddannende system til injektion (er), sende dyret under afbildningssystem umiddelbart efter injektion (e).
  6. Hvis der ikke farveoptagningsprøven ses i lymfevejene, vil trin 2,5 skal gentages efter behov for hvert dyr protokol.
  7. Når lymfevejene ses, dække injektionsstedet med sort elektrisk tape eller sort papr.
  8. Erhverve lymfatiske billeder i op til 1 time ved hjælp af V + + software og et lille dyr, NIRF imaging system. (Dyr er bedøvet med isofluran og åndedræt bliver overvåget, mens billeder erhverve.) Mens små dyr, NIRF kameraer er kommercielt tilgængelige, bruger vi en skræddersyet, lille dyr NIRF imaging system bestående af en 785-nm laserdiode (1005-9mm-78.503 , Intense, North Brunswick, NJ) udstyret med en asfærisk linse (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), diffuser (ED1-C20, Thorlabs), og filter (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) for at skabe et ensartet excitation felt, der oplyser dyret ved en hændelse fluens på mindre end 1,4 mW per kvadratcentimeter 10. En elektron multiplicere Charge coupled device (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) kamera system med to 830-nm filtre (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) og en 28-mm Nikkor-objektiv (1992, Nikon, Melville, NY) anvendes til at indfange lymfatiske billeder med integration times på 200 ms til dynamisk imaging og 800 msek for statisk billeddannelse 5. Se figur 1 for systemkonfiguration, tabellen for yderligere oplysninger om hver komponent, og diskussionen for en kort drøftelse af centrale imager egenskaber.
  9. Tillad dyr at inddrive på en varmepude eller under en varmelampe og vende tilbage til deres bur, eller aflive.
  10. Analyser billeder med ImageJ eller MATLAB software. Se fig. 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempel på NIRF lymfatisk Imaging i mus

Når ICG eller cABD-IRDye800 injiceres ID ved basen af ​​halen med en normal mus, bør det lymfatiske kar mellem injektionsstedet ved haleroden og inguinale lymfeknuder (LN) umiddelbart visualiseres. Kort efter injektionen (nogle få sekunder til minutter), bør lymfekar mellem inguinal LN og axillær LN kan visualiseres som det ses i figur 2. Da lymfevejene i mus varierer fra dyr til dyr, som de gør i mennesker, kan variation i arkitekturen mellem dyr betragtes som vist i figur 3. Når ICG eller NIRF-cABD injiceres ID på den dorsale aspekt af bagpoten af en normal mus, kan to lymfekar synliggøres drænende til den popliteale LN som vist i figur 4. I nogle tilfælde er det vanskeligt at skelne de to fartøjer på grund af deres tætte nærhed med hinanden.

Til tider er visualisering af lymfevejene forsinket, mest almindeligt som følge af injektion blev indgivet subkutant (SC) i stedet for ID. Når SC injektioner gives, kan lymfatisk transport ikke umiddelbart visualiseret som vist i figur 5 (a) på grund af den tid nok til farvestoffet at nå og blive optaget af det lymfatiske kapillærer i huden. Det er derfor, det er vigtigt at injicere ID i stedet for SC. Den lejlighed, er unormale lymfatiske kar observeret, som vist i figur 5 (b), inden for et sår, såsom en bid eller skæres fra håret / pels trimming. Dyrets kropstemperatur bør holdes inden for normalområdet, som ændrer legemstemperatur kan føre til inkonsekvent lymfe funktion. Begrænsninger af teknikken omfatter dæmpning af fluorescerende lymfekar ved hud pigmentering, den manglende evne til at afbilde de dybe thorax lymfekar grundtil lysspredning i vævet, og den ukendte virkning af anæstesi på lymfe-funktion.

Generelt er det tager ID depot af ICG eller cABD-IRDye800 op til 2 dage at rydde lever og blære, og op til 3 dage at rydde injektionsstedet. Når resterende fluorescerende signal er ryddet, kan det billeddannende protokollen gentages, så langsgående lymfatisk scanning for at vurdere ændringer i arkitektur eller lymfe-funktion efter nogle indgreb.

Analyse af lymfatisk Funktion

De tilkøbte billeder kan indlæses i ImageJ eller MATLAB til dataanalyse. Konstant-område er cirkulært ROI'er valgt eller "trækkes" langs hele længden af det fluorescerende lymfekar som på human 10 og dyrs 5 lymfatiske billeddannelse som vist i figur 6 (a) og figur 6 (d). The ROI'er vælges således, at deres diameter er ca diameteren af ​​billedet af fluorescerent fartøj. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet i hver ROI er plottet som en funktion af afbildningstiden for at vurdere fremdrivningseffektiviteten hastighed og hyppigheden af "pakker" af farvestof-laden lymfe fremdrives langs lymfekar som vist i figur 6 (b) og figur 6 (e ). At vurdere den lymfatiske udbredelseshastigheden og hyppigheden af lymfatisk fremdrift, er to ROI s, med klart definerede maksima eller minima fluorescerende intensitetsvariationer repræsenterer udbredelsen af pakker af lymfeknuder, udvælges, og deres fluorescerende intensitetsprofiler afbildet som vist i figur 6 (c) og 6 (f). Udbredelseshastigheden beregnes ved at tage forholdet mellem afstanden mellem de to ROI-og transittiden for en pakke lymfeknuder at udbrede sig mellem dem. Ved vurdering af antallet af fluorescerende impulser eller "pakker" ankommer til en enkelt ROI per tid, er kontraktile frekvensen beregnes. Selv om denne teknik tilvejebringer den eneste metode til at Assess fremdrift frekvens og hastighed af en selvkørende lymfatisk "pakke", andre har indirekte evalueret lymfatisk transport ved at måle depot clearance af et billeddannende middel, og dermed beregne fjernelse hastighedskonstanter 11. I kræft metastaser 10 og tidlig infektion, finder vi tab af lymfatisk fremdrift i dyr. Andre indberette ændringer i kontraktilitet som reaktion på arthritis 12. Hos mennesker, rapporterer vi øget fremdrift efter Lymphedema behandlinger, herunder pneumatisk kompression dræning 13 og manuel lymfedrænage (massage) 14.

Figur 1
Figur 1. Den NIRF billedbehandlingssystem er specialbygget til små dyr lymfatisk billeddannelse. Anordningen består af en 785-nm laserdiode udstyret med en asfærisk linse, Diffusøh, og filtre til at oprette et ensartet excitation felt, der oplyser dyret og en EMCCD kamera, fokuserende linse og optiske filtre til at fange billeder af fluorescerende lymfeknuder 10.

Figur 2
Figur 2. Når 10 pi ICG eller cABD-IRDye800 injiceres ID ved basis af halen med en normal mus under anvendelse af en 31-gauge nål, det lymfatiske kar mellem injektionsstedet ved haleroden og inguinal lymfe LN skal være umiddelbart visualiseres. Dynamiske fluorescensbilleder erhverves umiddelbart efter injektion, og i op til 20 min efter injektion. Kort efter injektionen (nogle få sekunder til minutter), lymfekar mellem injektionsstedet og inguinal LN og derefter til armhulen LN region visualiseres på lateral afbildning. Billedet vist i figur 2 blev taget 5 min. efter injektion with 10 ul ICG ID ved haleroden. Den lyse plet mellem de lyske og aksil regioner er leveren.

Figur 3
Fig. 3. Da lymfevejene i mus varierer fra dyr til dyr, som de gør i mennesker, kan variation i arkitekturen mellem dyr ses og er stabil over tid. Mus # 124 blev injiceret med ICG ved haleroden og afbildes umiddelbart på dag 1. Toppanelet indeholder billedet opnået på dag 1 og et billede opnået 2 dage senere (på dag 3) under anvendelse af samme mus og injektion / billeddannelse protokollen. Det nederste panel indeholder billeder opnået fra en anden mus (# 127) injiceret med ICG og straks afbildes dag 1 og efterfølgende afbildet på dag 3. Mens lymfatisk arkitektur (det mønster af lymfekar) varierer mellem mobruge # 124 og # 127, de billeder der er opnået ved hjælp af NIRF er konsistente for hver mus på dag 1 og 3.

Figur 4
Fig. 4. Når 5-10 pi ICG eller NIRF-cABD injiceres ID på den dorsale aspekt af bagpoten af en normal mus, bør to lymfekar synliggøres drænende til den popliteale LN. Dynamiske fluorescensbilleder erhverves umiddelbart efter injektion, og i op til 20 min efter injektion. I nogle tilfælde er det vanskeligt at skelne de to fartøjer på grund af deres nærhed som vist i det forstørrede billede repræsenteret ved den stiplede boks. For den repræsentative mus er vist her, blev 10 pi af ICG injiceret i den dorsale aspekt af den venstre bagpote (første injektionssted) og i den venstre side af haleroden (andet injektionssted). Dette billede var captured ca 2-3 minutter efter den første injektion og på 30 sek - 1 min efter den anden injektion.

