تحديد الحموضة في مرحلة غاز من Oligopeptides

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يوصف تحديد الحموضة في مرحلة غاز من oligopeptides تحتوي على السيستين. وتجرى التجارب باستخدام الثلاثي مطياف الكتلة رباعي. يتم قياس الحموضة النسبية للالببتيدات باستخدام الاصطدام الناجم عن التجارب التفكك، ويتم تحديد الحموضة الكمي باستخدام الطباخون الموسعة طريقة الحركية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مخلفات الأحماض الأمينية الموجودة في مواقع مختلفة في البروتينات مطوية في كثير من الأحيان تظهر درجات مختلفة من الحموضة. على سبيل المثال، بقايا السيستين التي تقع في أو بالقرب من N-محطة من الحلزون غالبا ما يكون أكثر حمضية من أنه في أو بالقرب من محطة سي 1-6. على الرغم من أن الدراسات التجريبية واسعة النطاق على خصائص حمض قاعدة من الببتيدات نفذت في المرحلة الموجزة، لا سيما في المحاليل المائية 6-8، وغالبا ما معقدة النتائج والآثار المذيبات 7. في الواقع، تقع معظم المواقع المفعلة في البروتينات بالقرب من المنطقة الداخلية حيث تم التقليل من آثار المذيب 9،10. من أجل فهم جوهري خصائص حمض قاعدة من الببتيدات والبروتينات، فمن المهم لاجراء الدراسات اللازمة في بيئة خالية من المذيبات.

فإننا نقدم وسيلة لقياس الحموضة من oligopeptides في طور الغاز. ونحن نستخدم السيستين التي تحتوي على قليل الببتيد، علاء 3 CysNH 3)، ومجمع نموذج. وتستند القياسات على الطباخون الموسعة طريقة الحركية راسخة (الشكل 1) 11-16. وتجرى التجارب من استخدام مطياف الكتلة الثلاثي رباعي ربطه مع التأين electrospray (ESI) مصدر أيون (الشكل 2). لكل عينة الببتيد، ويتم اختيار العديد من الأحماض المرجعية. الأحماض المرجعية هي مركبات عضوية مماثلة هيكليا مع المعروف الحموضة في مرحلة غاز. يتم إدخال محلول من خليط من الببتيد وحمض إشارة إلى مطياف الكتلة، ويتم تشكيل كتلة الأيونية متجهة بروتون A-الطور الغازي من حمض الببتيد المرجعية. والكتلة بروتون متجهة معزولة الشامل ومجزأة في وقت لاحق عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) التجارب. ويتم تحليل الناتج وفرة أيون شظية باستخدام العلاقة بين الحموضة والكتلة أيون تفارق حركية. الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد هو ثم obtaiNED بواسطة الانحدار الخطي من المؤامرات الحرارية الحركية 17،18.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمجموعة متنوعة من الأنظمة الجزيئية، بما في ذلك المركبات العضوية، والأحماض الأمينية ومشتقاتها، أليغنوكليوتيد]، وoligopeptides. بمقارنة الحموضة في مرحلة غاز تقاس تجريبيا مع تلك القيم المحسوبة لالمتشاكلات المختلفة، والآثار بتكوين جزئي على الحموضة يمكن تقييمها.

Introduction

والحموضة من مخلفات الأحماض الأمينية هي من بين أهم خصائص الحراري التي تؤثر على الهياكل، والتفاعل، وعمليات قابلة للطي تتكشف من البروتينات 9،19. فرد مخلفات الأحماض الأمينية غالبا ما تظهر الحموضة فعالة مختلفة اعتمادا على مواقعها في البروتينات. على وجه الخصوص، بقايا تقع في المواقع المفعلة غالبا ما تظهر قلق كبير الحموضة. أحد الأمثلة على ذلك هو بقايا السيستين المقيمين في المواقع المفعلة من thioredoxin فائقة عائلة من الإنزيمات 20،21. السيستين موقع نشط هو الحمضية بشكل غير عادي مقارنة مع تلك الموجودة في تكشفت البروتينات 3-5. وقد اقترح أن التشكل حلزونية قد يكون لها مساهمة كبيرة في الحموضة غير عادية. وهناك دراسات تجريبية واسعة النطاق على خصائص حمض قاعدة من الببتيدات التي نفذت في الحلول، خاصة في المحاليل المائية 2،6-8. في كثير من الأحيان معقدة النتائج وفقا لتأثيرات المذيب7. في الواقع، تقع معظم المواقع المفعلة في البروتينات بالقرب من المنطقة الداخلية حيث يتم الحد من آثار المذيب 9،10.

من أجل فهم جوهري خصائص حمض قاعدة من الببتيدات والبروتينات، فمن المهم إجراء الدراسات في بيئة خالية من المذيبات. ونحن هنا نقدم طريقة الشامل القائم على قياس الطيف لتحديد الحموضة في مرحلة غاز. ويشار إلى نهج مثل الطباخون الموسعة طريقة الحركية. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لمجموعة واسعة من أنظمة الكيميائية لتحديد الخصائص المختلفة الحراري، مثل الحموضة طور الغاز، تقارب بروتون، أيون تقارب المعدن، تقارب الإلكترون، وطاقة التأين 11-15، 22-26. لقد طبقنا هذا الأسلوب لتحديد الحموضة في مرحلة غاز من سلسلة من بنسبة ضئيلة السيستين والسيستين polyalanine-polyglycine الببتيدات 17،18،27. وتبين هذه الدراسات أن السيستين N-محطة peptidES بشكل ملحوظ أكثر حمضية من المقابلة منها محطة سي. والحموضة عالية من السابق ومن المرجح نتيجة لآثار متعلق بتكوين حلزونية التي استقرت بقوة أنيون thiolate عن التفاعل مع الحلزون، ثنائي القطب الماكرو. بسبب الطبيعة غير متقلبة، وقابل للتغيير حراريا من الببتيدات، وطريقة الحركية هو النهج الأكثر عملية المتاحة في الوقت الحاضر لإنتاج حمض قاعدة كميات دقيقة بشكل معقول الحراري من الببتيدات 28.

ويبين المخطط العام والمعادلة المرتبطة مع أسلوب الحركية في الشكل 1. تحديد الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد (ه) يبدأ مع تشكيل سلسلة من الأنيونات كتلة البروتون محدد، [A • H • A ط] ¯ (أو [A ¯ • H + A • ط ¯] ¯)، في المنطقة مصدر أيون من مطياف الكتلة، حيث A ¯ ط ¯ وA هي الأشكال deprotonated من الببتيد والأحماض المرجعية، على التوالي. الأحماض المرجعية هي مركبات عضوية مع المعروف الحموضة في مرحلة غاز. يجب أن يكون الأحماض إشارة هياكل مشابهة لبعضها البعض (ولكن ليس بالضرورة مماثلة لتلك التي من الببتيد). التشابه في الهياكل بين الأحماض إشارة يضمن التشابه في الانتروبيا من نزع بروتون فيما بينها. الكتلة بروتون محدد ويتم اختيار كتلة الأنيونات والمفعلين يمكنهم collisionally وفصلها في وقت لاحق باستخدام الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) تجارب لتسفر عن الأنيونات أحادى المقابلة، A ¯ ط ¯ A و، مع ثوابت معدل K و k الأول، على التوالي، كما هو موضح في الشكل 1A. إذا الشظايا الثانوية تكاد لا تذكر، ونسبة وفرة من الأيونات شظية CID، [A ¯] / [A ط ¯]، يمثل تدبيرا تقريبي لنسبة من الثوابت معدل، ك / ك ط. تحت افتراض أنه لا توجد activat العكسيالحواجز أيون لكلتا القناتين التفكك، وايون المنتج CID المتفرعة النسب، LN [A ¯] / [A ط ¯]، سيتم ارتباطا خطيا إلى الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد (Δ حمض H) وتلك من الأحماض المرجعية (Δ حمض H I)، كما هو مبين في الشكل 1B. في هذه المعادلة، Δ H حمض المتوسط ​​هو متوسط ​​الحموضة في مرحلة غاز من الأحماض المرجعية، Δ (Δ S) هو مصطلح الكون (والتي يمكن افتراض ثبات إذا الأحماض المرجعية هي هيكليا مشابهة لبعضها البعض)، R هو ثابت الغاز العالمي، وT EFF هي درجة الحرارة الفعال للنظام. درجة الحرارة الفعالة هي معلمة التجريبية التي تعتمد على العديد من المتغيرات التجريبية، بما في ذلك الطاقة الاصطدام.

يتم تحديد قيمة الحموضة طور الغاز عن طريق بناء مجموعتين من المؤامرات الحرارية الحركية. المجموعة الأولى هي OBيعتقلون من قبل بالتآمر LN ([A ¯] / [A ط ¯]) ضد Δ حمض H I - Δ H حمض المتوسط، كما هو مبين في الشكل 4A. سوف الانحدار الخطي تسفر عن مجموعة من الخطوط المستقيمة مع منحدرات X = 1 / RT EFF وقراءتها من Y = - [Δ حمض H - H Δ حمض المتوسط] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. يتم الحصول على المجموعة الثانية من المؤامرات من قبل المتهم بالتآمر في قراءتها الناتج (Y) من المجموعة الأولى ضد المنحدرات المقابلة (X)، كما هو مبين في الشكل 4B. الانحدار الخطي ينتج الخط الجديد مع منحدر من حمض H Δ - Δ H حمض المتوسط ​​واعتراض من Δ (Δ S) / R. ثم يتم الحصول على قيمة Δ حمض H من المنحدر ويتم الحصول على مصطلح الكون، Δ (Δ S)، منالتقاطع.

وتجرى التجارب باستخدام الثلاثي مطياف الكتلة رباعي ربطه إلى التأين electrospray (ESI) مصدر أيون. ويظهر رسم تخطيطي للمطياف الكتلة في الشكل 2. وتجرى التجارب CID عن طريق اختيار كتلة كتلة البروتون الأنيونات محدد مع وحدة رباعي الأولى والسماح لهم الخضوع الاصطدامات مع ذرات الأرجون تسربت الى غرفة الاصطدام الذي يقام تحت ضغط من نحو 0.5 mTorr. يتم تحليل أيونات المنتج التفكك الشامل مع وحدة رباعي الثالث. وتسجل أطياف CID في العديد من الطاقات تصادم مع م / ض مجموعة واسعة بما يكفي لتغطية جميع أجزاء الثانوي ممكن. يتم قياس شدة CID ايون المنتج عن طريق وضع الصك في رصد رد فعل المختارة (SRM) الوضع الذي يركز الفحص على أيونات المنتج المحدد. يتم تنفيذ التجارب في إدارة البحث الجنائي أربعة طاقات تصادم مختلفة، المقابلة لالطاقات الوسط من الكتلة (E سم) من 1.0، 1.5، 2.0، و 2.5 فولت، على التوالي. يتم حساب الطاقة الوسط من الكتلة باستخدام المعادلة: E = E سم مختبر [م / (م + م)]، حيث E هي الطاقة مختبر تصادم في إطار المختبر، M هي كتلة من الأرجون، وM هو كتلة أيون كتلة البروتون منضم.

في هذه المقالة، ونحن نستخدم علاء قليل الببتيد 3 CysNH 2 (A 3 CH) مثل مجمع نموذج. للمحطة سي هو amidated وسوف مجموعة ثيول (SH) من بقايا السيستين يكون موقع الحمضية. اختيار الأحماض إشارة مناسبة هو أمر حاسم لنجاح عملية القياس من الحموضة في مرحلة غاز. الأحماض مرجعية مثالية من الناحية الهيكلية مماثلة (لبعضها البعض) المركبات العضوية مع القيم الحموضة في مرحلة غاز راسخة. يجب أن يكون الأحماض مرجع قيم الحموضة قريب من الببتيدات. لالببتيد A 3 CH، ستة المهلجنة carboxyliويتم اختيار الأحماض C كما على الأحماض المرجعية. الأحماض إشارة ستة هي حمض الكلوروأسيتيك (MCAH)، bromoacetic حمض (مباه)، وحمض difluoroacetic (DFAH)، وحمض dichloroacetic (DCAH)، وحمض dibromoacetic (DBAH)، وtrifluoroacetic (TFAH). اثنين منهم، وسوف تستخدم DFAH ومباه، لتوضيح البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد نموذج حلول

  1. إعداد أول الحلول الأسهم من الببتيد والأحماض إشارة ستة باستخدام مذيب مختلطة من الميثانول والماء في نسبة حجم 1:1. ينبغي الحلول الأوراق المالية لديها تركيز من حوالي 10 -3 M.
  2. تزن من 1 ملغ من العينة الصلبة الببتيد، A 3 CH، في أنبوب 1.5 مل إيبندورف وإضافة 1.0 مل من المذيبات مختلطة من الميثانول والماء، وتخلط باستخدام الدوامة.
  3. تزن من 1 ملغ من حمض difluoroacetic (DFAH) وإضافة 1.0 مل من المذيب مختلطة من الميثانول والماء، وتخلط باستخدام الدوامة.
  4. استخدام نفس الإجراء لجعل الحلول الأسهم لخمس إشارة الأحماض حمض الأخرى الكلوروأسيتيك (MCAH)، bromoacetic حمض (مباه)، وحمض dichloroacetic (DCAH)، dibromoacetic حمض (DBAH)، وحمض trifluoroacetic (TFAH).
  5. رسم حوالي 50 ميكرولتر من محلول المخزون الببتيد إلى 1.5 مل أنبوب إيبندورف، واستخلاص حوالي 50 ميكرولتر من محلول المخزون من DFAH في سالي إيبندورف أنبوب. تمييع الحل مختلطة مع 900 ميكرولتر من المذيبات مختلطة من الميثانول والماء لتحقيق تركيز النهائي من حوالي 10 -4 M. وسوف تستخدم هذه محلول مخفف كحل عينة للقياسات مطياف الكتلة. وسيتم تعديل هذه النسبة الفعلية للالببتيد للحمض المرجعية فضلا عن تركيز النهائي من الحل عينة بناء على وفرة إشارة أيون لوحظت في مطياف الكتلة.
  6. استخدام نفس الإجراء لإعداد الحلول عينة من الببتيد مع غيرها من الأحماض إشارة خمسة.

2. قياس الطيف الكتلي 1: بروتون متجهة الكتلة تشكيل ايون

  1. الخطوة الأولى لقياس الطيف الكتلي هو توليد مستقرة الأيونات كتلة البروتون متجهة من الببتيد مع حمض المرجعية.
  2. تعيين أداة في الأيونات السالبة MS وضع مع ESI إبرة الجهد في -4.5 كيلو فولت، والجهد الشعري في حوالي -35 V، وتجفيف درجة حرارة الغازالحفاظ على 150 درجة مئوية. تعيين ذروة العرض وذروة Q1 عرض Q3 على حد سواء لمقياس معايرة (العرض ذروة معلمة الأداة التي يمكن استخدامها لضبط دقة من قمم. يسمح "جدول معايرة" الإعداد لعرض القمم ضيقة للحصول على أفضل ذروة فصل ). الجهد الشعرية وتجفيف درجة حرارة الغاز يمكن تعديلها لتعزيز وفرة أيون المرصودة.
  3. صب حوالي 0.5 مل من محلول عينة من الببتيد DFAH إلى 1 مل حقنة هاميلتون وتوصيل حقنة لمدخل إبرة ESI باستخدام أنابيب نظرة خاطفة. ثم ضع الحقنة على ضخ حقنة. بدوره على ضخ حقنة للبث محلول العينة في إبرة ESI مع معدل التدفق في 10 ميكرولتر / دقيقة.
  4. بدوره على ESI إبرة الجهد لتفعيل عملية ESI. بدوره على كاشف. وينبغي أن يلاحظ وجود عرض الطيف الكتلي في وضع الجانبي. إذا كان العرض في وضع النقطه الوسطى، والتحول إلى الوضع الشخصي. مشاهدة بروتون متجهة الى تشكيل كتلة أيون من قبل monitoriنانوغرام الذروة في م / ض 428. وفرة إشارة من كتلة أيون يمكن تعديلها بواسطة ضبط الصك. واحد المعلمة المهم هو الجهد الشعري. يمكن للمرء تغيير يدويا الجهد الشعري (عادة في نطاق من -20 إلى -50 V) لتعظيم وفرة من الذروة في م / ض 428.

3. قياس الطيف الكتلي (2): التجارب بين أقواس CID

  1. الخطوة التالية هي إجراء التجربة بين أقواس CID.
  2. مرة واحدة وفرة من الأيونات كتلة تصل إلى القيمة المطلوبة (حوالي 100 بالسيارات)، وتبديل أداة لوضع MS / MS. في هذا الوضع، وظائف Q1 باعتبارهم كتلة ومرشح لعزل أيون العنقودية، وظائف Q2 باعتبارها الخلية الاصطدام، وظائف Q3 باسم محلل الشامل.
  3. تعيين الغاز الاصطدام (الأرجون، في هذه الحالة) الضغط عند 0.5 mTorr والطاقة تصادم في 17 فولت. وينبغي ملاحظة ثلاث قمم في كتلة الطيف نافذة العرض. في ذروة م / ض 428 يتوافق مع أيون كتلة، [DFA • H • A 3 CS] ¯. القمم اثنين في م / ض 332 و م / ض 95 تتوافق مع الببتيد deprotonated (A 3 CS ¯) وحمض difluoroacetic deprotonated (DFA ¯)، على التوالي. ذروة طفيفة في م / ض 298 هو جزء ثانوي من الببتيد deprotonated. الحصول على الطيف CID لمدة 2 دقيقة، 3A الشكل.
  4. إجراء تجارب مماثلة CID والحصول على الطيف CID من أجل حل عينة من الببتيد مع بروم حامض الاستيك (مباه)، 3B الشكل.
  5. إجراء تجارب مماثلة CID والحصول على أطياف CID لحلول عينة من الببتيد مع جميع الأحماض مرجعية أخرى. سوف أطياف CID الناتجة تكون مشابهة نوعيا للأرقام 3A 3B و، ولكن م / ض القيم ومرتفعات الذروة النسبية تكون مختلفة.

4. قياس الطيف الكتلي 3: أسلوب الحركية

  1. الخطوة الأخيرة هي للحصول على الأطياف SRM.
  2. تبديل العرض لطيف النقطه الوسطى وتعيين أداة لرصد رد فعل المختارة (SRM) واسطة. الحفاظ على م / ض 428 على هيئة أيون التي يعزلها رباعي الأول (Q1)، وملء في أربعة الجماهير (نسب الشامل إلى تهمة) ليتم مراقبتها من قبل رباعي الثالث (Q3). الجماهير الأربعة هي م / ض 428 (أيون الكتلة)، م / ض 332 (ايون الببتيد)، م / ض 298 (جزء من أيون الببتيد)، وم / ض 95 (وزارة الشؤون الخارجية ¯ أيون). الحفاظ على ضغط الغاز الاصطدام عند 0.5 mTorr.
  3. تعيين طاقة التصادم إلى 11.7 إلكترون فولت والحصول على أطياف لمدة 5 دقائق.
  4. تغيير طاقة التصادم إلى 17.6 إلكترون فولت والحصول على أطياف لمدة 5 دقائق.
  5. تغيير طاقة التصادم إلى 23.4 فولت، و 29.3 فولت، واكتساب الأطياف في كل طاقات تصادم لمدة 5 دقائق.
  6. أداء قياسات مماثلة لالببتيد مع جميع الأحماض مرجعية أخرى.

5. تحليل البيانات

  1. نسخ القيم من شدة أيون من شركةL أطياف SRM على ورقة عمل Excel.
  2. حساب ايون المنتج CID نسب المتفرعة، LN ([A ¯] / [A ط ¯])، ويقاس بالنسبة لجميع المجموعات الست بروتون متجهة في كل طاقات تصادم أربعة. يتم عرض القيم العينات في الجدول 1.
  3. رسم القيم من قانون الجنسية ([A ¯] / [A ط ¯]) ضد قيم Δ حمض H I - Δ H حمض المتوسط. وهذا يعطي أربع قطع المقابلة لبيانات في الأربعة الطاقات الاصطدام، 4A الشكل.
  4. استخراج القيم من المنحدرات وقراءتها من قبل الانحدار الخطي من المؤامرات أربعة. في هذه الحالة، المنحدرات القيم الإيجابية وقراءتها هي قيم سلبية. تعطي الرمز "X" إلى المنحدرات والرمز "Y" للاعتراض. وتظهر النتائج في الجدول رقم 2. مضاعفة قيم Y في -1 واستخدام رمز Y 'لتمثيل القيم الإيجابية (وهذا يسمح للمحور y لديسلعب قيم موجبة). علما، وهذا التحويل هو اختياري طالما يتم استخدام القيم المقابلة لجعل مؤامرة للخطوة التالية.
  5. رسم قيم Y 'ضد قيم X، الشكل 4B. الانحدار الخطي من المؤامرة تعطي المنحدر من 1.706 واعتراض من -0.536. المنحدر يتوافق مع حامض Δ H - H Δ حمض المتوسط. قيمة Δ H حمض المتوسط ​​هو معروف أن تكون 330.5 كيلو كالوري / مول، والتي يتم تحديدها من قبل مجموعة من الأحماض المرجعية المختارة. ثم يتم الحصول على قيمة الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد من المنحدر: Δ حمض H (A 3 CH) = 332.2 كيلو كالوري / مول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. تقديم التجارب بين أقواس CID معلومات عن الحموضة النسبية للالببتيد مقارنة مع الأحماض المرجعية المختارة. وترد اثنين من أطياف CID ممثل الببتيد (A 3 CH) مع اثنين من الأحماض المرجعية، DFAH ومباه، في الشكل 3. في 3A الشكل وفرة أيون (ذروة الارتفاع) من أيون الببتيد هو أضعف من أن من DFA ¯، و3B في الشكل، وفرة من أيون أيون الببتيد هو أقوى من ذلك MBA ¯. أطياف اثنين تشير إلى أن الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد في نطاق بين الحموضة من هذه الأحماض مرجعيتين.
  2. يتم تحديد القيمة الكمية للحموضة في مرحلة غاز من الببتيد من التجارب CID الكمي. وتظهر المؤامرات الحرارية الحركية لتفكك الكتل بروتون متجهة من الببتيد مع الأحماض إشارة ستة في الشكل 4. الانحدار الخطي من المؤامرات وفقا لالحرارية الحركية relationship بين الحموضة طور الغاز وايون المنتج CID المتفرعة نسبة (1B الشكل) يعطي قيمة الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد A 3 CH، وهو 332.2 كيلو كالوري / مول. يتم عرض القيم عينة من المنحدرات وقراءتها في الجدولين 1 و 2.

الشكل 1
الشكل 1. الخطة الشاملة للالطباخون الموسعة طريقة الحركية. أ) مخطط الكتلة بروتون متجهة أيون التفكك. ب) العلاقة الحرارية الحركية بين الحموضة طور الغاز وايون المنتج CID المتفرعة النسبة. في هذه المعادلة، Δ حمض H i هي قيمة الحموضة في مرحلة غاز من الأحماض المرجعية الفردية، Δ H حمض المتوسط ​​هو أحدverage طور الغاز الحموضة من الأحماض المرجعية، Δ حمض H هو الحموضة مرحلة الغاز للالببتيد، Δ (Δ S) هو مصطلح الكون، R هو ثابت الغاز العالمي، وT EFF هي درجة الحرارة الفعال للنظام .

الشكل 2
الشكل 2. A الرسم التخطيطي لمطياف الكتلة الثلاثي رباعي. ESI هو electrospray مصدر أيون التأين. Q1 و Q3 تمثل الوحدات رباعية الأول والثالث، على التوالي. على أداء التجربة CID، يتم تحديد الأيونات كتلة البروتون متجهة الشامل Q1، وتسترشد في الخلية الاصطدام الى الاصطدام مع الأرجون (ع) ذرات تسربت إلى داخل الخلية الاصطدام، ويتم تحليل الأيونات شظية الناجم عن Q3.

الشكل (3) الشكل (3). ال أطياف CID لأيونات كتلة البروتون متجهة من الببتيد مع اثنين من الأحماض المرجعية، أ) [DFA • H • A 3 C] ¯ وب) [ماجستير في إدارة الأعمال • H • A 3 C] ¯. يتم رسم أطياف باسم النسبية وفرة أيون مقابل قيمة م / ض.

الشكل 4
الشكل 4. المؤامرات الحرارية الحركية للالببتيد مع ستة الأحماض المرجعية التي تم جمعها في أربعة طاقات تصادم أ) مؤامرة من Y = LN ([A ¯] / [A ط ¯]) ضد X = Δ حمض H I -. Δ حمض H المتوسط ب) مؤامرة من Y '= [H Δ حمض - Δ حمض H </ EM> المتوسط] / RT EFF - Δ (Δ S) / R ضد X = 1 / RT EFF.

الجدول 1. قيم المنتج CID أيون نسب المتفرعة، LN ([A ¯] / [A ط ¯])، لأيونات مجموعة من الببتيد مع DFAH ومباه.

HA أنا 11.7 فولت 17.6 فولت 23.4 فولت 29.3 فولت
MCAH 3.68 3.50 3.39 3.45
مباه 2.83 2.65 2.45 2.24
DFAH -0.442 -0.268 -0.0921 0.167
DCAH -2.60 -2.41 -2.22 -2.13
DBAH -2.43 -2.44 -2.49 -2.60
TFAH -5.41 -5.02 -4.71 -4.44
الجدول 2. قيم المنحدرات (X) وقراءتها (Y) الناتجة عن الانحدار الخطي من أول مجموعة من المؤامرات الحرارية الحركية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعتمد نجاح عملية القياس من الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد إلى حد كبير على اختيار الأحماض إشارة مناسبة. الأحماض مرجعية مثالية هي مركبات عضوية مماثلة هيكليا مع القيم الحموضة في مرحلة غاز راسخة. يجب أن يكون الأحماض إشارة هياكل مشابهة لبعضها البعض. وسيضمن هذا الكون مماثلة من نزع بروتون لكل من الأحماض المرجعية في المجموعة. يجب أن يكون الأحماض مرجع قيم الحموضة قريبة من تلك الببتيدات. لأقصر oligopeptides تحتوي على السيستين مع amidated C-مصطلحات، والهالوجينية الأحماض الكربوكسيلية هي الأحماض إشارة مناسبة. خطوة حاسمة نحو التجارب CID الناجح هو تشكيل كتلة البروتون أيونات محددة مستقرة مع وفرة عالية. استقرار ووفرة يمكن تحسينها إلى حد كبير عن طريق ضبط نسبة الببتيد للحمض إشارة، فإن تركيز المحلول عينة، والظروف فعال (مثل الجهد إبرة، وتجفيفدرجة حرارة الغاز، والجهد الشعري). واحد شرط جوهري حاسم هو الجهد الشعري (أو مخروط الجهد لبعض أنواع أخرى من الصكوك). واحد الحذر لتجنب استخدام حلول العينة أن تتركز أيضا.

الطريقة الموصوفة ليست مقتصرة على oligopeptides. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمجموعة متنوعة من الأنظمة الجزيئية، بما في ذلك مركبات قطبية العضوية، والأحماض الأمينية ومشتقاتها، والمركبات الفلزية العضوية، أليغنوكليوتيد]، والبوليمرات الببتيد محاكاة. بالإضافة إلى استخدام مطياف الكتلة الثلاثي رباعي، ويمكن أيضا أن تتم التجربة باستخدام الفخاخ أيون والطيف الشامل Q-TOF.

تم تصنيعه الببتيد المستخدمة في هذه التجربة في المختبر لدينا باستخدام أسلوب قياسي من المرحلة الصلبة الببتيد التوليف 29-31. تم استخدام الراتنج أميد تزلج باعتبارها دعما قويا لتسفر عن أميد C-محطة. الاستفادة من طريقة الحركية الطباخون هو أن شوائب طفيفة في رانه نموذج الببتيد لا تؤثر على قياسات الحموضة، طالما الشوائب لم يكن لديك نفس الجماهير باسم الببتيدات أو الأحماض المرجعية.

يمكن أن يقترن القياسات التجريبية مع الدراسات الحسابية لدراسة الآثار بتكوين جزئي على الحموضة. تقديم دراسات الحسابية التوقعات من التشكل من الببتيدات التي تطابق الحموضة المحسوب. بمقارنة الحموضة تقاس تجريبيا مع القيم المحسوبة، يمكن تقييم التشكل من الببتيدات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

Materials

E الرقبي، فولت

X

1 / RT EFF

Y

- [(Δ حمض H - H Δ حمض المتوسط) / RT EFF - Δ (Δ S) / R]

11.7 0.744 -0.728
17.6 0.700 -0.665
23.4 0.665 -0.611
29.3 0.645 -0.553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48, (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2, (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35, (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282, (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277, (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253, (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116, (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268, (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14, (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13, (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34, (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115, (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118, (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31, (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113, (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21, (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3, (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91, (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39, (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112, (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113, (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106, (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267, (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16, (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics