Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno

Immunology and Infection

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Summary

Per comprendere un collegamento tra la risposta immunitaria e il comportamento, si descrive un metodo per misurare il comportamento motorio in

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Kuo, T. H., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila. J. Vis. Exp. (70), e4355, doi:10.3791/4355 (2012).

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Abstract

Una complessa interazione tra la risposta immunitaria e comportamento host è stato descritto in una vasta gamma di specie. Sonno eccesso, in particolare, si verifica come risposta a infezione nei mammiferi e 1 è stata recentemente descritta in Drosophila melanogaster 2. E 'generalmente accettato che il sonno è vantaggioso per l'host durante un'infezione e che è importante per il mantenimento di un robusto sistema immunitario 3,4. Tuttavia, prove sperimentali che supporta questa ipotesi è limitata 4, e la funzione del sonno eccesso durante una risposta immunitaria è chiaro. Abbiamo usato un approccio multidisciplinare per affrontare questo problema complesso, e hanno condotto studi nel sistema semplice modello genetico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Usiamo un test standard per misurare il comportamento locomotorio e dormire in mosche, e dimostrare come questo test viene utilizzato per misurare il comportamento di mosche infected con un ceppo di batteri patogeni. Questo saggio è utile anche per monitorare la durata della sopravvivenza in mosche singoli durante un'infezione. Ulteriori misure della funzione immunitaria includono la capacità di mosche per cancellare una infezione e l'attivazione di NFκB, un fattore di trascrizione chiave che è fondamentale per la risposta immunitaria innata in Drosophila. Sia esito di sopravvivenza e la clearance batterica durante l'infezione insieme sono indicatori di resistenza e tolleranza alle infezioni. Resistenza si riferisce alla capacità di mosche per cancellare un'infezione, mentre la tolleranza viene definita come la capacità di accoglienza per limitare i danni di un'infezione e quindi sopravvivere nonostante alti livelli di patogeni all'interno del sistema 5. Monitoraggio in tempo reale delle attività in corso di infezione NFκB permette di comprendere un meccanismo molecolare di sopravvivenza durante l'infezione. L'uso di Drosophila in questi saggi semplici facilita le analisi genetiche e molecolari di sonnoe la risposta immunitaria e come questi due sistemi complessi sono reciprocamente influenzati.

Protocol

Questo protocollo utilizza due configurazioni (Figura 1) per acquisire quattro letture differenti raccolti da mosche sottoposte ad una infezione batterica. Queste uscite sono 1) sonno / veglia comportamento, 2) esito di sopravvivenza; 3) carica batterica al volo e 4) misurazione in tempo reale di attività giornalista NFκB in vivo. In combinazione con gli strumenti genetici che sono disponibili in Drosophila, queste misurazioni forniscono informazioni meccanicistica sul legame molecolare tra la funzione immunitaria e comportamento.

1. Misurare l'attività locomotoria e del sonno in mosche

  1. La configurazione utilizzata per misurare l'attività locomotoria e dormire mosche, che include il sistema di attività di monitoraggio Drosophila (DAM2, Trikinetics), incubatori, camera oscura, e la preparazione degli animali da esperimento e tubi di attività, è stato descritto in precedenza 6. Lo stesso approccio è utilizzato qui, con qualche piccola modifica.
    1. Provette dell'attività sono pulite per il riutilizzo mediante ebollizione su piastra calda in acqua deionizzata. Una piccola quantità di detersivo viene aggiunto per primo l'ebollizione, i tubi sono ben sciacquati e bollito altre due volte. Se filato viene utilizzato per collegare il tubo, tubi all'attività usati (contenente cibo, cera, fly e filo) può essere pulito senza previa rimozione del filato.
  2. Prima di iniziare un esperimento, culture posto contenenti tardi pupa in scena mosche in incubatrici per tre o quattro giorni per adattarsi all'illuminazione sperimentale e altre condizioni ambientali. Luce: condizioni di oscurità o la costante sono stati comunemente usati per misurare il comportamento del sonno. In questo esempio, mosche sono acclimatati a luce costante per eliminare l'influenza dell'orologio circadiano sulla risposta immunitaria e comportamento 2,7,8. Come descritto in Figura 1A 6 e record per un minimo di tre giorni prima l'infezione.

2. Infect mosche con un ceppo patogeno di batteri

  1. Il protocollo qui descritto è specifico per S. marcescens, che sono facili da coltivare e mantenere. Protocolli per la conservazione a lungo termine e condizioni di coltura per altre specie batteriche possono variare. S. marcescens sono memorizzati in 15-50% glicerolo a -80 ° C. Per preparare per conservazione a lungo termine, mescolare 2 volumi di coltura batterica durante la notte (OD 600 = 0.5 - 1.0) a 1 volume di autoclavato glicerolo al 50% in tubi microcentrifuga da 1,5 ml. Questo si tradurrà in una concentrazione finale di glicerolo 17%. Memorizzare provette a -80 ° C. Per preparare a breve termine in uso fonte di batteri, raschiare il brodo congelato con una sterile 200 microlitri puntale ed eseguire un tre vie striscia su una piastra di agar LB. Incubare la piastra durante la notte a 37 & dad esempio, C per ottenere colonie isolate. Conservare la piastra a 4 ° C.
    Un giorno prima che l'infezione in programma, scegliere una singola colonia dalla piastra di agar LB con una sterile 200 microlitri puntale e immergere la punta in una provetta contenente 5 ml di terreno LB. Crescere batteri durante la notte, o fino a 16 ore all'interno di un agitatore incubatore a 37 ° C e 250 rpm fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale. Misurare la concentrazione con uno spettrofotometro a OD 600. La concentrazione in questa fase va da 0,5 a 1. Se la concentrazione è troppo elevata, eseguire sottocolture i batteri e crescere per altre diverse ore per ottenere una concentrazione ottimale. Eseguire la procedura nei pressi di una sorgente di fiamma. Alcuni ceppi batterici sono progettati per la resistenza antibiotica e vengono coltivate e selezionate per antibiotico appropriato aggiunto al mezzo. S. marcescens (ATCC # 8100) non sono resistenti agli antibiotici e quindi coltivate in mezzo sterile senza antibiotico. Per verificare tecnica sterile, fare un finto culri senza batteri come controllo.
    La soluzione di infettare mosche contiene batteri (diluito a OD 600 = 0.1) e coloranti alimentari 1% (blu brillante FCF) in PBS. Preparare una soluzione iniettabile di controllo aggiungendo quantità equivalente di terreno LB utilizzato in soluzione infezione e 1% colorante alimentare blu in PBS. Conservare le soluzioni su ghiaccio.
  2. Preparare gli aghi per l'iniezione di vetro le mosche. Tirare capillari di vetro (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) a una punta fine con un estrattore micropipetta (Narishige). Sotto un microscopio per dissezione, utilizzare una pinza sottile per rompere la punta dell'ago in modo che l'apertura è grande abbastanza da riempire con fluido iniezione aspirazione mediante una siringa, ma abbastanza piccolo per minimizzare i danni al volo durante il processo di iniezione. Dopo la rottura della punta, la grandezza della punta dovrebbe essere di circa 40-50 micron. L'ago di vetro è attaccato ad una siringa di plastica 3 cc con un pezzo di tubo. Il flusso del fluido di iniezione viene controllata manualmente applicando una pressione positiva o suzione con la siringa. Evitare di contaminare il tubo di gomma con iniezione di fluido, come l'apparato siringa viene utilizzata sia per infezione e iniezioni di controllo.
  3. Anestetizzare mosche mettendoli su un CO 2 pad. CO 2 viene fatto passare attraverso un contenitore sigillato di acqua per umidificare il pad e di ridurre l'elettricità statica, che può complicare la manipolazione di mosche sul pad. Iniettare mosche colpendo l'ago di vetro nella regione al di sopra della scutello del torace dorsale. Il passaggio del mezzo iniezione al volo viene verificata dal colorante alimentare - mosche diventano blu in quanto gli spread coloranti degli alimenti attraverso il sistema. La dose di batteri che ricevono mosche può essere quantificato come descritto nella sezione 3 di seguito. Alcuni disegni sperimentali includono un gruppo di controllo che riceve pregiudizio asettico, iniettando le mosche con coloranti PBS e cibo, ma senza batteri.

3. Determinare la carica batterica

Un approccio per evaluating la risposta immunitaria contro l'infezione batterica è determinare l'infezione batterica postale carico. D. melanogaster è un grande modello per determinare questo parametro, perché al volo tutto può essere omogeneizzato per stimare il numero totale di batteri all'interno di un individuo. La logica alla base di questo protocollo è che quando coltivate su un mezzo solido come brodo Luria (LB) agar in una piastra (piastra LB), un singolo batterio forma una colonia visibile distinguibile. Pertanto, omogeneizzando mosche infette in terreno LB liquido, generando diluizioni seriali del omogenato, e diffondere l'omogenato diluito su piastre LB, il numero di cellule batteriche infettare una mosca può essere determinato. Un gruppo di controllo di mosche iniettati con PBS e colorante alimentare ma senza batteri dovrebbero essere utilizzati per verificare che l'infezione non è stato contaminato con altre specie batteriche. Non ci dovrebbero essere colonie sulla piastra LB agar in questa condizione.

  1. Autoclavare tutti materiali che saranno utilizzati per questoprocedura prima di eseguire la fase effettiva omogeneizzazione. Questo comprende 200 puntali ul tagliati con le forbici, i media LB, e pestelli utilizzati per la omogeneizzazione. Preparare piatti versando autoclavato LB / agar in media 10 centimetri piatti Petri sterili almeno 1 giorno prima omogeneizzazione mosche.
  2. Anestetizzare e raccogliere le mosche in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare le provette su ghiaccio.
  3. Eseguire l'omogeneizzazione nei pressi di una fiamma per evitare la contaminazione. Una omogeneizzazione di controllo contenente le mosche senza infezione è consigliabile soprattutto quando si utilizza un ceppo batterico, come S. marcescens, che non sono resistenti agli antibiotici. Omogeneizzare un minimo di 2 gruppi di 10 mosche per ogni condizione sperimentale. Il numero di mosche utilizzati per omogenato è determinata dallo sperimentatore. Alcuni gruppi hanno utilizzato una mosca per omogeneizzato, che è utile per valutare la variazione della carica batterica tra le mosche singole 8, mentre altri ricercatori hanno utilizzato 3-10 mosche per omogenatodi confrontare tra genotipo o dalla condizione sperimentale 9-12.
    1. Aggiungere 400 microlitri LB medio a ciascuna provetta contenente mosche e omogeneizzare con un piccolo motore e pestello (Kontes).
    2. Utilizzando sterilizzati puntali tagliati, di serie diluire 1:10 omogeneizzato con l'aggiunta di 20 pl omogeneizzato LB / media batterica a 1,5 microprovetta microlitri contenente 180 microlitri media LB. Consigli per il taglio pipette prevenendo l'ostruzione da detriti volanti e assicura che un volume adeguato in fase di trasferimento.
    3. Fattore di diluizione viene determinato empiricamente e dipende dal genotipo della mosca, il ceppo batterico utilizzato, e condizione sperimentale. Per il tipo selvatico vola infettati con S. marcescens, utilizzare diluizioni di 1:10 2 o 1:10 3 per le mosche omogeneizzati immediatamente dopo l'infezione, e le diluizioni di 1:10 4 o 1:10 5 per mosche omogeneizzato 24 ore dopo l'infezione.
    4. Aggiungere 100 microlitri LB / media batterica dal microfonotubi rocentrifuge contenenti la diluizione finale e la diffusione del mezzo su una piastra di LB con sfere di vetro (VWR) per garantire una distribuzione uniforme.
    5. Eliminare le palle di vetro in 100% EtOH soluzione. Posizionare le piastre LB in un incubatore a 37 ° C durante la notte.
    6. Come passaggio facoltativo, utilizzare un sistema di imaging con luce visiva per ottenere un'immagine delle piastre LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contare il numero di colonie o sulla stessa piastra o dall'immagine della piastra utilizzando lo strumento conta su Photoshop software (Adobe Photoshop CS3).
    7. Calcolare il numero di unità formanti colonia per volo usando la formula: [N / (N * D * v)] * V, dove n = numero di colonie cresciute sulla piastra LB; N = numero delle mosche riunito in un unico provetta, D = fattore di diluizione, e v = volume della soluzione si diffuse su ogni piatto; V = volume iniziale del omogeneizzato.

4. Valutare sonno e durata di sopravvivenza dopo l'infezione

  1. Permosche che non sono raccolte per misurare carica batterica, continuare a monitorare il comportamento per altri 7-10 giorni. Durata sopravvivenza è influenzata dal genotipo della mosca, condizioni ambientali, e le specie batteriche utilizzate per l'infezione.
  2. Dopo circa 10 giorni, interrompere l'esperimento, scaricare ed elaborare i dati comportamentali come descritto in precedenza 6. Insomniac2 software personalizzato, che si basa in Matlab, viene utilizzato per analizzare i parametri del sonno. È importante eliminare mosche morte dall'analisi comportamentale. Normalmente, questo limita analisi entro il primo giorno dopo l'infezione, a seconda del tipo di infezione e genotipo mosca. Morte nel saggio è indicata dal tempo tutti i conteggi attività arrivato a zero. Per facilitare l'analisi della sopravvivenza, Drosonex, software personalizzato scritto in Microsoft Visual C + + 6.0, viene utilizzato per elaborare file di dati dal sistema DAM Trikinetics. Le relazioni software come file di Excel, la durata di sopravvivenza di ogni volo (in ore), compila attività datuna da tutti i monitor in un foglio singolo, e riporta la percentuale vola sopravvivere nel tempo impostato dall'utente. I file di Excel sono progettati per integrarsi in altri pacchetti software statistici per ulteriori analisi.

5. Misurare l'attività NFκB durante l'infezione usando un saggio Luciferase Reporter

Transgenico kB-luc mosche utilizzato in questa analisi sono stati generati come descritto in precedenza Kuo et al., 2010 2. Brevemente, il kB-luc giornalista contiene 8 ripetizioni di una sequenza NFκB vincolante che sono stati inseriti in un promotore a monte di una cornice di lettura aperta luciferasi.

  1. Regolare mosche alle condizioni di illuminazione sperimentali, come descritto nella sezione 1.2. In questo esempio, 1-4 giorni vecchi kB-luc mosche sono alloggiati in fiale contenenti meno di 5%, 2% agar e terreno alimentare messo in luce costante (LL) per 2 giorni per raggiungere la stessa età di altre mosche durante l'infezione.
  2. Preparare una micropiastra a 96 pozzetti per le mosche. Ogni pozzetto contiene due strati di supporto alimentare (figura 2), lo strato superiore contiene luciferina, il substrato di luciferasi. Aggiungere 300 pl di un 5% di saccarosio, soluzione di agar al 2% in ogni pozzetto e lasciare solidificare. Successivamente, aggiungere un 50 microlitri strato superiore ad ogni saccarosio e contenente il 5%, 1% agar, e 2 mM luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentrazioni luciferina utilizzati per attività reporter di misurazione in Drosophila hanno variato in letteratura, e sono stati a partire da 100 pM 13. La concentrazione richiesta può essere determinato empiricamente. Tra gli strati erogazione alimentari, coprire la piastra con un panno maglia fine per facilitare l'asciugatura mantenendo la sterilità. La piastra deve essere permesso di asciugare completamente, fino a un'ora, in modo da evitare che le mosche di rimanere bloccati in goccioline di condensa. Perché luciferina è sensibile alla luce, evitare di esporre le piastre alla luce più del necessario.
  3. Applicare un film trasparente adesivo (Top-Seal-A; Perkin Elmer) ad una piastra da 96 pozzetti micropozzetti e perforare con un ago fine in una quantità di 2 fori per pozzetto. Questi buchi non solo permetterà ricambio d'aria in ogni pozzetto, ma fornirà anche un modo per anestetizzare le mosche su base individuale. Utilizzando una lama affilata e regolo, introdurre un taglio tra ogni colonna. Ciò fornirà un modo semplice per caricare / scaricare mosche in gruppi di 8 alla volta.
    Per caricare mosche nella piastra Elisa, togliere i flaconcini dal termostato e vola anestetizzare un CO 2 pad. Carico vola uno ad uno ad ogni pozzetto colonna per colonna. Se una mosca inavvertitamente si blocca al sigillo adesivo, lasciare al volo da solo in quanto sono spesso in grado di liberarsi senza l'intervento. Riportare la micropiastra per l'incubatrice in LL per 8-24 ore di adattarsi al nuovo ambiente e di consumare il substrato luciferina.
  4. Batteri Cultura, S. marcescens, e preparare una soluzione di infezione come descritto sopra.
  5. Anestetizzare tvola utilizzando una punta micropipetta collegato a una bassa pressione di CO 2 righe. Posizionare la punta della micropipetta direttamente sopra i fori di ventilazione realizzati per ciascun pozzetto. Fare attenzione per assicurare che la pressione di CO 2 è sufficientemente elevata per anestetizzare il volo, ma abbastanza basso per evitare lesioni al volo. In gruppi di otto, singolarmente trasferire ciascun volo a un pad CO 2, e infettare come descritto sopra. Dopo l'infezione, ritornare ogni mosca al suo originale bene e sigillare la micropiastra.
  6. Misura luminescenza (TopCount NXT-Luminescenza e contatore a scintillazione, Perkin-Elmer). Il contatore luminescenza TopCount contiene una cassetta di impilamento dei piatti, che consente per le letture programmate e automatico continuo con incrementi desiderati per un certo periodo di tempo (di solito fino a cinque giorni). Questa funzione non è disponibile su tutti gli strumenti, e la raccolta di dati per esperimenti eseguiti con altri strumenti possono essere quindi meno frequenti. Il contatore luminescenza è alloggiato in un room a temperatura controllata e pianificazione illuminazione. Sistemare i piatti nel cassetto di impilamento, impilare le tavole contenenti le mosche tra chiari lastre vuote per far sì che le mosche ricevere luce. Programmare il luminometro secondo le specifiche del produttore di raccogliere le letture ogni ora per un minimo di 24 ore. In questo esempio, i rilevatori sono programmati per leggere ogni pozzetto per 10 sec e per esprimere il risultato come conteggi (unità arbitrarie) al secondo. Questo valore è una media su 3 letture al bene. Esportare i file di dati in un foglio di calcolo e di eseguire una analisi standard, graficamente i risultati di luminescenza.

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Representative Results

  1. Infezione favorisce il sonno. In questo esempio, Canton-S (CS) mosche wild type e mosche mutanti privi di un gene NFκB, Relish (Rel E20) 14, sono stati caricati in due DAM2 controlla l'attività (n = 32 per ogni genotipo) ed infettati come descritto sopra. Mosche sono stati mantenuti in luce costante per eliminare l'influenza dell'orologio circadiano sul comportamento e infezione 2,7,8. I mutanti sono stati E20 Rel isogenized al CS come descritto in precedenza 11. Entrambe le serie di mosche sono stati infettati con S. marcescens ei risultati sono illustrati nella Figura 3. In alcuni casi, un ulteriore gruppo di controllo trattati è utile per differenziare gli effetti di manipolazione da effetti di infezione 2. Gruppi di controllo trattati sono esposti agli stessi mutamenti ambientali come i gruppi infetti, che comprende la rimozione dal incubatori e anestesia per la stessa durata di tempo, ma non ricevono una iniezione. Tuttavia, in questo esempio, è chiaro che Rel E20 mutanti sperimentare meno sonno di controllo CS vola dopo l'infezione (Figura 3A). Come descritto in precedenza 6, ci sono altri parametri comportamentali che possono essere misurati dal dosaggio DAMS. Questi possono includere conteggi attività totale per unità di tempo (Figura 3B). In questo esempio, la variazione di attività dopo specchi infezione di sonno. Si segnala inoltre il tasso di attività, o conta di attività al minuto di veglia (Figura 3C). Questo parametro è un indicatore della capacità locomotoria in mosche. In questo caso, i tassi di attività veglia non cambiano in entrambi genotipo durante l'infezione, il che suggerisce che la riduzione dell'attività o aumento nel sonno non è un risultato della capacità locomotoria ridotta.
  2. Figura 4A illustra il tasso di sopravvivenza dopo infezione. In linea con i risultati precedenti 14,15, Rel. E20 mutanti rapidamente soccombere alla inperfezione rispetto alle mosche di tipo selvatico. La maggior parte dei sopravvissuti mosche l'iniezione asettico di controllo (Figura 4B), che indica che vola ceduto l'infezione e non al pregiudizio a causa dell'iniezione. Poiché i mutanti Relish morto così velocemente, solo mosche CS sono stati usati per dimostrare la carica batterica dopo l'infezione (Figura 5). Figura 5 mostra che S. marcescens continua a proliferare in volo 24 ore dopo l'infezione.
  3. Attività reporter luciferasi è raffigurato nel tempo nel saggio in quattro mosche individuali (Figura 6). Grande variazione tra i punti dati e mosche individuali può essere attribuito alle mosche si spostano all'interno dei pozzetti. Anche se il segnale è derivata da tutti i tessuti all'interno della mosca, non si prevede che ogni tessuto avrebbe emettono la stessa quantità di segnale, e la visibilità del tessuto al rivelatore varierebbe come si muove mosca. In questo esempio, sono stati infettati mosche e confrontaticon un gruppo di controllo trattato. Mosche che sono morti sono stati esclusi dall'analisi in un gruppo di mosche mostrato in figura 7A. Le mosche morte sono determinati mediante ispezione visiva. In queste mosche, vi è una forte riduzione del segnale di luciferasi, nonché una diminuzione della variazione del segnale, che indica che la mosca non si muove. KB-luc attività giornalista aumenta costantemente dopo l'infezione (Figura 7A) e lesioni asettica (figura 7B ). Il giornalista picchi di attività in giro per 12 ore post-infortunio e post-infezione. Manipolazioni genetici e / o comportamentali di mosche si prevede di modificare kB-luc attività di giornalista durante l'infezione. Per esempio, abbiamo precedentemente descritto 2 che l'induzione di kB-luc attività reporter era largamente attenuato durante l'infezione in Rel E20 mutanti, indicando questo kB-Luc reporter è specifico per NFκB.


Figura 1. Diagramma di flusso che illustra le fasi principali di misurare le risposte immunitarie in Drosophila (A) La sequenza di passi viene descritto per misurare il sonno, la sopravvivenza e carica batterica durante un'infezione;. (B) La sequenza di passi viene descritto per misurare NFκB-dipendente reporter di attività luciferasica durante l'infezione. Esperimenti possono continuare ovunque da 1-5 giorni, a seconda della letalità di specie batteriche utilizzate.

Figura 2
Figura 2. Flies schematiche di un singolo pozzetto della micropiastra. Sono collocati in opaco, piastre da 96 pozzetti contenenti terreno e coperto come mostrato. Perché le mosche saranno trattati singolarmente di essere infetti, è importante to limitare il numero di mosche per piastra ad una quantità che può essere gestito entro un determinato periodo di tempo, a seconda delle circostanze sperimentali.

Figura 3
Figura 3. Comportamento di risposta di mosche infettati con S. marcescens. (A) Media ± SEM per cento il tempo che vola a pelo esaurito e (B) Media ± SEM conteggi di attività totali sono tracciati in incrementi di 4 ore per 1 giorno prima e dopo l'infezione con S. marcescens. (C) Media ± SEM conteggi di attività al minuto di veglia prima (BL = baseline) e dopo l'infezione con S. marcescens è tracciata in incrementi di 8 ore. Il comportamento è riportato per wild-type mosche CS che sono sopravvissuti per almeno 24 ore dopo l'infezione, e per immuno-deficiente Rel E20 vola that sopravvissuti per almeno 8 ore dopo l'infezione. n = 13 per CS e per Rel. E20. ** = P <0.01 * = p <0,05, studente t - test.

Figura 4
Figura 4. Esito di sopravvivenza delle mosche infetti e non infetti. (A) Rappresentante di Kaplan-Meier di sopravvivenza sono tracciate sia per il wild-type CS e immunodeficienti mosche E20 Rel che sono stati infettati con S. marcescens. p = 8.13x 10 -13, log rank test. n = 31 per CS e n = 32 per le mosche E20 Rel. (B) rappresentante Kaplan-Meier di sopravvivenza sono riportati come in (A), tranne mosche ricevuto lesioni asettica per iniezione con liquidi senza batteri. Quasi tutte le mosche sopravvissuto pregiudizio asettico fino al termine degli esperimenti (60 lesioni messaggio hr). p> 0,97, log rank prova, n = 32 per CS e Rel. E20 mosche.

Figura 5
Figura 5. Quantificazione della carica batterica in linea con infezione da S. marcescens. (A) Rappresentante della cultura batterica da CS mosche infettati con S. marcescens, che sono state raccolte subito dopo l'infezione (pannello a sinistra), o 24 ore dopo l'infezione (pannello di destra). Fattori di diluizione sono indicati di seguito ogni figura. In questo esempio, 10 mosche sono stati omogeneizzati in 400 ul di soluzione per ogni gruppo. 100 pl di tale soluzione è stata sparsa su ogni piatto. La piastra di sinistra contiene 29 unità formanti colonie (ufc). Per calcolare ufc / volare, dividere 29 cfu entro [10 mosche * 0,001 (fattore di diluizione) * 100 ul (diffusione del volume sulla piastra)], che è uguale a 29, e quindi moltiplicare per il volume iniziale di 400 microlitri = 11600. Per questo piatto particolare, abbiamo una media di 1,16 x 10 4ufc / mosca. La piastra di destra contiene 257 colonie. Utilizzando la stessa formula, si trova una media di 1,03 x 10 6 ufc / mosca. (B) Dopo aver calcolato ufc / fly ciascuna piastra in ogni condizione sperimentale, generare box-and-whisker, come mostrato. In questo esempio, il 25, 50 ° percentile (mediana) e 75 sono presentati come la metà inferiore e superiore della finestra. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard in tre esperimenti indipendenti. ** P <0,01 studente t-test.

Figura 6
Figura 6. NFκB dipendente giornalista attività di luciferasi in linea individuali con infezione da S. Esempi rappresentativi. marcescens di dati grezzi sono indicati per le singole mosche non infette (controllo trattati; pannelli a sinistra) e le mosche infette (pannelli a destra). Una lettura di base (tempo '0 ') è stato raccolto immediatamente prima infezione o manipolazione; tutti gli altripunti temporali sono stati raccolti dopo mosche stati trattati. Notare le differenze di scala nelle assi y tra mosche nelle condizioni di controllo infetti e trattati. Grande variazione del segnale all'interno di ciascun volo può essere attribuito al movimento della mosca all'interno del pozzetto.

Figura 7
Figura 7. L'infezione da S. marcescens o lesioni ad iniezione asettica aumenta kB-luc attività di giornalista in mosche vive. Media ± SEM attività luciferasi (unità arbitrarie) è tracciata ogni 4 ore in tutte le mosche che sono stati infettati (A) o ferite da iniezione asettico (B) ed è sopravvissuto fino a 24 nel saggio. One-way ANOVA con misure ripetute indicato che l'attività di giornalista aumentata significativamente nel infetto (p <0,05), feriti (inj; p <0.01), e la loro con trattaticontrollo (HC, p <0.01) rispetto al gruppo di riferimento (il loro tempo '0 '; Tukey post-hoc). (Inserisci, pannello A): I dati del gruppo HC sono tracciati su una scala diversa. Il piccolo ma significativo aumento dell'attività giornalista nel gruppo HC suggerisce che in linea può avere sperimentato stress lieve o aumentare lo stato di veglia dalla manipolazione (trasferimento da e per la micropiastra ed equivalente anestesia alle mosche infette). Entrambi i gruppi infetti e leso abbia dato forti induzioni di kB-luc attività di giornalista che erano significativamente più elevata rispetto a quella del gruppo HC in punti temporali indicati * = p <0 .05; ** = p <0 .01;. Studente t - test; Per (A) n = 20 HC e n = 13 Infezione; per (B) n = 15 HC e n = 14 lesioni.

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Discussion

Questo protocollo delinea un approccio per studiare come comportamento, particolarmente dormire, è connesso a parametri di risposta immunitaria. Questi parametri includono la carica batterica, esito di sopravvivenza, e l'attività NFκB come misurato da un reporter luciferasi in vivo. Insieme essi danno informazioni su quanto bene una mosca in grado di combattere l'infezione. Carica batterica e dei risultati di sopravvivenza sono parametri di risposta immunitaria che comportano una misura semplice in Drosophila. Rel E20 mutanti, che mancano di un fattore di trascrizione NFκB che è centrale per la risposta immunitaria, soccombono rapidamente alle infezioni batteriche. Manipolazioni genetiche o di altro tipo di comportamento può anche influenzare i parametri della risposta immunitaria, probabilmente influendo sulle attività NFκB stesso. Ad esempio, la privazione del sonno prima di infezione aumenta l'espressione di mRNA Relish, e riduce ufc / volare rispetto al non-private controlli 11. Mutandists dei geni orologio d'epoca, 7 e 8, senza tempo sono stati segnalati anche per ridurre la sopravvivenza durante l'infezione e la clearance batterica 8. Ulteriori studi che utilizzano questo approccio sono tenuti a fornire la comprensione meccanicistica di come il comportamento può influenzare la funzione immunitaria.

L'iniezione / infezione procedura che descriviamo qui è modificato da un metodo descritto precedentemente da Wu et al 16. Questa procedura è semplice e poco costoso. Tuttavia, uno svantaggio è che il controllo manuale del volume di iniezione con l'utilizzo di colorante come indicatore è grezzo e possono contribuire alla variabilità. Altri gruppi hanno utilizzato una microiniettore per consentire a un volume costante di iniezione 17, o hanno pugnalato mosche con un ago imbevuto di coltura batterica 18. Tuttavia, il metodo qui presentato è riuscita a individuare i cambiamenti nella clearance batterica attraverso condizioni sperimentali 11,19 </ Sup>.

La sopravvivenza delle mosche durante l'infezione è in genere quantificato contando le mosche rimanenti a intervalli regolari prestabiliti. Qui usiamo il sistema DAM Trikinetics per monitorare il momento del decesso in mosche individuali, che è indicata dalla cessazione di attività. Abbiamo verificato che l'esito di sopravvivenza come determinato da attività locomotoria è lo stesso di quello determinato mediante ispezione visiva delle mosche nelle provette dell'attività durante l'infezione (non pubblicata). Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per misurare life span 20,21. Tuttavia, è importante notare che la valutazione della sopravvivenza nel sistema DAM è limitata a quella in mosche isolate, e che i risultati ottenuti da questa condizione dovrebbero essere diversi da quelli in condizioni raggruppati. I primi studi hanno mostrato differenze in termini di sopravvivenza quando l'host è posto in condizioni di isolamento rispetto a gruppi di 22. Studi recenti hanno inoltre confermato che durata della vita in gruppi di mosche è più lungoquello in mosche isolate 20.

Attività reporter luciferasi è stato utilizzato in precedenza per l'analisi di espressione genica orologio in mosche viventi (ad esempio, ref 23). In questi casi, altre considerazioni tecniche sono necessarie, in particolare l'esaurimento del substrato luciferina che si verifica più giorni di eseguire il test. In contrasto, il saggio descritto qui è limitato alla sopravvivenza delle mosche infette e coinvolto una misurazione diretta oltre 24 ore dopo l'infezione. Un ANOVA a misure ripetute è stata sufficiente per valutare le variazioni rispetto al basale all'interno di ciascun gruppo. Approcci statistici per l'analisi di una oscillazione circadiana di reporter luciferasi, insieme a passi di normalizzazione per correggere la deplezione di sottofondo siano pienamente discusso altrove 24. In entrambi i casi, la misurazione in tempo reale dell'attività reporter in mosche singoli è un metodo più efficiente per estrarre informazioni sulle sue dinamiche temporali che standard saggi biochimici ed immunoistochimici.

Tuttavia, uno svantaggio per monitorare l'attività della luciferasi reporter in vivo è che dipende mosche alimentari substrato luciferina. Anoressia è stata associata con infezioni in mosche, e l'alimentazione può variare con il tipo di infezione o tra i genotipi 25. Per aggirare preoccupazione per ingestione del substrato, mosche può essere divisa in parti separate del corpo o tessuti dopo l'infezione, e l'attività reporter può essere misurata in coltura come descritto in precedenza 26. In alternativa, i risultati del saggio luciferasi può essere verificata utilizzando un saggio standard che non contare sull'alimentazione. Per esempio, la PCR quantitativa è un approccio comunemente usato per misurare i livelli di espressione di peptidi antimicrobici (AMP) mRNA. Amplificatori sono bersagli noti di NFκB, e quindi indicare il livello di attività.

Il rappresentante datun descritto qui ricapitolare lavoro precedente dimostrando che NFκB aumenta con sfida immunitario e un conseguente aumento nel sonno 2. Tuttavia, si avvisano i lettori che il sonno nel sistema DAM Trikinetics è indicato da inattività per un minimo di cinque minuti consecutivi 27. Misurazione del sonno in volo da videografia si basa anche su inattività 28. Questa definizione sonno in linea possono potenzialmente essere problematico durante un'infezione, perché è anche noto che gli animali immunitarie sfidato diventa inattivo per lunghi periodi senza pelo 29. Per ovviare a questo problema, saggi che misura la reattività sensoriale sono necessari per verificare che le mosche sono davvero addormentato. Investigatori hanno determinato reattività di mosche a stimoli sensoriali, come un rubinetto matita 30, brushing i tubi di attività con un bastone di legno 31, o riscaldamento un'estremità di un tubo 27. In tutti i casi, le mosche letto sono meno sensibili (misuratasia per latenza di risposta o da cento vola rispondendo come gruppo) rispetto mosche svegli. Abbiamo scoperto che le mosche infette che dormono sono infatti meno sensibili agli stimoli sensoriali fino a 6-8 ore dopo l'infezione (Th. Kuo e JA Williams, osservazione non pubblicata). Nonostante i limiti tecnici, il sistema DAM Trikinetics fornisce un vantaggio elevato flusso di dati che saranno utili per futuri studi in mosche che esplorano un collegamento genetico e molecolare tra il sonno e la funzione immunitaria.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation in concessione # IOS-1025627 e dal National Institutes of Health in concessione # 1R21NS078582-01 a JAW

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubators Percival Scientific, Inc. I30BLLC8
I36VLC8
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate.
Drosophila Activitiy Monitors Trikinetics Inc., Waltham, MA DAM2 As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories.
Pyrex Glass Tubes Trikinetics Inc., Waltham, MA PGT-5x65
Microplate scintillation and luminescence counter Perkin Elmer TopCount NXT
12 detector
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates.
FluorChem 8900 Alpha Innotech Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient.
Micropipette Puller Tritech Research, Inc. Narishige PC-10
Supplies
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instrument Inc. 1B100F-4
3 ml Syringe Fisher Scientific BD 305482
Syringe Needles Fisher Scientific BD 305196 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing.
Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") VWR 60985-706 Used for attaching glass capillary needles to a syringe
3 Way Stopcock American Pharmaseal Company K75
Kontes Pellet Pestle Cordless Motor Fisher Scientific K749540-0000
Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749521-1590
Glass balls 3mm VWR 26396-630
Microplate Microlite 1+ Thermo Scientific 7571 Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque.
TopSeal-A:96-well Microplates PerkinElmer 6005185 Microplate Press-On Adhesive Sealing Film
D-Luciferin, Potassium Salt Gold BioTechnology, Inc. LUCNA
Software
Insomniac2 Available upon request to the authors custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11
Drosonex Available upon request to the authors custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system
Photoshop CS3 Adobe Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional)

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References

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