Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

Published 3/08/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Recentemente técnicas de imagem desenvolvidos utilizando fluorescência no infravermelho próximo (NIRF) pode ajudar a elucidar a função do sistema linfático desempenha na metástase do cancro, a resposta imune, reparação de feridas, e outras doenças associadas linfático.

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Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

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Abstract

O sistema vascular linfático é um componente importante do sistema circulatório, que mantém a homeostase de fluidos, proporciona vigilância imune, e medeia a absorção de gordura no intestino. No entanto, apesar de sua função crítica, há relativamente pouco entendimento de como o sistema linfático se adapta para servir estas funções na saúde e na doença 1. Recentemente, demonstramos a capacidade de arquitetura dinamicamente imagem linfática e linfa "bombear" ação em indivíduos normais, bem como em pessoas que sofrem de disfunção linfática usando a administração traço de um infravermelho próximo fluorescente corante (NIRF) e um costume, Gen III- intensificou imagens do sistema 2-4. NIRF imagem mostrou mudanças dramáticas na arquitetura linfática e função com a doença humana. Ainda não está claro como essas mudanças ocorrem e novos modelos animais estão sendo desenvolvidas para elucidar a sua base genética e molecular. Neste protocolo, apresentamos NIRF linfático, sMall animais imagiologia 5,6 utilizando verde de indocianina (ICG), um corante que tem sido utilizado há 50 anos em humanos 7, e um corante NIRF marcado albumina domínio de ligação cíclica (CABD-IRDye800) péptido que se liga preferencialmente de rato e humano 8 albumina . Aproximadamente 5,5 vezes mais brilhante do que ICG, Abd-IRDye800 tem um perfil semelhante linfático e depuração pode ser injectada em doses menores do que os sinais de ICG para realizar NIRF suficientes para imagiologia 8. Porque se ligam CABD-IRDye800 ICG e de albumina no espaço intersticial 8, que tanto pode representar o transporte de proteínas activas para dentro e para dentro dos vasos linfáticos. Intradérmica (ID) injecções (ul 5-50) de ICG (645 uM) ou CABD-IRDye800 (200 fiM) em solução salina são administrados para o aspecto dorsal de cada pata traseira e / ou no lado esquerdo e direito da base do cauda de um rato anestesiado com isoflurano-. A concentração do corante, resultando em que o animal é 83-1,250 ug / kg para o ICG ou 113-1,700 mg / kg paraAbd-IRDye800. Imediatamente após as injeções, imagem funcional linfática é realizada por até 1 hora usando um personalizado, pequenos animais NIRF sistema de imagem. Resolução espacial animal inteiro pode descrever vasos linfáticos fluorescentes de 100 microns ou menos, e as imagens de estruturas até 3 cm de profundidade podem ser adquiridos 9. As imagens são adquiridas usando V + software + e analisados ​​usando ImageJ ou software MATLAB. Durante a análise, as regiões consecutivos de interesse (ROIs) abrangendo o diâmetro do vaso inteiro são atraídos ao longo de um vaso linfático dado. As dimensões de cada ROI são mantidas constantes para um dado navio e intensidade NIRF é medido para cada ROI para avaliar quantitativamente "pacotes" de linfa em movimento através dos vasos.

Protocol

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com as normas da Universidade do Texas Health Science Center (Houston, TX), Departamento de Medicina Comparativa e Centro de Imagem Molecular, após análise e aprovação do protocolo pelo seu respectivo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) ou Comitê de Bem-Estar Animal (CTA).

1. Preparação de Animais 24 horas antes da imagem

Os passos a seguir deve ser feito (conforme necessário) um dia antes de imagem linfática ocorre.

  1. Lugar animal em uma caixa de indução e tranqüilo com isoflurano.
  2. Uma vez que o animal se encontra num estado de anestesia profunda (monitorizado com dedo do pé pinch-manobra), animal sedado lugar sobre uma almofada de tecido / fluff e nariz posição em um cone de nariz ligada a gás isofluorano.
  3. Clipe todo o cabelo / pele (se houver) em torno da área a ser trabalhada.
  4. Aplicar depilatório agente (NAIR) para a área cortada e deixá-lo ón a pele por até 3 min.
  5. Limpe suavemente todo agente depilatório com gaze, quente e úmido ou toalha de papel.
  6. Lave a pele com água morna e seque a área gentilmente com gaze ou toalha de papel.
  7. Permitir que os animais se recuperar em uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor, e voltar para sua gaiola.

2. Dia da Imagem

  1. Reconstituir agente de imagem com água esterilizada, em seguida, dilua com estéril, normal (0,85%) de solução salina para obter 645 uM (5 μg/10 ul) para ICG ou 200 uM (6,8 ul μg/10) para CABD-IRDye800. Mantenha em soluções escuro condições de uso e dentro de 6 horas de reconstituição.
  2. Lugar animal em uma caixa de indução e tranqüilo com isoflurano.
  3. Uma vez que o animal se encontra num estado de anestesia profunda (monitorizado com dedo do pé pinch-manobra), animal sedado lugar no seu lado sobre uma almofada de tecido / fluff e nariz posição em um cone de nariz ligada a gás isofluorano.
  4. Desligue as luzes (de modo que o quarto éescuro). Se necessário, uma luz de halogéneo pequena mesa pode ser usada para uma pequena quantidade de luz para ver injecções.
  5. Utilizando uma seringa de insulina com uma agulha de 31-gauge, injectar ul ID 5 a 50 ul de ICG ou CABD-IRDye800 no aspecto dorsal de cada pata traseira e / ou no lado esquerdo e direito da base da cauda, ​​dependendo a área de interesse (ver Discussão). Cada dose injectada pode variar 0,083-1,25 mg / kg (ICG) ou 0,113-1,7 mg / kg (CABD-IRDye800). Os volumes de injecção irá variar com a estirpe de animais e no local de injecção. Para ratinhos atímicos, o volume de injecção pode ser 5 (pata traseira) ul ou 10 ul (base da cauda). Se um animal não está sob o sistema de imagem para a injecção (s), colocar o animal no âmbito do sistema de imagem imediatamente após o injecção (ões).
  6. Se nenhuma absorção do corante é visto nos vasos linfáticos, passo 2,5 terá de ser repetido conforme necessário por protocolo animal.
  7. Uma vez linfáticos são vistos, cobrir o local da injecção com fita isolante preta ou preta papor.
  8. Adquirir imagens linfáticos por até 1 hora usando V + + software e um animal pequeno, NIRF sistema de imagem. (Os animais são sedados com isoflurano e respiração são monitoradas enquanto as imagens estão adquirindo.) Embora pequeno animal, imagers NIRF estão comercialmente disponíveis, nós utilizamos um personalizado, pequenos animais NIRF sistema de imagens composto por um diodo laser 785-nm (1005-9mm-78503 , intenso, North Brunswick, NJ) equipada com uma lente asférica (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), o difusor (ED1-C20, Thorlabs) e do filtro (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) para criar um campo de excitação uniforme que ilumina o animal a uma taxa de fluência incidente de menos de 1,4 mW por centímetro quadrado 10. Um elétron multiplicando cobrado-coupled device (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) sistema de câmera com duas 830 nm filtros (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) e um de 28 mm lente Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) é usado para capturar imagens linfáticos com integração times de 200 ms para imagens dinâmicas e 800 mseg para imagiologia estático 5. Veja a Figura 1 para configuração do sistema, a tabela para obter detalhes adicionais de cada componente, e da discussão para uma breve discussão sobre as propriedades imager chave.
  9. Permitir que os animais se recuperar em uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor e voltar para sua gaiola, ou eutanásia.
  10. Analisar imagens usando ImageJ ou software MATLAB. Veja Figura 6.

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Representative Results

Exemplo de NIRF imagem linfática em Ratos

Quando ICG ou CABD-IRDye800 é injectado ID na base da cauda de um rato normal, a vasculatura linfática entre o local da injecção na base da cauda e do nó de linfa inguinal (LN) deve ser imediatamente visualizado. Pouco tempo após a injecção (de alguns segundos a minutos), o vaso linfático entre o LN LN inguinal e axilar deve ser visualizado, como visto na Figura 2. Uma vez que os vasos linfáticos em ratinhos variar de animal para animal, tal como o fazem em seres humanos, a variação na arquitectura entre os animais podem ser vistos como mostrado na Figura 3. Quando ICG ou NIRF-CABD é injectado ID no aspecto dorsal da pata traseira de um rato normal, dois vasos linfáticos de drenagem pode ser visualizado para o LN poplítea como mostrado na Figura 4. Em alguns casos, é difícil distinguir os dois vasos, devido à sua grande proximidade umas com as outras.

Por vezes, a visualização dos vasos linfáticos é atrasada, mais geralmente, devido à injecção ser administrada por via subcutânea (SC), em vez de ID. Quando as injecções são dadas SC, transporte linfático pode não ser imediatamente visualizado como pode ser visto na Figura 5 (a), por causa do tempo adicional necessário para o corante para alcançar e ser absorvido pelo capilares linfáticos na pele. É por isso que é importante para injetar ID em vez de SC. Em certas ocasiões, os vasos linfáticos anormais são observados, como pode ser visto na Figura 5 (b), na área de uma ferida tal como uma picada ou corte dos cortadores de cabelo / pele. Temperatura do corpo do animal deve ser mantido dentro da gama normal, tal como alterar a temperatura corporal pode resultar em função linfática inconsistente. Limitações da técnica incluem obscurecimento dos vasos linfáticos fluorescentes pela pigmentação da pele, a incapacidade de imagem dos canais linfáticos profundos torácica devidoa dispersão da luz no tecido, e o efeito desconhecido de anestesia em função linfática.

Geralmente, leva ao depósito de ID ou CABD ICG-IRDye800 até 2 dias para limpar o fígado e da bexiga, e até 3 dias para limpar o local de injecção. Quando o sinal de fluorescência residual foi eliminada, o protocolo de imagens pode ser repetida, o que permite imagiologia linfático longitudinal para avaliar alterações na arquitectura ou função linfa após alguma intervenção.

Análise da Função linfática

As imagens adquiridas podem ser carregados no ImageJ ou MATLAB para análise de dados. Área constante, circular ROIs são seleccionadas ou "tirar" ao longo de todo o comprimento do vaso linfático fluorescente como se fez para imagiologia linfático humano e animal 5 10, como mostrado nas Figuras 6 (a) e na Figura 6 (d). O ROIs são seleccionados de tal modo que o seu diâmetro é de aproximadamente o diâmetro da imagem da fluorescêncianavio NT. A intensidade média de fluorescência dentro de cada ROI é representado graficamente como uma função do tempo de imagem para avaliar a velocidade de propulsão ea frequência de "pacotes" de corante carregado de linfa impelido ao longo dos vasos linfáticos, como mostrado nas Figuras 6 (b) e Figura 6 (e ). Para avaliar a velocidade de propagação linfática e frequência de propulsão linfático, dois ROI, com valores máximos claramente definida ou variações de intensidade minima fluorescentes que representam a propagação de pacotes de linfa, são seleccionados e os seus perfis de intensidade de fluorescência são representados graficamente como se mostra nas Figuras 6 (c) e 6 (f). A velocidade de propagação é calculado tomando a razão entre a distância entre os dois ROI e o tempo de trânsito para um pacote de linfa para propagar entre eles. Ao analisar o número de pulsos fluorescentes ou "pacotes" que chegam a um ROI único por tempo, a freqüência contrátil é computado. Embora esta técnica proporciona o único método para assess freqüência de propulsão e velocidade de uma propulsão linfática "pacote", outros têm avaliado indiretamente transporte linfático, medindo a distância do depósito de um agente de imagem e, assim, calcular constantes de taxa de remoção de 11. Em metástases do câncer 10 e infecção precoce, encontramos perda de propulsão linfático em animais. Outros relatam mudanças na contratilidade em resposta a artrite 12. Nos seres humanos, nós relatamos propulsão aumentou após tratamentos linfedema, incluindo drenagem pneumática compressão 13 e drenagem linfática manual (massagem) 14.

Figura 1
Figura 1. NIRF O sistema de imagem é custom-built para imagens de pequenos animais linfático. O dispositivo é constituído por um díodo de laser 785-nm equipado com uma lente asférica, diffuser, e filtros para criar um campo de excitação uniforme que ilumina o animal e uma câmera, lente com foco EMCCD e filtros ópticos para capturar imagens de linfa fluorescente 10.

Figura 2
Figura 2. Ao 10 ul de ICG ou CABD-IRDye800 é injectado ID na base da cauda de um rato normal, utilizando uma agulha de 31-gauge, a vasculatura linfática entre o local da injecção na base da cauda e da linfa inguinal LN deve ser imediatamente visualizado. Dinâmicos imagens de fluorescência são adquiridos imediatamente após a injecção e por até 20 min após a injecção. Pouco tempo após a injecção (de alguns segundos a minutos), os vasos linfáticos entre o local de injecção e o LN inguinal e, subsequentemente, para a região axilar LN são visualizados na vista lateral. A imagem mostrada na Figura 2 foi tomada 5 min. após a injecção wiul dia 10 de ICG ID na base da cauda. O ponto brilhante entre as regiões inguinais e axilares é o fígado.

Figura 3
Figura 3. Uma vez que os vasos linfáticos em ratinhos variar de animal para animal, tal como o fazem em seres humanos, a variação na arquitectura entre animais pode ser visto e é estável ao longo do tempo. Mouse # 124 foi injectado com o ICG, na base da cauda e fotografada imediatamente no dia 1. O painel de topo contém a imagem obtida no dia 1, assim como uma imagem obtida 2 dias mais tarde (dia 3), utilizando o mesmo rato e injecção / protocolo de geração de imagens. O painel inferior contém as imagens obtidas a partir de um outro ratinho (n º 127), injectada com ICG e dia imediatamente visualizado 1 e posteriormente visualizados no dia 3. Embora a arquitectura linfático (o padrão de vasos linfáticos) varia entre mousar # 124 e # 127, as imagens obtidas utilizando NIRF são consistentes para cada rato, nos dias 1 e 3.

Figura 4
Figura 4. Ao ul 5-10 de ICG ou NIRF-Abd é injetado ID no dorso da pata de um rato normal, dois vasos linfáticos devem ser visualizados drenando para o LN poplítea. Dinâmicos imagens de fluorescência são adquiridos imediatamente após a injecção e por até 20 min após a injecção. Em alguns casos, é difícil distinguir os dois vasos por causa da sua proximidade, como ilustrado na imagem ampliada representada pela caixa tracejada. Para o rato representativo mostrado aqui, 10 ul de ICG foi injectado no aspecto dorsal da pata, traseira esquerda (no local de injecção em primeiro lugar) e no lado esquerdo da base da cauda (no local de injecção segundo). Esta imagem foi captured aproximadamente 2-3 minutos após a primeira injecção e aproximadamente 30 segundos - 1 min após a segunda injecção.

Figura 5
Figura 5. (A) Ocasionalmente visualização dos vasos linfáticos é atrasada ou comprometida, mais geralmente, devido à injecção ser administrada SC em vez de ID. Quando 10 ul de ICG ou CABD-IRDye800 é injectado SC, na base da cauda de um rato normal, utilizando uma agulha de 31-gauge, transporte linfático não será visualizada imediatamente devido ao tempo adicional necessário para o corante de alcançar e ser tomado pelo capilares linfáticos na pele. Além disso, devido à injecção SC relativamente profundo, pode não haver absorção linfática e, portanto, não visualização dos vasos e dos gânglios linfáticos. Na Figura 5 (a), Um ratinho foi injectado com 10 ul de ICG, na base da cauda SC e as imagens foram obtidas 5 min após a injecção. O corante no local de injecção pode ser visualizado e nenhum vasos linfáticos ou linfonodos pode ser visualizado. Esta é a razão pela qual as injecções de ID são importantes. (B) A visualização do lado ventral do animal de vasos linfáticos aberrantes resultantes de uma ferida encontrou um dia mais cedo durante a remoção da pele com tesouras (sítio da lesão do tecido observado no lado direito do animal). A imagem foi capturada após cerca de 5 min 10 ul de ICG foi administrado ID na base da cauda, ​​em cada um dos lados esquerdo e direito. No lado não lesado (animal esquerda), o LN inguinal pode ser visualizada, bem como o vaso linfático eferente relativamente simples drenagem na direção dos linfonodos axilares. No lado direito do rato, no entanto, vasculatura linfática normal foi interrompido devido a ferimento, e parece aberrante, devido à reparação tecidual (scabbing).


Figura 6. Análise quantitativa da função contráctil linfático consiste em seleccionar ROIs ao longo dos vasos linfáticos que drenam a partir de (a) o LN inguinal para o LN axilares e (d) o local da injecção no aspecto dorsal da pata para o LN popliteal. A imagem ampliada (inset em (a)) do rectângulo vermelho tracejado ilustra a selecção de ROIs fluorescente ao longo do vaso. Uma compilação da intensidade de fluorescência média em função do tempo para todos os ROIs a partir de (a) e (d) é representado pelo diagrama de pseudo-cor mostrado em (b) e (e), respectivamente. As perturbações na intensidade de fluorescência entre os pixels representam uma linfática "pulso" de propagação através da ROIs e are em paralelo com as setas. A intensidade média de fluorescência de ROIs único 22 e 45 a partir de (b) estão representados em (c) e a intensidade média de fluorescência de ROIs único 18 e 34 a partir de (e) são mostradas em (f). Perfis de intensidade de fluorescência como uma função do tempo (como se mostra em (c) e (f)) facilitar a identificação dos pacotes de linfa de propagação e a extração do tempo de trânsito e da distância entre as duas ROIs. O ROIs dois são seleccionados com base, em parte, a sua localização ao longo do vaso linfático e a clareza com que os máximos e mínimos de propagação linfática representando são mostrados. A velocidade é calculada como a razão entre a distância entre dois ROIs e o tempo de passagem que é tomada entre o pico da intensidade de fluorescência. para ver figura maior


Figura 7. Para visualizar os vasos linfáticos de drenagem desde a região inguinal para a região axilar, injectar o lado esquerdo ou direito da base da cauda. Em geral, para a visualização do lado esquerdo, injectar no local 5, 6, 9, ou 10, e de visualizar o lado direito, injectar na posição 7, 8, 11, ou 12. Locais de 1 a 4 pode ser muito inferior da cauda para a absorção óptima para visualizar a drenagem linfática a partir da região inguinal para a região axilar.

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Discussion

Nós usamos um costume, de pequenos animais NIRF sistema de imagem para capturar imagens de vasos linfáticos marcados em camundongos. Para construir filmes do movimento da linfa, 300 ou mais imagens são coletadas. Para a análise funcional do sistema linfático de filmes, ROIs dois ou mais são manualmente desenhadas ao longo de um vaso linfático. As dimensões da ROIs são mantidas constantes para cada navio e são de aproximadamente o diâmetro do vaso. Enquanto a resolução espacial animal inteiro pode descrever vasos linfáticos fluorescentes de 100 microns ou menos, um macrolens para imagens de resolução mais fina pode ser empregue 10. De luz branca imagens para referência anatômica também pode ser adquirida usando uma lâmpada de baixo consumo de energia. Deve notar-se que, se os agentes de imagiologia são compostas por outros corantes fluorescentes, com excitação diferente / espectros de emissão de fluorescência, em seguida, os filtros acima descritos devem ser alteradas para manter um desempenho de imagem, e a dosagem do agente pode necessitar de ajustamento, bem. Além disso, se o comprimento de onda de excitação é less de 750 nm, em seguida, pode resultar autofluorescência, sinal de fundo aumenta e sensibilidade de imagem diminui. Além disso, a instabilidade dos agentes em solução pode impedir a utilização de alguns corantes, como NIRF cianina 7 (Cy7).

A selecção do local de injecção apropriado vai depender de qual dos vasos linfáticos estão a ser estudadas. Para visualizar os vasos linfáticos de drenagem desde a região inguinal para a região axilar, será necessário para injectar o lado esquerdo ou direito da base da cauda, ​​tal como mostrado na Figura 7. Para visualizar os vasos linfáticos de drenagem da região palaciana, você precisa injetar o aspecto dorsal da pata traseira. É essencial manter a temperatura do corpo do animal dentro do intervalo normal, como alterar a temperatura corporal pode resultar em função linfática inconsistente. Além disso, por causa da gama dinâmica limitada da maior parte dos CCDs, os locais de injecção devem ser cobertos com um papel preto para bloquear a luz fluorescente thereby permitindo a visualização de dimmer drenagem dos vasos linfáticos. Imagiologia devem ser realizados numa câmara escura para reduzir os sinais de fundo indesejados devido à emissão de luz na banda de fluorescência a partir das luzes da sala. O animal também deve ser deitado sobre um fundo preto, enquanto imagem está sendo realizada para reduzir o backscatter luz.

NIRF imagem linfática pode permitir uma melhor compreensão das doenças linfáticas e como as mudanças linfáticos arquitetura e função com relação à doença ou lesão. Por exemplo, a equipa de investigação usou NIRF imagens em pequenos animais para fornecer fenotipagem linfático de animais 6,15 e para detectar alterações na função linfática e arquitetura com metástases do câncer 10. Nos seres humanos, a técnica tem sido utilizada para detectar os primeiros sinais de linfedema 2, avaliar a resposta ao tratamento do linfedema 13,14,16, e os membros da família com fenótipo linfático hereditárias. No entanto, não-invasivo visualization de linfáticos profundos (> 3 cm) em humanos é limitado pela dispersão de luz no tecido. Imagens das estruturas linfáticas até 3 cm de profundidade foram adquiridos em suínos 9 e imagiologia humana. Nos seres humanos, linfocintigrafia MRI dinâmico e têm sido utilizados para quantificar o tempo de trânsito do agente de contraste a partir do local da injecção para os nódulos linfáticos em doença. No entanto, eles não têm resolução temporal e espacial suficiente para visualizar os eventos linfáticos propulsão prontamente fotografada com NIRF. Além disso, os vasos linfáticos saudáveis ​​não são visualizadas com MRI, devido à falta de contraste. NIRF imagem é não-invasivo, ao contrário confocal, microscopia multifotônica e imagiologia intravital. Técnicas de microscopia confocal e tipicamente multifotônica utilizar tecido, total ou parcialmente retirado. Métodos Scintographic exigir a utilização de radionuclídeos e de canulação navio, às vezes menor. Outro método para visualizar os vasos linfáticos envolve imaging intravital durante o qual o rato ésacrificados e a derme é puxado para trás após a injecção ID de corante azul de Evans. No entanto, este método não proporciona imagiologia funcional ou longitudinal 17,18. Metástases LN pode ser fotografada usando um Siemens Inveon PET / CT, no entanto, esta técnica não permite visualização da estrutura ou função linfática 19.

Embora os autores não recomendam nem endossa qualquer dispositivo de imagem comercial específica, a nossa experiência indica que a escolha da fonte de luz e filtros ópticos pode ser o fator mais importante que determina a sensibilidade do dispositivo. Como descrito por Zhu et al., Para uma imagem com qualidade de baixa concentração de corante, deverá haver um mínimo de sobreposição entre o espectro de emissão da fonte de luz e do espectro de transmissão dos filtros ópticos 20. Outra consideração importante é o espectro de absorção e de emissão do corante NIRF usado. Neste ICG papel e CABD-IRDye800 têm spe semelhantectra e assim o comprimento de onda do laser de diodo descrito e combinações de filtros pode ser usada para cada um, no entanto, se um outro corante a ser utilizado é o que não absorvem e / ou fluorescem a estes comprimentos de onda, o comprimento de onda da fonte de luz e os filtros ópticos devem ser ajustada em conformidade. ICG pode ser suficiente para muitas aplicações, e já está aprovado pela FDA. NIRF-CABD não é aprovado pelo FDA para utilização em seres humanos, mas podem ser úteis para imagiologia por animal. ICG não tem ligação química de resíduos para a fixação de porções de direccionamento, de modo outros agentes fluorescentes, tais como NIRF-CABD, estão a ser desenvolvidas.

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Disclosures

Autores têm nada a revelar, mas alguns autores são listados em uma patente.

Acknowledgements

Este trabalho foi suportado pelas seguintes subsídios para Eva Sevick: NIH R01 CA128919 e NIH R01 HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

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