Bepaling van de gas-fase zuurgraden van oligopeptiden

1Department of Chemistry, University of the Pacific
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

De bepaling van de gasfase zuursterkte van cysteine-bevattende oligopeptiden beschreven. De experimenten zijn uitgevoerd met een drievoudige quadrupool massaspectrometer. De relatieve zuurgraden van de peptiden worden gemeten met behulp van botsingsgeïnduceerde dissociatie experimenten, en de kwantitatieve zuurgraden worden bepaald met behulp van de uitgebreide Koks kinetische methode.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Aminozuurresiduen op verschillende posities in gevouwen eiwitten vertonen vaak verschillende graden van zuurgraden. Bijvoorbeeld, een cysteïneresidu bij of nabij de N-terminus van een helix vaak zuurder dan die bij of nabij de C-terminus 1-6. Hoewel uitgebreid experimenteel onderzoek van de zuur-base eigenschappen van peptiden in de gecondenseerde fase, met name in waterige oplossingen 6-8 werden uitgevoerd, worden de resultaten vaak gecompliceerd door solventeffecten 7. De meeste van de actieve plaatsen in proteïnen zijn gelegen nabij het ​​inwendige gebied waar solventeffecten zijn geminimaliseerd 9,10. Om intrinsieke zuur-base eigenschappen van peptiden en eiwitten te begrijpen, is het belangrijk om de studies uitgevoerd in een oplosmiddel-vrije omgeving.

We presenteren een methode om de zuurgraad van oligopeptiden meten in de gasfase. We maken gebruik van een cysteïne-bevattende oligopeptide, Ala 3 CysNH 3 CH), als modelverbinding. De metingen zijn gebaseerd op de gevestigde uitgebreide Cooks kinetische methode (figuur 1) 11-16. De experimenten zijn uitgevoerd met een drievoudige quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een electrospray ionisatie (ESI) ionenbron (figuur 2). Voor elk peptide monster, worden verscheidene verwijzing zuren geselecteerd. De referentie-zuren zijn structureel vergelijkbaar organische verbindingen met bekende gasfase zuurgraden. Een oplossing van het mengsel van het peptide en een referentie-zuur wordt ingebracht in de massa spectrometer en een gasfase proton gebonden anionische cluster peptidehars referentie zuur wordt gevormd. De proton-gebonden cluster is massa geïsoleerd en vervolgens versnipperd via botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) experimenten. Het resulterende fragment ion abondantie worden geanalyseerd met behulp van een relatie tussen de zuurgraad en de cluster ion dissociatiekinetiek. De gasfase zuurgraad van het peptide dan obtained door lineaire regressie van de thermo-kinetische plots 17,18.

De werkwijze kan worden toegepast op een verscheidenheid van moleculaire systemen, waaronder organische verbindingen, aminozuren en derivaten daarvan, oligonucleotiden en oligopeptiden. Bij vergelijking van de gasfase zuursterkte experimenteel gemeten met de berekende waarden voor verschillende conformeren, kunnen conformationele effecten op de zuursterkte geëvalueerd.

Introduction

De zuurgraad van aminozuurresten van de belangrijkste eigenschappen die de thermochemische structuren beïnvloeden de reactiviteit en de vouwen ontvouwen van proteïnen 9,19. Individuele aminozuren vertonen vaak verschillende effectieve zuurgraden afhankelijk van hun locaties in eiwitten. In het bijzonder de residuen bij de actieve plaatsen vertonen vaak aanzienlijk verstoord zuurgraden. Een voorbeeld hiervan is de cysteïnerest die in de actieve plaatsen van het thioredoxine super-familie van enzymen 20,21. De actieve plaats cysteine ​​ongewoon zuur vergeleken met die in ongevouwen eiwitten 3-5. Er is gesuggereerd dat de schroeflijnvormige conformatie een belangrijke bijdrage aan de ongebruikelijke zuurgraad kan hebben. Er zijn uitgebreide experimentele studies op het zuur-base eigenschappen van peptiden in oplossingen uitgevoerd, vooral in waterige oplossingen 2,6-8. De resultaten werden vaak gecompliceerd door oplosmiddeleffecten7. De meeste van de actieve plaatsen in proteïnen zijn gelegen nabij het ​​inwendige gebied waar oplosmiddel effecten worden geminimaliseerd 9,10.

Om intrinsieke zuur-base eigenschappen van peptiden en eiwitten te begrijpen, is het belangrijk om de studies uitvoeren in een oplosmiddel-vrije omgeving. Hier introduceren we een massaspectrometrie-methode voor de bepaling van de gasfase zuurgraad. De benadering wordt aangeduid als de uitgebreide kookt kinetische methode. Deze werkwijze is met succes toegepast op een brede waaier van chemische systemen voor de bepaling van verschillende thermochemische eigenschappen, zoals de gasfase zuurgraad, de proton affiniteit, het metaalion affiniteit, de elektronenaffiniteit en de ionisatie-energie 11-15, 22-26. We hebben deze methode om de gasfase zuursterkte van een reeks oligo cysteïne-cysteïne-polyalanine en polyglycine peptiden 17,18,27 criteria gelden. Deze studies tonen aan dat het N-terminale cysteïne peptides beduidend zuurder dan de overeenkomstige C-eindstandige opties. De hoge zuurgraad van de eerste zijn waarschijnlijk te wijten aan de schroeflijnvormige conformationele effecten waarin het thiolaatanion sterk gestabiliseerd door de interactie met de macro-helix dipool. Wegens de niet-vluchtig en thermisch labiele aard van peptiden, de kinetische methode is de meest praktische benadering momenteel beschikbaar om redelijk juiste zuur-base thermochemische hoeveelheden peptiden 28 produceren.

De opzet en de vergelijking verband met de kinetische werkwijze zijn weergegeven in Figuur 1. De bepaling van de gasfase zuurgraad van peptide (AH) begint met de vorming van een reeks proton gebonden cluster anionen [A • H • A i] ¯ (of [ï • H • A + i ¯] ¯), in de ionenbron gebied van de massa spectrometer, waarbij A en A i ¯ ¯ de gedeprotoneerde vorm van de peptide ende referentie zuren respectievelijk. De referentie-zuren zijn organische verbindingen met bekende gasfase zuurgraden. De referentie zuren moeten structuren op elkaar (maar niet noodzakelijk gelijk aan die van het peptide). De gelijkenis van de structuur tussen referentie zuren waarborgt de overeenstemming van de entropie van deprotonering onder hen. De proton-gebonden cluster anionen massa geselecteerd en geactiveerd door botsingen en vervolgens gedissocieerd met behulp van botsing geïnduceerde dissociatie (CID) experimenten de overeenkomstige monomere anionen leveren, A en A i ¯ ¯ met snelheidsconstanten van k en k i, respectievelijk getoond in figuur 1a. Als secundaire breukpatroon verwaarloosbaar, de isotopenverhouding van de CID fragment ionen [ï] / [A i ¯], vormt een maat voor de verhouding van de snelheidsconstanten k / k i approximate. In de veronderstelling dat er geen omgekeerde activation belemmeringen voor zowel dissociatie kanalen, het CID product ion vertakking verhoudingen ln [ï] / [A ¯ i], wordt lineair gecorreleerd aan de gasfase zuurgraad van het peptide (Δ acid H) en die van de referentie-zuren (Δ acid H i), zoals getoond in figuur 1b. In deze vergelijking, Δ zuur H avg is de gemiddelde gasfase zuurgraad van de referentie-zuren, Δ (Δ S) is de entropie term (die constant worden aangenomen wanneer de referentie zuren structureel op elkaar lijken), R is universele gasconstante en T eff is de effectieve temperatuur van het systeem. De effectieve temperatuur is een empirische parameter die afhankelijk is van verschillende experimentele variabelen, waaronder de botsingsenergie.

De waarde van de gasfase zuurgraad wordt bepaald door het construeren van twee sets van thermo-kinetische plots. De eerste set is obvervat door het uitzetten van ln ([ï] / [A i ¯]) tegen Δ acid H i - Δ zuur H avg, zie figuur 4a. Lineaire regressie zal een reeks van rechte lijnen opleveren met de hellingen van X = 1 / RT eff en slim van Y = - [Δ zuur H - Δ zuur H avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R. De tweede set curves verkregen door uitzetten van de verkregen slim (Y) van de eerste set op het overeenkomstige helling (X), zoals getoond in figuur 4b. Lineaire regressie produceert een nieuwe lijn met een helling van Δ zuur H - Δ zuur H avg en een intercept van Δ (Δ S) / R. De waarde van Δ H zuur wordt dan verkregen uit de helling en de entropie term, Δ (Δ S), verkregen uithet onderscheppen.

De experimenten zijn uitgevoerd met een drievoudige quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een electrospray ionisatie (ESI) ionenbron. Een schematisch diagram van de massaspectrometer wordt getoond in figuur 2. De CID experimenten worden uitgevoerd door de massa proton gebonden cluster anionen met de eerste quadrupool toestel selecteren en waardoor ze botsingen ondergaan met argon atomen gelekt in de botsing kamer die wordt gehouden op een druk van ongeveer 0,5 mTorr. De dissociatie product ionen worden massa geanalyseerd met de derde quadrupool eenheid. De CID spectra zijn opgenomen met meerdere botsing energieën met de m / z assortiment breed genoeg om alle mogelijke secundaire fragmenten te dekken. Het CID product ionenintensiteiten worden gemeten door het instrument in het gekozen reactie monitoring (SRM) modus waarin de scan is gericht op geselecteerde product ionen. De CID experimenten worden uitgevoerd op vier verschillende botsingsenergieën, overeenkomend metcentrum-van-massa energieën (E cm) van 1.0, 1.5, 2.0, en 2.5 eV, respectievelijk. Het midden-of-massa energie wordt berekend met de vergelijking: E = E cm lab [m / (M + m)], waarbij E lab de botsingsenergie in het laboratorium frame, m de massa van argon, en M de massa van het proton gebonden cluster ion.

In dit artikel gebruiken we de oligopeptide Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) als het model compound. De C-terminus is geamideerd en de thiolgroep (SH) van het cysteïneresidu de zure site. De keuze van een geschikte referentie-zuren is essentieel voor een succesvolle meting van de gasfase zuurgraad. De ideale referentie zuren zijn structureel vergelijkbaar (op elkaar) organische verbindingen met gevestigde gasfase zuurgraad waarden. De referentie zuren moet zuurgraad waarden dicht bij die van de peptiden. Voor het peptide A 3 CH, zes gehalogeneerde carboxylic zuren worden gekozen als referentie zuren. De zes referentie zuren zijn chloorazijnzuur (MCAH) broomazijnzuur (Mbah), difluoroacetic acid (DFAH), dichloorazijnzuur (DCAH), dibromoacetic acid (DBAH) en trifluorazijnzuur (TFAH). Twee ervan zullen DFAH en Mbah, worden gebruikt om het protocol illustreren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van het monster Solutions

  1. Maak eerst de voorraadoplossingen van de peptide en de zes referentie zuren met een gemengd oplosmiddel van methanol en water in een volumeverhouding 1:1. De stamoplossingen moeten een concentratie van ongeveer 10 -3 M. hebben
  2. Weeg 1 mg vaste peptide monster, A 3 CH, in een 1,5 ml Eppendorf buis en voeg 1,0 ml oplosmiddel van methanol en water, en meng met behulp van een vortex.
  3. Weeg 1 mg difluoroacetic zuur (DFAH) en voeg 1,0 ml van het gemengde oplosmiddel van methanol en water, en meng met behulp van een vortex.
  4. Gebruik dezelfde procedure om de voorraad oplossingen te maken voor de andere vijf verwijzing zuren chloorazijnzuur (MCAH), broomazijnzuur (Mbah), dichloorazijnzuur (DCAH), dibromoacetic acid (DBAH) en trifluorazijnzuur (TFAH).
  5. Trekken over 50 ul van het peptide voorraad oplossing in een 1,5 ml Eppendorf buis, en trek ongeveer 50 ul van de stockoplossing van DFAH in de same Eppendorf buis. Verdun de oplossing gemengd met 900 ui gemengd oplosmiddel van methanol en water tot een eindconcentratie van ongeveer 10 -4 M verwezenlijken Deze verdunde oplossing wordt gebruikt als monsteroplossing voor massaspectrometrie gemeten. De werkelijke verhouding van de peptide de verwijzing zuur en de uiteindelijke concentratie van de monsteroplossing wordt aangepast aan het ion abundances signaal waargenomen in de massa spectrometer.
  6. Gebruik dezelfde procedure om de sample oplossingen van het peptide te bereiden met de andere vijf verwijzing zuren.

2. Massaspectrometrie Meting 1: Proton-bound Cluster Ion Vorming

  1. De eerste stap van de massaspectrometrie meting moet stabiel proton gebonden cluster ionen van het peptide met een referentie zuur genereren.
  2. Stel het instrument in de negatieve ion modus van de MS ESI naald spanning op -4,5 kV, de capillaire spanning bij ongeveer -35 V en het drooggas temperatuurgehandhaafd op 150 ° C. Zet de Q1 piekbreedte en de Q3 piekbreedte zowel naar de gekalibreerde schaal (De piek breedte is een parameter instrument dat kan worden gebruikt om de resolutie van de pieken aan te passen. De instelling "schaalverdeling" maakt het mogelijk om smalle pieken weer te geven voor een betere piekscheiding ). De capillaire spanning en drooggas temperatuur worden aangepast aan de waargenomen ionen abundanties verbeteren.
  3. Trekken ongeveer 0,5 ml van het monster oplossing van peptide-DFAH in een 1 ml Hamilton spuit en sluit de spuit aan de ESI naald inlaat met PEEK slangen. Plaats dan de spuit aan de injectiepomp. Zet de spuit pomp naar de monsteroplossing doordringen in de ESI naald met het debiet bij 10 pl / min.
  4. Zet de ESI naald spanning naar de ESI-proces te activeren. Schakel de detector. Een massaspectrum display moet worden waargenomen in de profiel-modus. Als het display in het zwaartepunt modus over te schakelen naar het profiel van de modus. Let op de proton-gebonden cluster ionenvorming door monitoring van de piek bij m / z 428. Het signaal overvloed van de cluster ion kan worden aangepast door fijnafstelling het instrument. Een belangrijke parameter is het capillair voltage. Men kan de capillaire spanning handmatig (typisch in het gebied van -20 tot -50 V) aan de overvloed van de piek bij m / z 428 maximaliseren.

3. Massaspectrometrie Meting 2: De CID Bracketing Experimenten

  1. De volgende stap is om de CID bracketing experiment uit te voeren.
  2. Zodra de overvloed van de cluster ionen de gewenste waarde (ongeveer 100 mV) heeft bereikt, schakelt het toestel naar de MS / MS-modus. In deze modus Q1 fungeert als een massafilter de cluster ion, Q2 fungeert als de botsing cel en Q3 functies isoleren als massa-analysator.
  3. Stel de botsing gas (argon, in dit geval) de druk op 0,5 mTorr en de botsingsenergie op 17 eV. Drie pieken moeten worden geobserveerd in de massa venster spectrumweergave. De piek bij m / z 428 correspondeert met de cluster ion, [DFA • H • A 3 CS] ¯. De twee pieken bij m / z 332 en m / z 95 overeen met de gedeprotoneerde peptide (A 3 CS ¯) en de gedeprotoneerde difluoroacetic zuur (DFA ¯), respectievelijk. De kleine piek bij m / z 298 is een tweede fragment van het gedeprotoneerde peptide. Verwerven van een CID-spectrum voor 2 min, figuur 3a.
  4. Verricht CID experimenten en het verwerven van een CID-spectrum voor het monster oplossing van het peptide met broomazijnzuur (Mbah), figuur 3b.
  5. Verricht CID experimenten en het verwerven van de CID spectra van het monster oplossingen van het peptide met alle andere referentie-zuren. De verkregen CID spectra zullen kwalitatief vergelijkbaar met figuren 3a en 3b, maar het m / z-waarden en de relatieve piekhoogten anders.

4. Massaspectrometrie Meting 3: The Kinetic Method

  1. De laatste stap is om de SRM spectra te verwerven.
  2. Schakel het spectrum display zwaartepunt en zet het instrument om de geselecteerde reactie monitoring (SRM) modus. Houd m / z 428 als de geïsoleerde ionen door de eerste quadrupool (Q1) en in vier massa (massa-tot-lading ratio) wordt gecontroleerd door de derde quadrupool (Q3) in. De vier massa's zijn m / z 428 (de cluster ion) m / z 332 (het peptide ion) m / z 298 (het fragment van het peptide ion) en m / z 95 (DFA ¯ ion). Houd de botsing gasdruk op 0,5 mTorr.
  3. Stel de botsingsenergie op 11,7 eV en het verwerven van de spectra gedurende 5 minuten.
  4. Wijzig de botsingsenergie tot 17,6 eV en het verwerven van de spectra gedurende 5 minuten.
  5. Wijzig de botsingsenergie eV tot 23,4 en 29,3 eV, en het verwerven van de spectra zowel botsingsenergieën gedurende 5 minuten.
  6. Verricht metingen voor het peptide met alle andere referentie-zuren.

5. Data Analysis

  1. Kopieer de waarde van de ion intensiteiten van all de SRM spectra op een Excel-werkblad.
  2. Bereken het CID product ion vertakking verhoudingen, ln ([A ¯] / [A i ¯]), gemeten voor alle zes proton-gebonden clusters op alle vier de botsing energieën. Bemonsteringswaarden worden getoond in Tabel 1.
  3. Plot de waarden van ln ([A ¯] / [A i ¯]) tegen de waarden van Δ zuur H i - Δ zuur H gem. Dit zal vier percelen die overeenkomen met de gegevens op vier botsing energieën, Figuur 4a geven.
  4. Pak de waarden van de pistes en de slim door lineaire regressie van de vier percelen. In dit geval, de pistes zijn positieve waarden en het slim zijn negatieve waarden. Geef het symbool "X" aan de pistes en het symbool "Y" om het slim. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 2. Vermenigvuldig de waarden van Y met -1 en gebruik het symbool Y 'om de positieve waarden geven (dit stelt de y-as display positieve waarden). Merk deze omzetting is optioneel zolang de overeenkomstige waarden worden gebruikt om de plot voor de volgende stap.
  5. Plot de waarden van Y 'tegen de waarden van X, figuur 4b. Lineaire regressie van het perceel levert een helling van 1,706 en een intercept van -0,536. De helling komt overeen met Δ zuur H - Δ zuur H gem. De waarde van Δ zuur H avg is bekend dat 330,5 kcal / mol, bepaald door de set van geselecteerde referentie zuren. De waarde van de gasfase zuurgraad van het peptide wordt dan verkregen uit de helling: Δ acid H (A CH 3) = 332,2 kcal / mol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. De CID bracketing experimenten informatie over de relatieve zuurgraad van het peptide in vergelijking met de geselecteerde referentie zuren. Twee representatieve CID spectra van het peptide (A CH 3) met twee referentie zuren, DFAH en Mbah, zijn weergegeven in figuur 3. In figuur 3a de ion overvloed (piekhoogte) van het peptide ion zwakker is dan die van DFA ¯ en in figuur 3b, de ion overvloed van het peptide ion is sterker dan die van MBA ¯. De twee spectra blijkt dat de gasfase zuurgraad van het peptide in het gebied tussen de zuurgraad van de twee referentie-zuren.
  2. De kwantitatieve waarde van de gasfase zuurgraad van het peptide wordt bepaald uit de kwantitatieve CID experimenten. De thermo-kinetische plots voor de dissociatie van het proton gebonden clusters van het peptide met de zes referentie zuren zijn weergegeven in figuur 4. Lineaire regressie plaatsen volgens de thermo-kinetische relationship tussen de gasfase en de zuurgraad CID product ion vertakking ratio (figuur 1b) geeft de waarde van de gasfase zuurgraad van het peptide A 3 CH, hetgeen 332,2 kcal / mol. Bemonsteringswaarden van de pistes en slim worden getoond in tabellen 1 en 2.

Figuur 1
Figuur 1. De algemene opzet van de verlengde Koks kinetische methode. A) De regeling van de proton-gebonden cluster ionen dissociatie. B) De thermo-kinetische relatie tussen de gasfase zuurgraden en het CID product ion vertakking verhouding. In deze vergelijking, Δ zuur H i is de gasfase zuurgraad waarde van de individuele referentiehoeveelheid zuren, Δ zuur H avg is het eenverage gasfase zuurgraad van de referentie-zuren, zuur Δ H de gasfase voor de zuurgraad van het peptide, Δ (Δ S) is de entropie term, R de universele gasconstante en T eff is de effectieve temperatuur van het systeem .

Figuur 2
Figuur 2. Een schematische tekening van een triple-quadrupool massaspectrometer. ESI is het elektrosprayionisatie ionenbron. Q1 en Q3 zijn de eerste en derde quadrupool eenheden, respectievelijk. Bij het uitvoeren van de CID experiment worden de proton gebonden cluster ionen massa geselecteerd door Q1 en worden geleid in de botsing cel te botsen met argon (Ar) bevatten gelekt in de botsing cel en de resulterende fragment-ionen worden geanalyseerd door Q3.

Figuur 3 Figuur 3. De CID spectra voor de proton-gebonden cluster ionen van de peptide met twee referentie-zuren, a) [DFA • H • A 3 C] ¯ en b) [MBA • H • A 3 C] ¯. De spectra worden uitgezet als de relatieve ion overvloed tegen de m / z waarde.

Figuur 4
Figuur 4. De thermo-kinetische percelen voor het peptide met zes verwijzing zuren op vier botsingsenergieën verzameld a) De plot van Y = ln ([A ¯] / [A i ¯]) tegen X = Δ zuur H i -. Δ zuur H avg . b) De plot van Y '= [Δ zuur H - Δ zuur H </ Em> avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R tegen X = 1 / RT eff.

Tabel 1. Waarden van CID product ion vertakking verhoudingen, ln ([A ¯] / [A i ¯]), voor het cluster ionen van de peptide met DFAH en Mbah.

HA i 11.7 eV 17.6 eV 23,4 eV 29.3 eV
MCAH 3.68 3.50 3.39 3.45
Mbah 2.83 2.65 2.45 2.24
DFAH -0,442 -0,268 -0,0921 0.167
DCAH -2,60 -2,41 -2.22 -2.13
DBAH -2.43 -2.44 -2,49 -2,60
TFAH -5,41 -5,02 -4,71 -4,44
Tabel 2. Waarden van de pistes (X) en slim (Y) als gevolg van lineaire regressie van de eerste reeks thermo-kinetische plots.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De succesvolle meting van de gasfase zuurgraad van een peptide grotendeels op de selectie van geschikte referentie zuren. De ideale referentie zuren zijn structureel vergelijkbaar organische verbindingen met gevestigde gasfase zuurgraad waarden. De referentie zuren moet soortgelijke structuren op elkaar. Dit zal zorgen voor een soortgelijk entropie van deprotonering voor elk van de referentie-zuren in de set. De referentie zuren moet zuurgraad waarden dicht bij die van de peptiden. Voor kortere cysteïne-bevattende peptiden met geamideerd C-uiteinden, de gehalogeneerde carbonzuren zijn geschikt referentie zuren. Een cruciale stap naar een succesvolle CID experimenten is de vorming van de stabiele proton gebonden cluster ionen met grote dichtheid. De stabiliteit en de overvloed kan sterk worden verbeterd door het aanpassen van de verwijzing zuur, de concentratie van de monsteroplossing en de instrumentele omstandigheden (zoals naald spanning, het drogen van de verhouding van het peptidegastemperatuur, en de capillaire spanning). Een cruciaal instrumentale voorwaarde is de capillaire spanning (of kegel spanning voor een aantal andere soorten instrumenten). Een waarschuwing is te voorkomen met behulp van sample oplossingen die ook zijn geconcentreerd.

De beschreven methode is niet beperkt tot oligopeptiden. De werkwijze kan worden toegepast op een verscheidenheid van moleculaire systemen, waaronder polaire organische verbindingen, aminozuren en derivaten daarvan, organometaalverbindingen, oligonucleotiden en peptide-nabootsende polymeren. Naast het gebruik van de triple-quadrupole massaspectrometer kan de proef worden uitgevoerd met ionenafvangers en Q-TOF massaspectrometer.

Het peptide gebruikt in dit experiment werd gesynthetiseerd in ons laboratorium met de standaardmethode van vaste fase peptidesynthese 29-31. De Rink amide hars werd gebruikt als vaste drager om het amide C-terminus verkregen. Het voordeel van de Cooks kinetische methode is dat kleine verontreinigingen in thij peptide monster geen invloed op de zuurgraad metingen, zolang de verontreinigingen niet dezelfde massa als de peptiden of de referentie zuren.

De experimentele metingen kunnen worden gekoppeld computerexperimenten conformationele effecten op de zuursterkte onderzoeken. Computationele studies bieden voorspellingen van de conformaties van de peptiden die overeenkomen met hun berekende zuurgraden. Bij vergelijking van de zuurgraad experimenteel gemeten met de berekende waarden, kan de conformaties van de peptiden geëvalueerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Niets te onthullen.

Acknowledgements

Materials

E colli, eV

X

1 / RT eff

Y

- [(Δ zuur H - Δ zuur H avg) / RT eff - Δ (Δ S) / R]

11.7 0.744 -0,728
17.6 0.700 -0,665
23.4 0.665 -0,611
29.3 0.645 -0,553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48, (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2, (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35, (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282, (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277, (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253, (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116, (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268, (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14, (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13, (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34, (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115, (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118, (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31, (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113, (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21, (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3, (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91, (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39, (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112, (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113, (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106, (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267, (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16, (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics