Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Published 3/08/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

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Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

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Abstract

Das lymphatische Gefäßsystem ist ein wichtiger Bestandteil des Kreislaufsystems, die Flüssigkeitshomöostase unterhält, bietet Immunüberwachung und vermittelt Fettaufnahme im Darm. Doch trotz seiner kritischen Funktion gibt es vergleichsweise wenig Verständnis dafür, wie das lymphatische System passt sich diese Funktionen in Gesundheit und Krankheit 1 dienen. Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, dynamisch image lymphatischen Architektur und Lymphe "Pumpen"-Aktion in normalen menschlichen Probanden sowie Personen, die unter lymphatischen Funktionsstörungen mit trace Verabreichung einer Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Farbstoff und eine benutzerdefinierte gezeigt, Gen III- intensiviert Bildgebungssystem 2-4. NIRF Bildgebung zeigten dramatische Veränderungen in den lymphatischen Architektur und Funktion mit menschlichen Krankheiten. Es bleibt unklar, wie sich diese Veränderungen auftreten und neue Tiermodelle entwickelt, um ihre genetischen und molekularen Grundlagen aufzuklären. In diesem Protokoll präsentieren wir NIRF Lymph-, sMall tierischen Bildgebung mit 5,6 Indocyaningrün (ICG), ein Farbstoff, der für 50 Jahre bei Menschen 7 verwendet wurde, und eine NIRF Farbstoffmarkiertes cyclischen Albumin-Bindungsdomäne (CABD-IRDye800) Peptid, vorzugsweise an Maus und Human-Albumin 8 . Etwa 5,5 mal heller als ICG hat Abd-IRDye800 eine ähnliche lymphatischen Lichtraumprofil und kann in kleineren Dosen als ICG ausreichende NIRF Signale für bildgebende 8 zu erreichen injiziert werden. Da sowohl Abd-IRDye800 und ICG binden an Albumin im interstitiellen Raum 8, können sie sowohl aktive Protein-Transport in die und innerhalb der Lymphgefäße darstellen. Intradermale (ID) Injektionen (5-50 ul) von ICG (645 pM) oder CABD-IRDye800 (200 pM) in Kochsalzlösung werden dorsal jedes Hinterpfote und / oder der linken und rechten Seite der Basis des verabreichten Schwanz eines Isofluran-Narkose Maus. Die resultierende Farbstoffkonzentration im Tier ist 83-1,250 ug / kg für ICG oder 113-1,700 ug / kg für'Abd-IRDye800. Unmittelbar nach Injektionen, wird die funktionale lymphatischen Bildgebung für bis zu 1 Stunde mit Hilfe einer angepassten, kleines Tier NIRF Imaging-System durchgeführt. Ganztier räumliche Auflösung darstellen kann fluoreszierenden Lymphgefäßen von 100 Mikron oder weniger, und Bilder von Strukturen bis zu 3 cm tief erworben 9 werden. Die Bilder werden aufgenommen mit V + +-Software analysiert und mit ImageJ oder MATLAB-Software. Während der Analyse werden aufeinander Regions of Interest (ROI), die die gesamte Gefäßdurchmesser entlang einer vorgegebenen Lymphgefäß gezogen. Die Abmessungen für jeden ROI konstant gehalten werden für ein bestimmtes Schiff und NIRF Intensität für jeden ROI gemessene die quantitative Erfassung "Pakete" von Lymphe Bewegen durch Gefäße.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Standards der University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Abteilung für Vergleichende Medizin und Zentrum für Molekulare Bildgebung nach Prüfung und Genehmigung des Protokolls durch ihre jeweiligen Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss (IACUC) oder Animal Welfare Committee (AWC).

Ein. Vorbereitung der Tiere 24 Stunden vor dem Imaging

Die folgenden Schritte müssen getan (bei ​​Bedarf) am Tag vor lymphatischen Abbildung erfolgt.

  1. Tier in einer Induktion Box und sedate mit Isofluran.
  2. Sobald das Tier in einen Zustand tiefer Narkose (überwachten mit Vorspur Pinch Manöver), Ort sedierten Tieren auf einer Windel / Flusen-Pad und der Position der Nase in einem Nasenkonus verbunden Isofluran Gas.
  3. Clip alle Haare / Fell (falls vorhanden) in der Umgebung abgebildet werden soll.
  4. Bewerben Enthaarungsmittel (NAIR) an der zugeschnittenen und lassen Sie es on die Haut für bis zu 3 min.
  5. Wischen Sie alle Enthaarungsmittel mit warmen, feuchten Gaze oder Papiertuch.
  6. Vorsichtig spülen Sie die Haut mit warmem Wasser und sanft trocknen Sie den Bereich mit Gaze oder einem Papiertuch.
  7. Damit sich die Tiere auf einem Heizkissen oder unter einer Wärmelampe zu erholen, und kehren zu ihrem Käfig.

2. Day of Imaging

  1. Rekonstituieren Bildgebungsmittel mit sterilem Wasser, dann verdünnt mit sterilem, normal (0,85%) Salzlösung bis 645 pM (5 &mgr; g/10 ul) für ICG oder 200 pM (6,8 &mgr; g/10 ul) zum CABD-IRDye800 erreichen. Halten Lösungen im Dunkeln Bedingungen und innerhalb von 6 Stunden nach der Rekonstitution.
  2. Tier in einer Induktion Box und sedate mit Isofluran.
  3. Sobald das Tier in einen Zustand tiefer Narkose (überwacht mit Toe-Prise Manöver), Ort sedierten Tier auf einer Seite auf eine Windel / Flusen Pad und Position Nase in einem Nasenkonus mit Gas Isofluran.
  4. Schalten Sie das Licht (so der Raumdunkel). Falls erforderlich, kann ein kleiner Schreibtisch Halogenlicht für eine geringe Lichtmenge auf Injektionen siehe verwendet werden.
  5. Verwendung eines Insulin-Spritze mit einer 31-Gauge-Nadel, injizieren ID 5 bis 50 ul ul ICG-oder CABD IRDye800 im dorsalen jedes Hinterpfote und / oder auf der linken und rechten Seite der Basis des Schwanzes, abhängig von der Bereich von Interesse (siehe Diskussion). Jede Dosis kann injiziert 0,083-1,25 mg / kg (ICG) oder 0,113 bis 1,7 mg / kg (CABD-IRDye800) reichen. Injektionsvolumina wird mit tierischen Anspannung und Injektionsstelle variieren. Für athymischen Mäusen, kann das Volumen der Einspritzung 5 ul (Hinterpfote) oder 10 ul (Rutenansatz) sein. Wenn das Tier nicht unter dem Bildgebungssystem für die Injektion (en) werden die Tiere unter dem Bildgebungssystem unmittelbar nach dem Injektion (en).
  6. Wenn keine Farbstoffaufnahme in die Lymphbahnen zu sehen ist, wird Schritt 2.5 wiederholt zu werden brauchen, wie pro Tier-Protokoll benötigt.
  7. Sobald Lymphbahnen zu sehen sind, die Injektionsstelle mit schwarzem Isolierband oder schwarz paper.
  8. Erwerben lymphatischen Bilder für bis zu 1 Stunde unter Verwendung von V + +-Software und ein kleines Tier, NIRF Bildgebungssystems. (Tiere mit Isofluran sediert und Respirationen werden überwacht, während Bilder zu erwerben sind.) Während kleine Tier, NIRF Imager sind kommerziell erhältlich, nutzen wir eine angepasste Kleintier NIRF Abbildungssystem, bestehend aus einem 785-nm-Laserdiode (1005-9mm-78.503 , Intense, North Brunswick, NJ) mit einer asphärischen Linse (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), Diffusor (ED1-C20, Thorlabs) ausgestattet, und Filter (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ), um eine gleichmäßige Anregung Feld, das Tier mit einem Einfallswinkel beleuchtet Fluenz von weniger als 1,4 mW pro Quadratzentimeter 10. Ein Elektron Multiplikation Charged-Coupled-Gerät (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ)-Kamera-System mit zwei 830-nm-Filter (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) und einem 28-mm-Nikkor-Objektiv (1992, Nikon, Melville, NY) verwendet, um Bilder mit lymphatischen Integration tim einzufangenes von 200 ms für dynamische Bildgebung und 800 ms für statische Bildgebung 5. Siehe Abbildung 1 für die Systemkonfiguration, die Tabelle für weitere Details der einzelnen Komponenten und die Diskussion für eine kurze Diskussion der wichtigsten Imager Eigenschaften.
  9. Damit sich die Tiere auf einem Heizkissen oder unter einer Wärmelampe erholen und wieder in ihren Käfig oder einschläfern.
  10. Analysieren von Bildern mit ImageJ oder MATLAB-Software. Siehe Abbildung 6.

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Representative Results

Beispiel für NIRF Lymphatische Imaging in Mäuse

Wenn ICG-oder CABD IRDye800 ID wird an der Basis des Schwanzes einer normalen Maus injiziert, sollte das lymphatische Gefäßsystem zwischen der Injektionsstelle an der Basis des Schwanzes und des inguinale Lymphknoten (LN) unmittelbar visualisiert. Kurz nach der Injektion (ein paar Sekunden bis Minuten), sollte die Lymphgefäße zwischen der Leistengegend LN und der axillären LN visualisiert werden, wie in Abbildung 2 zu sehen. Da die Lymphgefäße in Mäusen von Tier zu Tier variieren, da sie beim Menschen tun, können Unterschiede in der Architektur zwischen Tieren beobachtet, wie in 3 gezeigt. Wenn ICG oder NIRF-CABD ID basiert auf der Dorsalseite der Hinterpfote einer normalen Maus injiziert wird, kann zwei Lymphgefäße visualisiert werden Entleeren der Kniekehle LN, wie in Abbildung 4 dargestellt. In einigen Fällen ist es schwierig, beide Gefäße wegen ihrer engen Nähe zueinander unterscheiden.

Manchmal wird Visualisierung der Lymphgefäße verzögert, am häufigsten durch die Injektion subkutan verabreicht wird (SC) anstelle von ID. Wenn SC Injektionen verabreicht werden kann Lymphtransports nicht sofort sichtbar, wie in 5 (a) gesehen wegen der zusätzlichen Zeit, erforderlich für den Farbstoff zu erreichen und von der lymphatischen Kapillaren entnommen werden in der Haut. Deshalb ist es wichtig, ID anstelle des SC injizieren. Gelegentlich werden abnormale Lymphgefäße beobachtet, wie in Abbildung 5 (b) gesehen, im Bereich einer Wunde wie ein Biss oder Ausschneiden aus dem Haar / Fell Clippers. Der Körper des Tieres Temperatur sollte im normalen Bereich beibehalten werden, die wechselnden Körpertemperatur zu inkonsistenten lymphatischen Funktion führen. Einschränkungen der Technik gehören Verdunkelung des fluoreszierenden Lymphgefäße durch die Pigmentierung der Haut, die Unfähigkeit, Bild, Die tiefen thorakalen Lymphgänge aufgrundStreuung im Gewebe leuchtet, und die unbekannte Wirkung der Narkose auf lymphatischen Funktion.

Im Allgemeinen dauert es die ID Depot oder ICG-CABD IRDye800 bis 2 Tage, um die Leber und die Blase zu deaktivieren, und bis zu 3 Tagen, um die Injektionsstelle zu löschen. Beim Rest-Fluoreszenzsignal wurde kann das bildgebende Protokoll wiederholt werden, so dass längs lymphatischen Bildgebung auf Veränderungen in der Architektur oder Lymphe Funktion nach einiger Intervention zu evaluieren.

Analyse der lymphatischen Funktion

Die aufgenommenen Bilder können in ImageJ oder MATLAB für die Datenanalyse geladen werden. Konstantspannungs-Bereich werden kreisförmigen ROIs ausgewählt oder "gezogen" entlang der gesamten Länge des fluoreszierenden Lymphgefäß als für den menschlichen und tierischen 10 5 lymphatischen Bildgebung durchgeführt wie in den 6 (a) und 6 (d) gezeigt. Die ROIs so gewählt sind, dass ihr Durchmesser annähernd dem Durchmesser des Bildes der Fluoreszenznt Gefäß. Die mittlere Fluoreszenzintensität innerhalb jeder ROI wird als Funktion der Zeit, um die Bildgebung propulsive Geschwindigkeit und die Häufigkeit von "Paketen" von farbstoffbeladenen Lymphe beurteilen aufgetragen angetrieben entlang der Lymphgefäße wie in den 6 (b) und 6 gezeigt (e ). Um das lymphatische Ausbreitungsgeschwindigkeit und Häufigkeit der lymphatischen Vortrieb zu beurteilen, werden zwei ROIs mit klar definierten Maxima oder Minima Fluoreszenzintensität Variationen, die die Ausbreitung von Paketen von Lymphe, ausgewählt sind und ihre Fluoreszenzintensität Profilen aufgetragen wie in den 6 (c) gezeigt und 6 (f). Die Ausbreitungsgeschwindigkeit wird, indem das Verhältnis des Abstandes zwischen den beiden ROIs und der Laufzeit für ein Paket von Lymphe, um zwischen ihnen ausbreiten berechnet. Durch Bewertung der Anzahl von Pulsen oder fluoreszierende "Pakete" Erreichung einer einzigen ROI pro Zeit wird die kontraktilen Frequenz berechnet. Während diese Technik bietet die einzige Methode, um Assess Vortrieb Frequenz und Geschwindigkeit eines angetriebenen lymphatischen "Pakets" andere haben Lymphtransports indirekt durch Messen der Depot Clearance eines bildgebenden Mittels ausgewertet und somit Berechnen Entfernen Geschwindigkeitskonstanten 11. In Metastasen 10 und frühe Infektion, finden wir Verlust von lymphatischen Vortrieb bei Tieren. Andere berichten Veränderungen in Kontraktilität in Reaktion auf Arthritis 12. Beim Menschen berichten wir erhöhte Antriebs nach Lymphödem Behandlungen einschließlich pneumatische Kompression Drainage 13 und manuelle Lymphdrainage (Massage) 14.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die NIRF Bildgebungssystem custom-built für kleine Tier lymphatischen Bildgebung. Die Vorrichtung besteht aus einer 785-nm-Laserdiode mit einer asphärischen Linse, diffus ausgestattetener, und Filtern, um eine gleichmäßige Anregung Feld, das den Tieren und eine Kamera EMCCD beleuchtet erstellen, Fokussierlinse und optischen Filtern, um die Aufnahme von fluoreszierenden Lymphe 10.

Abbildung 2
Abbildung 2. Bei 10 pl oder ICG-CABD IRDye800 wird ID an der Basis des Schwanzes einer normalen Maus unter Verwendung einer 31-Gauge-Nadel, das lymphatische Gefäßsystem zwischen der Injektionsstelle an der Basis des Schwanzes und des Leistenlymphknoten LN eingespritzt sollten sofort visualisiert. Dynamische Fluoreszenzbilder werden unmittelbar nach der Injektion und für bis zu 20 min nach der Injektion gewonnen. Kurz nach der Injektion (ein paar Sekunden bis Minuten), sind Lymphgefäße zwischen der Injektionsstelle und der Leistengegend LN und anschließend in den axillären LN Region visualisiert auf der seitlichen Ansicht. Das Bild in 2 gezeigt wurde 5 min genommen. nach Injektion with 10 ul von ICG ID an der Basis des Schwanzes. Der helle Fleck zwischen den Leisten und Achselbereiche ist die Leber.

Abbildung 3
Abbildung 3. Da die Lymphgefäße in Mäusen von Tier zu Tier variieren, da sie beim Menschen tun, können Unterschiede in der Architektur zwischen Tieren beobachtet werden und ist über die Zeit stabil. Maus # 124 wurde mit ICG an der Basis des Schwanzes injiziert und abgebildet unmittelbar am 1. Tag. Das obere Feld enthält das Bild an Tag 1 sowie einem Bild erhaltene 2 Tage später (am Tag 3) unter Verwendung der gleichen Maus und Einspritz / Bildgebungsprotokoll erhalten. Die Bodenplatte enthält Bilder aus einer anderen Maus (# 127) mit ICG und sofort abgebildet Tag 1 und anschließend auf Tag 3 abgebildet injiziert erhalten. Während die lymphatische Architektur (das Muster der Lymphgefäße) variiert zwischen moVerwenden # 124 und # 127 sind die Bilder unter Verwendung NIRF konsistent für jede Maus an den Tagen 1 und 3.

Abbildung 4
Abbildung 4. Bei 5-10 ul ICG oder NIRF-CABD ID basiert auf der Dorsalseite der Hinterpfote einer normalen Maus injiziert, sollten zwei Lymphgefäße visualisiert werden Entleeren der Kniekehle LN. Dynamische Fluoreszenzbilder werden unmittelbar nach der Injektion und für bis zu 20 min nach der Injektion gewonnen. In einigen Fällen ist es schwierig, beide Gefäße wegen ihrer Nähe zu unterscheiden, wie in dem vergrößerten Bild durch den gestrichelten Kasten dargestellt veranschaulicht. Für die repräsentative Maus hier dargestellt wurden 10 ul ICG im dorsalen Aspekt der linken Hinterpfote (erste Injektionsstelle) und in der linken Seite des hinteren Bodens (zweite Injektionsstelle) injiziert. Dieses Bild war ca.ptured ca. 2 - 3 min nach der ersten Injektion und ungefähr 30 s - 1 min nach der zweiten Injektion.

Abbildung 5
Abbildung 5. (A) Gelegentlich Visualisierung der Lymphbahnen, verzögert oder beeinträchtigt, am häufigsten durch die Injektion verabreicht SC statt ID. Wenn 10 ul ICG-oder CABD IRDye800 eingespritzt wird SC an der Basis des Schwanzes einer normalen Maus unter Verwendung einer 31-Gauge-Nadel wird Lymphtransports nicht sofort sichtbar, weil der zusätzliche Zeit für den Farbstoff, die zur Erreichung und genommen werden vom lymphatischen Kapillaren in der Haut. Auch aufgrund des verhältnismäßig tiefen SC Injektion kann es keine lymphatische Aufnahme und daher keine Visualisierung der Gefäße und Lymphknoten sein. In 5 (a), Wurde eine Maus mit 10 ul ICG an der Basis des Schwanzes SC und Bilder wurden 5 min nach der Injektion injiziert. Der Farbstoff an der Injektionsstelle visualisiert werden kann und keine Lymphgefäße und Lymphknoten visualisiert werden kann. Dies ist der Grund ID Injektionen sind wichtig. (B) Darstellung von Bauchseite Tieres aberranter Lymphgefäße, die aus einer Wunde einen Tag vorher angetroffen während pelz Entfernen mit Haarschneidemaschine (Gewebeverletzungsstelle angemerkt auf der rechten Seite des Tieres). Das Bild wurde etwa 5 min nach 10 ul ICG erfasst wurde ID an der Basis des Schwanzes auf jeder der linken und rechten Seite verabreicht. Auf der nicht verletzten (Tieres linken) Seite kann der Leistengegend LN visualisiert werden sowie die relativ gerade efferenten Lymphgefäß Entleeren nach oben in Richtung der Achsel LNs. Auf der Maus rechts, jedoch wurde der Normalwert Lymphknoten Gefäßsystem unterbrochen durch Verwundung und erscheint aberrante aufgrund von Gewebereparatur (Schorfbildung).


Abbildung 6. Quantitative Analyse der lymphatischen kontraktile Funktion besteht aus der Auswahl ROIs entlang der Lymphgefäße Entwässerung aus (a) der Leistengegend LN zur axillären LN und (d) der Injektionsstelle auf der Dorsalseite der Pfote an der Kniekehle LN. Ein vergrößertes Bild (Einschub in (a)) des roten gestrichelten Rechteck veranschaulicht die Auswahl der ROIs entlang der fluoreszierenden Behälter. Eine Zusammenstellung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität als eine Funktion der Zeit für alle ROIs aus (a) und (d) von der Pseudo-Farbdarstellung in (b) und (e) jeweils ausgewiesenen Werten. Die Störungen in der Fluoreszenzintensität in Pixel stellen eine lymphatische "Impuls" die sich durch den ROIs und arE parallel zu den Pfeilen. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität für einzelne ROIs 22 und 45 aus (b) in (c) und der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität für einzelne ROIs 18 und 34 aus (e) in (f) gezeigt ist. Fluoreszenzintensität Profile als Funktion der Zeit die Identifizierung von Paketen von Vermehrungsmaterial Lymphe und der Extraktion von der Laufzeit und Abstand zwischen zwei ROIs (wie in (c) und (f) gezeigt). Die beiden ROIs werden basierend teilweise auf ihre Position entlang der Lymphgefäß und der Klarheit mit denen die Maxima und Minima darstellt Lymphe Ausbreitungsrichtung dargestellt ausgewählt ist. Die Geschwindigkeit wird definiert als das Verhältnis des Abstandes zwischen zwei ROIs und der Laufzeit, die zwischen Peak Fluoreszenzintensität genommen wird berechnet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen


Abbildung 7. Um die Lymphbahnen Entwässerung aus der Leistengegend der axillären Region visualisieren, injizieren die linke oder rechte Seite der Basis des Schwanzes. Im Allgemeinen, um die linke Seite visualisieren, in Position 5, 6, 9 oder 10 zu injizieren, und um die rechte Seite visualisieren, in Position 7 einzuspritzen, 8, 11 oder 12 ist. Standorte 1 bis 4 kann zu minderwertigen am Heck für optimale Aufnahme zu Lymph-Drainage aus der Leistengegend der axillären Region visualisieren.

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Discussion

Wir verwenden eine benutzerdefinierte, kleines Tier NIRF Imaging-System, um Bilder von markierten Lymphgefäße in Mäusen zu erfassen. Um Filme von Lymphe Bewegung konstruieren, sind 300 oder mehr Bilder gesammelt. Zur funktionellen Analyse der Lymphbahnen aus Filmen, werden zwei oder mehr ROIs manuell entlang einer Lymphgefäß gezogen. Die Abmessungen des ROIs konstant gehalten werden für jedes Schiff sind und etwa den Durchmesser des Gefäßes. Während ganze Tier räumliche Auflösung fluoreszierende Lymphgefäße von 100 Mikron oder weniger darstellen kann, kann ein Makroobjektiv für feinere Auflösung 10 eingesetzt werden. Weißlicht-Bilder für anatomische Referenz kann auch erworben mit einem Low-Power-Lampe werden. Es sollte beachtet werden, dass, wenn Bildgebungsmittel anderer Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs / Fluoreszenzemissionsspektren, dann werden die oben beschriebenen Filter bestehen müssen geändert werden, um Abbildungsleistung aufrechtzuerhalten und-Arzneiform muss möglicherweise angepasst als gut. Auch, wenn die Anregungswellenlänge ist less als 750 nm, dann Autofluoreszenz führen kann, Hintergrund-Signal wird zunehmen, und Imaging-Empfindlichkeit zu verringern. Zusätzlich kann Instabilität der Wirkstoffe in Lösung schließt die Verwendung von einigen NIRF Farbstoffe, wie Cyanin 7 (Cy7).

Auswahl der geeigneten Injektionsstelle wird auf welcher Lymphgefäße werden untersucht abhängen. Um die Lymphbahnen Entwässerung aus der Leistengegend der axillären Region visualisieren, müssen Sie die linke oder rechte Seite der Basis des Schwanzes zu injizieren, wie in Abbildung 7 dargestellt. Um die Lymphbahnen Entleerung aus dem palastartigen Region visualisieren, müssen Sie die Dorsalseite der Hinterpfote injiziert. Es ist wichtig, den Körper des Tieres Temperatur im normalen Bereich zu halten, wie das Ändern der Körpertemperatur zu inkonsistenten lymphatischen Funktion führen kann. Darüber hinaus wegen der begrenzten Dynamikbereich der meisten CCDs, sollten die Injektionsstellen mit schwarzem Papier abgedeckt werden, um Fluoreszenzlicht zu blockieren thereby ermöglicht Visualisierung von Dimmer Entleerung Lymphgefäße. Imaging sollte in einem dunklen Raum durchgeführt werden, um unerwünschte Hintergrundsignale aufgrund der Emission von Licht in der Fluoreszenz Band aus den Raumbeleuchtung reduzieren. Das Tier muss auch auf einem schwarzen Hintergrund zu liegen, während Bildgebung durchgeführt wird, um das Licht Backscatter reduzieren.

NIRF lymphatischen Bildgebung ermöglichen ein besseres Verständnis der lymphatischen Erkrankungen und wie lymphatischen Architektur und Funktion Änderungen in Bezug auf Krankheit oder Verletzung. Zum Beispiel hat das Forschungsteam NIRF Bildgebung bei Kleintieren zur lymphatischen Phänotypisierung von Tieren 6,15 zu geben und Veränderungen in der lymphatischen Funktion und Architektur mit Metastasen 10 zu erkennen. Beim Menschen hat die Technik verwendet worden, um frühe Anzeichen für ein Lymphödem 2 zu erfassen, zu bewerten Antwort auf Lymphödem-Therapie 13,14,16 und Phänotyp Familienmitglieder mit erblichen Lymphsystems. Jedoch nichtinvasiven visualisierung tiefen Lymphgefäße (> 3 cm) beim Menschen wird durch die Streuung des Lichts im Gewebe beschränkt. Bilder der lymphatische Strukturen bis zu 3 cm tief in Schweinen 9 und menschlichen Bildgebung erworben. Beim Menschen wurden MRI und dynamischen Lymphoszintigraphie verwendet worden, um die Transitzeit des Kontrastmittels von der Injektionsstelle zu den Lymphknoten in Krankheit quantifizieren. Allerdings fehlen ihnen ausreichende zeitliche und räumliche Auflösung, die lymphatischen Vortrieb Ereignisse leicht mit NIRF abgebildet visualisieren. Darüber hinaus sind gesund Lymphgefäße nicht visualisiert mit MRT aufgrund mangelnder Kontrast. NIRF Bildgebung ist nicht-invasiv, anders als konfokales, Multiphoton-Mikroskopie und intravitalen Bildgebung. Typischerweise konfokale und Multiphotonen Mikroskopie-Techniken nutzen, ganz oder teilweise reseziert Gewebe. Scintographic Methoden erfordern den Einsatz von Radionukliden und manchmal kleinere Behälter Kanülierung. Eine andere Methode, um die Lymphbahnen visualisieren beinhaltet intravital Bildgebung während denen sich die Mauseuthanasiert und die Dermis wieder nach ID Injektion von Evans blauen Farbstoff gezogen. Allerdings ist diese Methode nicht bieten funktionale oder Längs-Imaging 17,18. LN Metastasen abgebildet mit einem Siemens Inveon PET / CT werden, aber diese Technik nicht die Visualisierung des lymphatischen Struktur oder Funktion 19.

Während die Autoren nicht empfehlen noch eine Empfehlung für die spezifischen kommerziellen Bildgebungsvorrichtung, zeigt unsere Erfahrung, dass die Wahl der Lichtquelle und optische Filter kann der wichtigste Faktor, der die Empfindlichkeit des Gerätes bestimmt werden. Wie von Zhu et al., Für eine erfolgreiche Bildgebung von geringen Konzentrationen an Farbstoff, muss es minimale Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum der Lichtquelle und dem Sendespektrum der optischen Filter 20 sein. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Absorptions-und Emissionsspektrum des NIRF Farbstoff verwendet. In diesem Papier ICG und 'Abd-IRDye800 haben ähnliche spectra und so die beschriebene Laserdiodenwellenlänge und Filter-Kombinationen können für jede verwendet werden, aber wenn ein anderer Farbstoff verwendet, die nicht absorbieren und / oder fluoreszieren bei diesen Wellenlängen ist, die Wellenlänge der Lichtquelle und die optischen Filter sollte entsprechend angepasst. ICG kann für viele Anwendungen ausreichend, und ist bereits FDA-Zulassung. NIRF-CABD ist nicht für den Einsatz beim Menschen FDA-zugelassen, kann aber für tierische Bildgebung nützlich. ICG keine chemische Koppelungsgruppe Rückstände zum Anbringen Zieleinheiten, sind so andere fluoreszierende Mittel, wie NIRF-CABD, entwickelt.

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Disclosures

Autoren haben nichts zu offenbaren, aber einige Autoren auf einem Patent aufgeführt.

Acknowledgements

NIH R01 CA128919 und NIH R01 HL092923: Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien an Eva Sevick unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

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References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

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