Figur 5
Figur 5. (A) Lejlighedsvis visualisering af lymfevejene forsinkes eller forringet, mest almindeligt som følge af injektion blev administreret SC stedet for ID. Når 10 pi ICG eller cABD-IRDye800 injiceres SC ved basis af halen med en normal mus under anvendelse af en 31-gauge nål, vil lymfatisk transport ikke umiddelbart visualiseres grund af den yderligere tid, der kræves for farvestoffet til at nå og tages op af lymfatiske kapillærer i huden. Også på grund af den relativt dybe subkutan injektion, kan der ikke være nogen lymfatiske optagelse og derfor ingen visualisering af beholderne og lymfeknuder. I figur 5 (a), Blev en mus injiceret med 10 pi ICG ved haleroden SC og billeder blev erhvervet 5 minutter efter injektion. Farvestoffet på injektionsstedet kan visualiseres og ingen lymfekar eller lymfeknuder kan visualiseres. Dette er grunden ID injektioner er vigtige. (B) visualisering af dyrets ventrale side af afvigende lymfekar som følge af et sår stødt én dag tidligere under pels fjernelse med trimming (vævsbeskadigelse side noteret på dyrets højre side). Billedet blev taget cirka 5 minutter efter 10 pi ICG blev administreret ID ved basen af ​​halen på hver venstre og højre side. På den ikke-skadede (dyrets venstre) side, kan det inguinal LN visualiseres samt relativt lige efferente lymfe fartøj dræning op mod aksillær LN. På musens højre side, dog blev den normale lymfeknuder kar afbrudt på grund af sårdannelse og synes afvigende på grund af væv reparation (skruebrækkeri).


Figur 6. Kvantitativ analyse af lymfatisk kontraktile funktion består i at vælge ROIs langs lymfekar dræne fra (a) inguinal LN til axillære LN og (d) injektionsstedet på den dorsale aspekt af pote til den popliteale LN. Et forstørret billede (indsat i (a)), i den røde stiplede rektangel illustrerer udvælgelsen af ROIs langs den fluorescerende fartøj. En samling af gennemsnitlig fluorescensintensitet som en funktion af tid for alle ROI'er fra (a) og (d) er repræsenteret ved den pseudo-farve-plot er vist i (b) og (e) hhv. De forstyrrelser i fluorescensintensitet tværs pixels repræsenterer en lymfatisk "puls" formerings gennem ROIs og are parallelt med pilene. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet for enkelt ROI'er 22 og 45 fra (b) er vist i (c) og den gennemsnitlige fluorescensintensitet for enkelt ROI'er 18 og 34 fra (e) er vist i (f). Fluorescensintensitet profiler som en funktion af tiden (som vist i (c) og (f)) lette identifikationen af pakker af formeringsmateriale lymfeknuder og udvinding af transittiden, og afstanden mellem to ROI'er. De to ROI'er vælges delvist baseret på deres placering langs lymfekar og den klarhed, hvormed den maksima og minima repræsenterer lymfe formering er vist. Velocity beregnes som forholdet mellem afstanden mellem to ROI'er og transit tid, der er truffet mellem top fluorescensintensitet. Klik her for at se større figur


Fig. 7. For at visualisere lymfekarrene dræner fra ingvinal region til axillære område, injiceres den venstre eller højre side af haleroden. Generelt, for at visualisere den venstre side injicere i position 5, 6, 9 eller 10, og at visualisere den højre side, injiceres i position 7, 8, 11 eller 12. Steder 1 til 4 kan være for ringe på halen for optimal optagelse at visualisere Lymfedrainage fra ingvinal region til axillary region.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi bruger en brugerdefineret, lille dyr NIRF imaging system til at tage billeder af mærkede lymfekar i mus. For at konstruere film af lymfeknuder bevægelse, er 300 eller flere billeder indsamles. For funktionel analyse af lymfekarrene fra film, er to eller flere ROI'er manuelt trukket langs en lymfeknuder fartøj. Dimensionerne af ROIs holdes konstant for hvert fartøj, og er omtrent diameteren af ​​karret. Mens hele dyr rumlig opløsning kan afbilde fluorescerende lymfekar på 100 mikrometer eller derunder, kan en macrolens for finere opløsning anvendes 10. Hvid-lys billeder for anatomisk reference kan også erhverves ved hjælp af en low-power lampe. Det skal bemærkes, at hvis billeddannende midler er sammensat af andre fluorescerende farvestoffer med forskellige excitations / fluorescensemissionsspektrer, derefter filtrene beskrevet ovenfor bør ændres for at opretholde billedoptagelse, og middel dosis kan være nødvendigt at justere så godt. Også, hvis excitationsbølgelængden er less end 750 nm, så autofluorescens kan resultere, baggrund signal vil stige, og imaging følsomhed vil falde. Derudover kan ustabilitet af agenter i opløsning udelukker anvendelsen af ​​visse NIRF farvestoffer, såsom cyanin 7 (Cy7).

Valget af en egnet injektionsstedet vil afhænge af hvilken lymfekar bliver undersøgt. At visualisere lymfekarrene dræner fra ingvinal region til axillære område, er det nødvendigt at injicere venstre eller højre side af haleroden, som vist i figur 7. For at visualisere lymfevejene dræne fra den statelige region, skal du injicere den dorsale aspekt af den bagpote. Det er vigtigt at holde dyrets kropstemperatur inden for normalområdet, som ændrer legemstemperatur kan føre til inkonsekvent lymfe funktion. Desuden, på grund af det begrænsede dynamiske område for de fleste CCD'er bør injektionsstederne være dækket med sort papir for at blokere fluorescerende lys thereby muliggør visualisering af lysdæmper dræning lymfekar. Billeddannelse skal udføres i et mørkt rum at reducere uønskede baggrundssignaler som følge af emission af lys i fluorescensbånd fra lyset i rummet. Dyret skal også liggende på en sort baggrund, mens billeddannelse der udføres for at reducere lyset tilbagekastning.

NIRF lymfatisk billeddiagnostik kan give en bedre forståelse af lymfatiske sygdomme, og hvordan lymfe arkitektur og funktion ændringer med hensyn til sygdom eller skade. For eksempel har forskerholdet brugte NIRF billeddannelse i små dyr til at give lymfatiske fænotypebestemmelse af dyr 6,15 og for at opdage ændringer i lymfe-funktion og arkitektur med kræft metastaser 10. Hos mennesker er teknikken blevet anvendt til at opdage tidlige tegn på Lymphedema 2, vurderer respons på Lymphedema terapi 13,14,16, og fænotype familiemedlemmer med arvelige lymfesystem. Men ikke-invasiv visualization af dybe lymfevejene (> 3 cm) hos mennesker er begrænset af spredning af lys i væv. Billeder af lymfatiske strukturer op til 3 cm i dybden er erhvervet i svin 9 og menneskelig billeddannelse. Hos mennesker har MRI og dynamisk lymphoscintigraphy blevet anvendt til at kvantificere transittiden af ​​kontrastmiddel fra injektionsstedet til lymfeknuder i sygdom. Men de mangler tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning til at visualisere lymfatiske fremdrift events let afbildet med NIRF. Derudover er raske lymfevejene ikke visualiseret med MRI på grund af manglende kontrast. NIRF billeddannelse er ikke-invasiv i modsætning til konfokal, multiphoton mikroskopi, og intravital billeddannelse. Typisk konfokale og multiphoton mikroskopi teknikker udnytter helt eller delvis resekterede væv. Scintographic metoder kræve brug af radionuklider og til tider mindre fartøj kanyle. En anden metode til at synliggøre lymfevejene involverer intravital billeddannelse, hvor musen eraflivet og dermis trækkes tilbage efter ID injektion af Evans-blåt farvestof. Men denne metode ikke giver funktionel eller langsgående billeddannelse 17,18. LN metastaser kan afbildes under anvendelse af en Siemens Inveon PET / CT, men er denne teknik ikke tillader visualisering af lymfatisk eller-funktion 19.

Mens forfatterne ikke anbefale eller godkende nogen specifik kommerciel billedenhed, vores erfaring viser, at valget af lyskilde og optiske filtre kan være den vigtigste faktor, som bestemmer følsomheden af ​​enheden. Som beskrevet af Zhu et al. For en vellykket afbildning af lave koncentrationer af farvestof, skal der være minimal overlapning mellem emissionsspektret af lyskilden og transmissionsspektret af de optiske filtre 20. En anden vigtig faktor er absorption og emission spektrum af NIRF brugte farvestof. I dette papir ICG og cABD-IRDye800 har lignende speCtra og så beskrevne laserdioden bølgelængde og filterkombinationer kan anvendes for hver, men hvis et andet farvestof skal anvendes som ikke absorberer og / eller fluorescerer ved disse bølgelængder, bør bølgelængden af ​​lyskilden og de optiske filtre være justeres i overensstemmelse hermed. ICG kan være tilstrækkeligt for mange applikationer, og er allerede FDA-godkendt. NIRF-cABD ikke FDA-godkendt til anvendelse i mennesker, men kan være nyttig for dyr billeddannelse. ICG har ikke kemisk forbindelse rester til fastgørelse målsøgningsdele, er så andre fluorescerende midler, såsom NIRF-cABD, under udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har intet at afsløre, men nogle forfattere er noteret på et patent.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud til Eva Sevick: NIH R01 CA128919 og NIH R01 HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats