Non invasive d'imagerie optique du système vasculaire lymphatique d'une souris

Published 3/08/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Les techniques d'imagerie développées récemment en utilisant la fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) peut aider à élucider le rôle du système lymphatique joue dans les métastases du cancer, la réponse immunitaire, la cicatrisation des plaies, et d'autres maladies associées lymphatique.

Cite this Article

Copy Citation

Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Le système vasculaire lymphatique est une composante importante du système circulatoire qui maintient l'homéostasie fluide, assure la surveillance immunitaire, et l'absorption de graisse sert d'intermédiaire dans l'intestin. Pourtant, malgré sa fonction critique, il ya relativement peu de compréhension de la façon dont le système lymphatique s'adapte pour répondre à ces fonctions en matière de santé et de la maladie 1. Récemment, nous avons démontré la capacité de l'architecture dynamiquement l'image lymphatique et de la lymphe "pompage" action sujets humains normaux ainsi que chez les personnes présentant un dysfonctionnement lymphatique en utilisant l'administration trace d'un proche infra-rouge fluorescent (NIRF) colorant et une coutume, Gen III- Système d'imagerie intensifié 2-4. NIRF imagerie ont montré des changements dramatiques dans l'architecture et la fonction lymphatique avec la maladie humaine. Il reste à savoir comment ces changements se produisent et de nouveaux modèles animaux sont développées pour élucider leur base génétique et moléculaire. Dans ce protocole, nous présentons lymphatique NIRF, sanimaux centre d'imagerie utilisant 5,6 vert d'indocyanine (ICG), un colorant qui a été utilisé pendant 50 ans chez l'homme 7, et un NIRF marqué par un colorant cyclique domaine liaison à l'albumine (Abd-IRDye800) peptide qui se lie préférentiellement la souris et l'albumine humaine 8 . Environ 5,5 fois plus brillante que l'ICG, Abd-IRDye800 a un profil similaire lymphatique jeu et peut être injecté dans les petites doses de l'ICG pour atteindre signaux NIRF suffisantes pour l'imagerie 8. Parce que les deux se lient Abd-IRDye800 et ICG à l'albumine dans l'espace interstitiel 8, ils peuvent représenter à la fois le transport des protéines actif dans et à l'intérieur des vaisseaux lymphatiques. Intradermique (ID) injections (ul 5-50) de l'ICG (645 uM) ou Abd-IRDye800 (200 uM) dans une solution saline sont administrés à la face dorsale de chaque patte arrière et / ou sur le côté gauche et droit de la base de la la queue d'une souris anesthésiée isoflurane. La concentration du colorant résultant de l'animal est 83-1,250 mg / kg pour le GIC ou 113-1,700 mg / kg pourAbd-IRDye800. Immédiatement après les injections, imagerie fonctionnelle lymphatique est réalisée pendant 1 h en utilisant un personnalisé, petit animal NIRF système d'imagerie. Résolution spatiale animal entier peut représenter vaisseaux lymphatiques fluorescentes de 100 microns ou moins, et les images des structures jusqu'à 3 cm de profondeur peut être acquis 9. Les images sont acquises à l'aide du logiciel V + + et analysées en utilisant le logiciel MATLAB ou ImageJ. Pendant l'analyse, régions consécutives d'intérêt (ROI) englobant le diamètre du vaisseau entier sont attirés le long d'un vaisseau lymphatique donnée. Les dimensions de chaque ROI sont maintenus constants pour un navire donné et l'intensité NIRF est mesurée pour chaque ROI d'évaluer quantitativement «paquets» de la lymphe se déplaçant à travers les vaisseaux.

Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les normes de l'Université du Texas Health Science Center (Houston, TX), département de médecine comparée et Centre d'imagerie moléculaire, après examen et approbation du protocole par leur soins aux animaux respectifs institutionnel et l'utilisation comité (IACUC) ou Animal Welfare Committee (AWC).

1. Préparation des animaux 24 heures avant à l'imagerie

Les étapes ci-dessous doit être fait (le cas échéant) la veille de l'imagerie lymphatique a lieu.

  1. Lieu animal dans une boîte à induction et calme avec de l'isoflurane.
  2. Une fois que l'animal est dans un état d'anesthésie profonde (surveillée avec bout-pincement manœuvre), des animaux sous sédation lieu sur un coussin fessier / peluches et le nez position dans un cône de nez raccordés au gaz isoflurane.
  3. Pince tous les poils / fourrure (le cas échéant) autour de la zone à imager.
  4. Appliquer un agent dépilatoire (NAIR) pour la zone rasée et laissez-on la peau pour un maximum de 3 min.
  5. Essuyez doucement avec tout agent dépilatoire chaude, de la gaze humide ou une serviette en papier.
  6. Rincer délicatement la peau avec de l'eau tiède et sécher doucement la zone avec de la gaze ou du papier absorbant.
  7. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante, et de retourner dans leur cage.

2. Journée de l'imagerie

  1. Agent d'imagerie reconstituer avec de l'eau stérile, puis diluer à l'aide stérile, normale (0,85%) pour atteindre une solution saline 645 uM (5 μg/10 pl) pour le GIC ou 200 pM (6,8 μg/10 pl) pour Abd-IRDye800. Conserver les solutions dans l'obscurité les conditions et les utiliser dans les 6 heures suivant la reconstitution.
  2. Lieu animal dans une boîte à induction et calme avec de l'isoflurane.
  3. Une fois que l'animal est dans un état d'anesthésie profonde (surveillée avec bout-pincement manœuvre), des animaux sous sédation lieu sur le côté sur un coussin fessier / peluches et le nez position dans un cône de nez raccordés au gaz isoflurane.
  4. Éteignez les lumières (si la pièce estsombre). Si nécessaire, une lampe de bureau halogène petite peut être utilisée pour une petite quantité de lumière pour voir injections.
  5. En utilisant une seringue à insuline avec une aiguille 31-gauge, injecter ID 5 pl à 50 pl de l'ICG ou Abd-IRDye800 à la face dorsale de chaque patte arrière et / ou sur le côté gauche et droit de la base de la queue, selon la zone d'intérêt (voir Discussion). Chaque dose injectée peut varier de 0,083 à 1,25 mg / kg (ICG) ou 0.113 à 1,7 mg / kg (Abd-IRDye800). Les volumes d'injection varie avec la souche animale et au site d'injection. Pour les souris athymiques, le volume d'injection peut être de 5 pi (patte arrière) ou 10 pi (base de la queue). Si l'animal n'est pas sous le système d'imagerie pour l'injection (s), placer l'animal dans le cadre du système d'imagerie immédiatement après la injection (s).
  6. Si aucune absorption de colorant est vu dans les vaisseaux lymphatiques, étape 2.5 sera nécessaire de répéter au besoin selon le protocole animaux.
  7. Une fois lymphatiques sont vu, le site d'injection avec du ruban électrique noir ou noir papar.
  8. Acquérir les images lymphatiques pour un maximum de 1 heure à l'aide du logiciel V + + et un petit animal, NIRF système d'imagerie. (Les animaux sont mis sous sédation avec de l'isoflurane et la respiration sont surveillés pendant que les images sont l'acquisition.) Alors que les petits animaux, les imageurs NIRF sont disponibles dans le commerce, nous utilisons une mesure, l'imagerie du petit animal NIRF système constitué d'une diode laser 785-nm (1005-9mm-78503 , Intense, North Brunswick, NJ) équipé d'une lentille asphérique (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), un diffuseur (ED1-C20, Thorlabs), et le filtre (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) pour créer un champ d'excitation uniforme qui éclaire l'animal à un débit de fluence incidente de moins de 1,4 mW par centimètre carré 10. Une multiplication d'électrons à couplage de charges dispositif (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) système de caméra avec deux 830-nm filtres (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) et une lentille de 28 mm Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) est utilisé pour capturer des images avec une intégration lymphatiques times de 200 ms, pour l'imagerie dynamique et statique 800 msec pour l'imagerie 5. Voir la figure 1 pour la configuration du système, le tableau pour plus de détails de chaque composant, et la réflexion pour une brève discussion des propriétés imageur clés.
  9. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante et de retourner dans leur cage, ou euthanasier.
  10. Analyser des images en utilisant ImageJ ou un logiciel MATLAB. Voir la Figure 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Exemple d'imagerie lymphatique NIRF chez la souris

Lorsque ICG ou Abd-IRDye800 est injecté ID à la base de la queue d'une souris normale, la vascularisation lymphatique entre le site d'injection à la base de la queue et du ganglion lymphatique inguinal (LN) doit être immédiatement visualisées. Peu de temps après l'injection (quelques secondes à quelques minutes), le vaisseau lymphatique inguinal entre la LN LN et le axillaire doit être visualisé comme le montre la figure 2. Depuis les vaisseaux lymphatiques des souris varie d'un animal à comme ils le font chez l'homme, la variation de l'architecture entre les animaux peut être considéré comme le montre la figure 3. Lorsque ICG ou NIRF-Abd est injecté ID sur la face dorsale de la patte arrière d'une souris normale, deux vaisseaux lymphatiques drainant peut être visualisée à l'LN poplitée comme le montre la figure 4. Dans certains cas, il est difficile de distinguer les deux navires en raison de leur proximité avec l'autre.

À certains moments, la visualisation des vaisseaux lymphatiques est retardée, le plus souvent due à l'injection étant administrée par voie sous cutanée (SC) au lieu de l'ID. Lorsque les injections SC sont donnés, le transport lymphatique peut ne pas être immédiatement visualisé comme le montre la figure 5 (a) en raison du temps supplémentaire requis pour la teinture d'atteindre et être repris par les capillaires lymphatiques dans la peau. C'est pourquoi il est important d'injecter ID au lieu de SC. À l'occasion, les vaisseaux lymphatiques anormaux sont observés, comme on le voit dans la figure 5 (b), dans la zone de la plaie comme une morsure ou une coupure de la tondeuse à cheveux / poils. La température du corps de l'animal doit être maintenu dans la fourchette normale, que de changer la température du corps peut entraîner la fonction lymphatique incompatibles. Limites de la technique comprennent l'obscurcissement des vaisseaux lymphatiques fluorescentes par pigmentation de la peau, l'incapacité de l'image des canaux lymphatiques thoraciques profondes duesà diffusion de la lumière dans le tissu, et l'effet de l'anesthésie inconnu sur la fonction lymphatique.

En règle générale, il faut le dépôt ID de l'ICG ou Abd-IRDye800 jusqu'à 2 jours pour effacer le foie et la vésicule, et jusqu'à 3 jours pour nettoyer le site d'injection. Lorsque résiduelle signal fluorescent a autorisé, le protocole d'imagerie peut être répété, ce qui permet l'imagerie lymphatique longitudinale pour évaluer les changements dans l'architecture ou de la fonction lymphatique après une intervention.

Analyse de la fonction lymphatique

Les images acquises peuvent être chargés dans ImageJ ou MATLAB pour l'analyse des données. Constant-région, ROI circulaire sont sélectionnées ou «tiré» sur toute la longueur du vaisseau lymphatique fluorescente comme cela se fait pour l'imagerie 10 et animale lymphatique humain 5 comme le montrent les figures 6 (a) et la figure 6 (d). La ROI sont choisis de telle sorte que leur diamètre est environ le diamètre de l'image de la fluorescencent navire. L'intensité moyenne de fluorescence à l'intérieur de chaque ROI est tracée en fonction du temps de formation d'image afin d'évaluer la vitesse de propulsion et la fréquence des "paquets" de teinture chargé lymphe propulsé le long des vaisseaux lymphatiques comme représenté sur les figures 6 (b) et à la figure 6 (e ). Pour évaluer la vitesse de propagation lymphatique et la fréquence de propulsion lymphatique, deux ROI, avec clairement les maxima ou les variations de minima d'intensité de fluorescence représentant la propagation de paquets de lymphe, sont sélectionnées et leurs profils d'intensité de fluorescence sont représentés comme représenté sur les figures 6 (c) et 6 (f). La vitesse de propagation est calculé en faisant le rapport de la distance entre les deux ROI et le temps de transit d'un paquet de lymphe se propager entre eux. En évaluant le nombre d'impulsions fluorescentes ou "paquets" qui arrivent à un retour sur investissement unique par le temps, la fréquence de contraction est calculé. Bien que cette technique fournit la seule méthode pour ASSEfréquence de propulsion art et de la vitesse d'un lymphatique automoteur "paquet", d'autres ont indirectement évaluées transport lymphatique par la mesure de la clairance de dépôt d'un agent d'imagerie et donc le calcul des constantes de vitesse d'élimination 11. Dans les métastases du cancer 10 et précoce de l'infection, on trouve la perte de la propulsion lymphatique chez les animaux. D'autres signalent des changements dans la contractilité en réponse à l'arthrite 12. Chez l'homme, nous présentons propulsion augmenté à la suite des traitements du lymphoedème y compris le drainage compression pneumatique 13 et le drainage lymphatique manuel (massage) 14.

Figure 1
Figure 1. Système d'imagerie NIRF est construit sur ​​mesure pour l'imagerie animale lymphatique petite. Le dispositif est constitué d'une diode laser 785-nm équipé d'une lentille asphérique, diffusEr, et des filtres pour créer un champ d'excitation uniforme qui éclaire l'animal et une caméra, EMCCD lentille de focalisation, et des filtres optiques pour capturer des images de la lymphe fluorescent 10.

Figure 2
Figure 2. Lorsque 10 ul d'ICG ou Abd-IRDye800 est injecté ID à la base de la queue d'une souris normale à l'aide d'une aiguille 31-gauge, la vascularisation lymphatique entre le site d'injection à la base de la queue et de la LN lymphatique inguinal doivent être visualisées immédiatement. Dynamique des images de fluorescence sont acquises immédiatement après l'injection et jusqu'à 20 min après l'injection. Peu de temps après l'injection (quelques secondes à quelques minutes), les vaisseaux lymphatiques entre le site d'injection et la LN inguinale et par la suite dans la région axillaire LN sont visualisés sur la vue latérale. L'image montre la figure 2 a été prise 5 min. après l'injection wie 10 pl d'ICG ID à la base de la queue. Le point brillant entre les régions inguinales et axillaires est le foie.

Figure 3
Figure 3. Depuis les vaisseaux lymphatiques des souris varient d'un animal à l'autre comme ils le font chez l'homme, la variation de l'architecture entre les animaux peuvent être vus et stable dans le temps. Souris N ° 124 a été injecté avec l'ICG à la base de la queue et imagée immédiatement le jour 1. Le panneau supérieur contient l'image obtenue à jour 1 et une image obtenue 2 jours plus tard (jour sur 3) en utilisant la même souris et d'injection / protocole d'imagerie. Le panneau inférieur contient des images provenant d'une autre souris (n ° 127) injecté avec l'ICG et jour immédiatement imagé 1 et ensuite imagé sur 3 jours. Bien que l'architecture lymphatique (le modèle des vaisseaux lymphatiques) varie entre moutiliser # 124 et # 127, les images obtenues à l'aide NIRF sont les mêmes pour chaque souris aux jours 1 et 3.

Figure 4
Figure 4. Lorsque ul 5-10 de GIC ou NIRF-Abd est injecté ID sur la face dorsale de la patte arrière d'une souris normale, deux vaisseaux lymphatiques drainant doit être visualisés à l'LN poplité. Dynamique des images de fluorescence sont acquises immédiatement après l'injection et jusqu'à 20 min après l'injection. Dans certains cas, il est difficile de distinguer les deux navires en raison de leur proximité, comme illustré dans l'image agrandie représentée par la zone en pointillés. Pour la souris représentant montré ici, 10 pi d'ICG a été injecté dans la face dorsale de la gauche, la patte arrière (premier site d'injection) et dans le côté gauche de la base de la queue (deuxième endroit d'injection). Cette image a été d'environptured environ 2 à 3 minutes après la première injection et environ 30 sec - 1 min après la deuxième injection.

Figure 5
Figure 5. (A) De temps en temps la visualisation des vaisseaux lymphatiques est retardé ou compromis, le plus souvent due à l'injection étant administrée SC lieu de l'ID. Lorsque 10 ul d'ICG ou Abd-IRDye800 est injecté SC à la base de la queue d'une souris normale à l'aide d'une aiguille 31-gauge, transport de la lymphe ne seront pas immédiatement visualisées en raison du temps supplémentaire requis pour la teinture d'atteindre et de prendre par le système lymphatique dans la peau capillaires. En outre, grâce à l'injection SC relativement profond, il peut y avoir aucune absorption lymphatique et donc pas de visualisation des vaisseaux et des ganglions lymphatiques. Dans la figure 5 (a), Une souris a été injecté avec 10 pl de l'ICG à la base de la queue et SC images ont été acquises 5 min après l'injection. Le colorant au site d'injection peuvent être visualisées et sans vaisseaux lymphatiques ou les ganglions lymphatiques peuvent être visualisées. C'est la raison pour injections ID sont importants. (B) Visualisation de la face ventrale de l'animal vaisseaux lymphatiques anormaux résultant d'une blessure rencontré un jour plus tôt lors de l'enlèvement de la fourrure avec une tondeuse (site de la lésion tissulaire noté sur le côté droit de l'animal). L'image a été capturée environ 5 min après 10 ul d'ICG a été administré ID à la base de la queue de chaque côté gauche et droit. Sur la non-blessé (animal à gauche), le LN inguinale peuvent être visualisées, ainsi que le vaisseau lymphatique efférent relativement simple vidange des ganglions axillaires vers les. Sur le côté droit de la souris, cependant, le système vasculaire lymphatique normal a été interrompu en raison de blessures et semble aberrante due à la réparation tissulaire (croûtes).


Analyse la figure 6. Quantitative de la fonction contractile lymphatique consiste à sélectionner des régions d'intérêt le long des vaisseaux lymphatiques drainant à partir de (a) la LN LN inguinale à la axillaire et (d) le site d'injection sur la face dorsale de la patte à la LN poplité. Une image agrandie (encart dans (a)) du rectangle en pointillés rouges illustre la sélection des régions d'intérêt le long de la cuve fluorescent. Une compilation de l'intensité de fluorescence moyenne en fonction du temps pour toutes les ROI de (a) et (d) est représenté par la courbe de pseudo-couleur représentée en (b) et (e), respectivement. Les perturbations d'intensité de fluorescence sur les pixels représentent une lymphatique "impulsion" propageant à travers le ROI et are parallèle aux flèches. L'intensité moyenne de fluorescence pour ROIs unique 22 et 45 à partir de (b) sont présentés dans (c) et l'intensité moyenne de fluorescence pour ROIs unique 18 et 34 à partir de (e) sont présentés dans (f). Profils d'intensité de fluorescence en fonction du temps (comme représenté en (c) et (f)) d'identifier les paquets de la lymphe et l'extraction de multiplication du temps de propagation et de la distance entre deux régions d'intérêt. Le ROI deux sont sélectionnés sur la base en partie sur leur emplacement le long du vaisseau lymphatique et la clarté avec laquelle les maxima et les minima de propagation lymphatique représentant sont affichés. La vitesse est calculée comme le rapport de la distance entre deux régions d'intérêt et le temps de transit qui est pris entre l'intensité de pic de fluorescence. Cliquez ici pour agrandir la figure


Figure 7. Pour visualiser les vaisseaux lymphatiques drainant de la région inguinale à la région axillaire, injecter le côté gauche ou droit de la base de la queue. En général, pour visualiser le côté gauche, en lieu injecter 5, 6, 9, ou 10, et de visualiser la partie droite, l'injection en position 7, 8, 11, ou 12. Emplacements 1 à 4 peut être trop inférieure de la queue de l'absorption optimale de visualiser le drainage lymphatique de la région inguinale de la région axillaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nous utilisons une coutume, petit animal NIRF système d'imagerie pour capturer des images de vaisseaux lymphatiques marquées chez la souris. Pour construire films de mouvement lymphe, plus de 300 images sont recueillies. Pour l'analyse fonctionnelle des vaisseaux lymphatiques de films, deux ou plusieurs ROIs sont manuellement tirée le long d'un vaisseau lymphatique. Les dimensions de la ROI sont maintenues constantes pour chaque navire, et sont à peu près au diamètre de la cuve. Bien que la résolution spatiale animal entier peut représenter vaisseaux lymphatiques fluorescentes de 100 microns ou moins, un macrolentille pour les images à plus haute résolution peuvent être utilisées 10. Lumière blanche pour des images de référence anatomique peut également être acquis à l'aide d'une lampe de faible puissance. Il convient de noter que si les agents d'imagerie sont composées d'autres colorants fluorescents avec une excitation différente / spectres d'émission de fluorescence, puis les filtres décrits ci-dessus doivent être modifiées afin de maintenir des performances d'imagerie, et la dose d'agent peut nécessiter un ajustement aussi bien. En outre, si la longueur d'onde d'excitation est less à 750 nm, puis autofluorescence peut entraîner, signal de fond va augmenter, et la sensibilité d'imagerie va diminuer. En outre, l'instabilité des agents en solution peuvent empêcher l'utilisation de certains colorants NIRF, comme Cyanine 7 (Cy7).

Choix du site d'injection approprié dépendra des vaisseaux lymphatiques sont à l'étude. Pour visualiser les vaisseaux lymphatiques drainant de la région inguinale à la région axillaire, vous aurez besoin d'injecter le côté gauche ou droit de la base de la queue, comme le montre la figure 7. Pour visualiser les vaisseaux lymphatiques drainant la région du palais, vous aurez besoin d'injecter la face dorsale de la patte arrière. Il est essentiel de maintenir la température corporelle de l'animal dans la fourchette normale, que de changer la température du corps peut entraîner la fonction lymphatique incompatibles. En outre, en raison de la gamme dynamique limitée de la plupart des capteurs CCD, les sites d'injection doivent être couverts avec du papier noir pour bloquer la lumière fluorescente thereby permettant la visualisation du gradateur vaisseaux lymphatiques drainant. L'imagerie doit être réalisée dans une pièce sombre pour réduire les bruits de fond indésirables en raison de l'émission de lumière dans la bande de fluorescence à partir des lumières de la pièce. L'animal doit également être étendu sur un fond noir tandis que l'imagerie est effectuée pour réduire la rétrodiffusion de la lumière.

Imagerie lymphatique NIRF peut permettre une meilleure compréhension des maladies lymphatiques et la façon dont les changements d'architecture lymphatiques et de la fonction à l'égard de la maladie ou de blessure. Par exemple, l'équipe de recherche a utilisé NIRF imagerie du petit animal pour fournir phénotypage des animaux lymphatique 6,15 et de détecter les changements dans la fonction lymphatique et l'architecture avec métastases du cancer 10. Chez l'homme, la technique a été utilisée pour détecter les premiers signes de lymphœdème 2, évaluer la réponse au traitement du lymphoedème 13,14,16, et membres de la famille souffrant de troubles lymphatiques phénotype héréditaire. Cependant, non-invasive visualization de vaisseaux lymphatiques profonds (> 3 cm) chez l'homme est limitée par la dispersion de la lumière dans les tissus. Images de structures lymphatiques jusqu'à 3 cm de profondeur ont été acquis chez le porc 9 et imagerie humaine. Chez l'homme, la lymphoscintigraphie IRM et dynamique ont été utilisées pour quantifier le temps de transit de l'agent de contraste à partir du site d'injection vers les ganglions lymphatiques de la maladie. Toutefois, ils n'ont pas suffisamment de résolution temporelle et spatiale pour visualiser les événements de propulsion lymphatiques aisément imagés avec NIRF. En outre, lymphatiques sains ne sont pas visualisées avec raison IRM manque de contraste. NIRF imagerie non invasive, contrairement confocale, la microscopie multiphotonique, et l'imagerie intravitale. Techniques de microscopie confocale et multiphotonique généralement utiliser des tissus partiellement ou totalement réséquée. Scintographic méthodes nécessitent l'utilisation de radionucléides et de canulation navire parfois mineures. Une autre méthode pour visualiser les vaisseaux lymphatiques implique imagerie intravitale au cours de laquelle la souris esteuthanasiés et le derme est tiré vers l'arrière après une injection ID de colorant bleu Evans. Cependant, cette méthode ne permet pas l'imagerie fonctionnelle ou longitudinales 17,18. LN métastases peuvent être visualisés à l'aide d'un Siemens Inveon TEP / CT, cependant, cette technique ne permet pas la visualisation de la structure ou de la fonction lymphatique 19.

Bien que les auteurs ne recommande ni cautionne aucun dispositif d'imagerie commerciale spécifique, notre expérience indique que le choix de la source de lumière et de filtres optiques peut être le facteur le plus important qui détermine la sensibilité de l'appareil. Comme décrit par Zhu et al., Pour l'imagerie de succès de faibles concentrations de colorant, il doit y avoir un chevauchement minimal entre le spectre d'émission de la source de lumière et le spectre de transmission des filtres optiques 20. Un autre facteur clé est le spectre d'absorption et d'émission du colorant utilisé NIRF. Dans ce ICG papier et Abd-IRDye800 ont spé similairectra et donc la longueur d'onde laser décrit diode et des combinaisons de filtres peuvent être utilisés pour chaque, mais si un autre colorant est utilisé qui n'absorbe pas et / ou fluorescent à ces longueurs d'onde, la longueur d'onde de la source de lumière et les filtres optiques doivent être ajustés en conséquence. ICG peut être suffisant pour de nombreuses applications, et est déjà approuvé par la FDA. NIRF-Abd n'est pas approuvé par la FDA pour une utilisation chez les humains, mais peut être utile pour l'imagerie animale. ICG n'a pas de liaison chimique des résidus pour la fixation des fragments de ciblage, afin que les autres agents fluorescents, tels que NIRF-Abd, sont en cours d'élaboration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler, mais certains auteurs sont inscrites à un brevet.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à Eva Sevick: NIH R01 CA128919 et les NIH R01 HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats