에 보이는 빛과 젠타 마이신의 상승 효과

Immunology and Infection

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Summary

우리는 연속 또는 펄스 가시 레이저 기반의 치료를 포함하는 개발 생물 의학 장치가 항생제 치료 (젠타 마이신)의 생존의 감소로 이어지는 통계적으로 유의 한 상승 효과의 결과와 결합되는 것을 보여

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Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Polak, P., Zalevsky, Z. The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms. J. Vis. Exp. (77), e4370, doi:10.3791/4370 (2013).

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Abstract

최근 가시 광선, 그들 중 대부분은 다양한 병원균에게 1-5 살해에 대한 책임 스펙트럼의 파란색 부분 (400 NM-500 nm의) 주장의 살균 효과에 대한 몇 가지 출판물이 있었다. 푸른 빛의 광독성 효과는 빛에 의한 활성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 주로 파란색 영역 4,6,7 빛을 흡수 내생 세균 감광제에 의해 형성의 결과로 제안했다. 빨간색과 가까운 적외선 8뿐만 아니라 녹색 빛 9 살 생물 효과의보고도 있습니다.

본 연구에서는, 우리는 우리가 녹농균에 높은 전원 녹색 (532 ㎚의 파장) 연속 (CW) 및 펄스 Q-스위치 (QS) 빛의 효과를 특성화 할 수있는 방법을 개발했다. 이 방법을 사용하여 우리는 또한 박테리아 생존에 항생제 치료 (젠타 마이신)와 함께 녹색 빛의 효과를 연구 하였다. P. 녹농균은 교류입니다ommon noscomial 기회 병원균은 각종 질병을 일으키는 원인. 변형은 여러 항생제에 매우 저항하고 많은 예측 AcrB / 멕시코 형 RND 유출 시스템에게 10 약제를 포함합니다.

무료 생활 고정상 그람 음성 세균 (P. aeruginosa의 긴장 PAO1), 루리아 국물 (LB)로하고 항생제 마이신의 첨가없이 Q-스위치 및 / 또는 CW 레이저에 노출 된 배지에서 자란 활용하는 방법. 세포 생존은 서로 다른 시간 지점에서 측정 하였다. 얻어진 결과는 혼자 레이저 치료는 P.의 가능한 개수가 0.5 로그 감소 결과 치료 제어 및 혼자 젠타 마이신 치료에 비해 세포 생존 능력을 감소하지 않은 것으로 나타났다 녹농균. 통합 레이저와 젠타 마이신 치료는, 그러나, P.의 시너지 효과와 생존 결과 녹농균은 8 로그의 감소했다.

제안 된 방법은 상기 구현도 할 수 있습니다동시에 빛의 영역을 조명하면서 감염된 기관에 항생제 용액을 주입 할 수있는 장치 같은 카테터의 개발을 통해 mented.

Protocol

1. 세균성 문화

  1. 그람 음성 P. 녹농균이라는 박테리아 스트레인 PAO1은 18 시간 동안 37 ° C에서 루리아 국물 (LB)에서 성장 하였다.
  2. 세포의 배양 후 5 분 7,500 RPM (분당 회전)에서 원심 분리하고 상층 액을 제거 하였다.
  3. 박테리아는 10 %의 LB에 재현 탁과 문화가 정지 위상을 다시 입력 할 수 있도록 또 다른 2 시간 동안 다시 성장했다.
  4. 세균 현탁액은 다음 두 그룹으로 분할되었다 : 첫 번째 그룹 (2 관)에서 어떤 항생제는 두 번째 그룹에 우리는 젠타 마이신 항생제 (50 ㎍ / ㎖)을 첨가 첨가되지 않았습니다.

2. 콜로니 형성 단위의 결정 (CFU)

  1. 세포 생존을 결정하기 위해 20 μL 샘플은 24 시간의 시간 프레임 내에마다 약 2 시간의 실험에서 촬영했다. 샘플의 시리얼 희석 만든 도금 LB 한천 플레이트에 37 ° C.에서 하룻밤 배양 하였다
  2. 각 치료, 플랫폼 당 CFUs전자가 결정되었고, 비교 기간 및 다양한 치료 사이에 만들어졌다. 식에 설명 된대로 CFU에서 로그 감소를 계산 하였다. (1)
    로그인 감소 = LOGU-LogC [CFU / ㎖]
    여기서 U는 각 시점에서 단위 값을 형성 식민지, CFU는 집락 형성 단위입니다 반면에 CFU / ㎖ 동등의 단위 :
    CFU / ㎖ = (식민지 X 희석 인자의 수) / (볼륨 접종)
    그리고 C는 시작 시간에 컨트롤 샘플에서 발견 CFU입니다. U는 측정 순간에 요소를 형성 식민지를 지정합니다.
  3. 그들의 각 하나의 박테리아의 농도는 10의 비율로 감소하는 동안 희석 요인 희석의 수입니다. 접종 볼륨은 항상 200 마이크로 리터이고 그것이 우리의 테스트 튜브의 크기와 관련이있다.

따라서보기의 농도 포인트를 요약, 젠타 마이신 항생제는 50 ㎍ / ㎖의 농도로했다. 이 끝날 때까지, 박테리아에 대하여과정은 우리가 전체 8 희석을했다. 각 희석 10 배이었고, 그것은 200 μL 튜브에 이루어졌다. 시작점은 200 μL 튜브에 첨가 시료 20 μL이었다 (따라서 초기 농도는 20/200C 0이었다 C가 0 = 0.1C0 시료 20 μL의 초기 농도 임)와 최종 농도는 8로 감소되었다 8 희석에 의한 크기의 순서.

3. 조명

  1. CW 다코타 : YAG 레이저 (532 nm의 200 mW의 평균 광 전력의 파장) 광학 75 % / 50 % 빔 스플리터를 사용하여 두 개의 광 경로로 분할되었다. 빔 직경 10 mm로 하였다. 노출 시간은 24 시간이었다.
  2. Q-스위치 펄스 노스 다코타 : YAG 레이저 (532 nm의 파장, 300 mW의 2.5 MW의 광 피크 전력의 평균 전력)는 광학 75 % / 50 % 빔 스플리터를 사용하여 두 개의 경로로 분할되었다. 스폿 직경은 6mm이다. Q-스위치 레이저의 펄스 폭은 6 NSEC이고 반복 속도는 15Hz의했다.평균 전력 밀도는 106 mW의 / cm 2이고 최대 전력 밀도는 8.83 kW 급 / mm 2이다. 노출 시간은 24 시간이었다.

세균 현탁액은 조사 기간 동안 교반은 박테리아의 성장 (모든 튜브 루리아 국물 매체는 박테리아가 성장할 수 있도록 있었다)에 적합한 배양 조건에서 보관 된 것을 참고.

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Representative Results

레이저 기반의 설정은 개략적으로 그림 1에 제시되어있다. 첫 번째 실험 조건은 CW 다코타를 활용 : 200 mW의 평균 광 전력 : YAG 레이저는 532 ㎚의 파장 (YAG 다코타의 두 번째 고조파)을 갖는. 이 빔은 각 분할 빔 전력은 100mW 있다고 광 75 % / 50 % 빔 스플리터를 사용하여 두 개의 광 경로로 분할되었다. 빔 직경은 10mm 정도였습니다 따라서 전력 밀도는 약 100 mW의 / cm 2이었다. 노출 시간은 24 시간이었다. 조명 전원이 상대적으로 높은 있지만 그것은 샘플의 가열을 일으킬 정도로 높지 않다.

Q-스위치 펄스 노스 다코타을 활용 번째 실험 조건 : YAG 레이저는 532 nm의 (고조파 초)와 6 ㎜의 스폿 직경의 파장을 갖는. 평균 전력은 300 mW의 2.5 MW의 광 피크 전력이었다. Q-스위치 레이저의 펄스 폭은 6 NSEC이고 반복 속도는 15Hz의했다. 이 빔은 광학을 사용하여 두 경로로 분할되었다75 % / 50 % 빔 스플리터. 평균 전력 밀도는 약 100 mW의 / cm 2, 최대 전력 밀도는 8.83 kW 급 / mm 2이었습니다. 이 최대 전력 밀도는 88.3 각 펄스가 시간 영역에서 긴 10 NSEC되면서 펄스 당 μJ / mm 2의 실력 에너지에 해당합니다. 노출 시간은 24 시간이었다. 두 실험은 대조군으로 노 빛의 노출 (즉, AND로 마이신 제외)와 유사한 성장 조건 하에서 수행 하였다.

그림에서 2 (a)와 2 (b)는 효과는 P.에 항생제와하지 않고 각각 CW 레이저 빛과 Q-스위치 레이저로 시료의 조명에 의한 취득 녹농균이 제공됩니다.

(제어 즉) 빛에 노출되지 않은 샘플 또는 젠타 마이신 치료하지 않고 세포의 생존에는 전혀 영향이 없습니다. 이 결과는 박테리아가 흉내, 젠타 마이신 치료에 저항하는 것이 좋습니다상황이 종종 병원에서 발생했습니다.

혼자 레이저 빛은 하나 모든 살해를 유도하지 않았다. 그러나 레이저 빛과 젠타 마이신의 조합은 진도의 여러 명령에 의해 박테리아의 생존 능력을 감소. 가장 눈에 띄는 효과는 CW 또는 Q-스위치 레이저 중 하나의 조합이 대조군 (항생제 단독으로 또는 가벼운 형)에서 얻은 측정 값에 비해 크기가 8 명령으로 가능성을 감소하는 24 시간 후에 측정 하였다.

이 항생제에 저항력이있는 박테리아의이 유형에 대한 치료의 솔루션을 제안 할 수있는 중요한 결과이다. 제안 된 치료 카테터 및 병원에서 사용되는 다른 장치에 통합 될 수 있기 때문에 몇 시간이 박테리아의 효과적인 살해를 얻기 위해 필요하다는 사실이 방법의 임상 잠재력을 감소하지 않습니다. 그림 3의 예를 들어 우리는 디자인 카테터의 예를 제시하는 ADDI의동시에 감염된 기관에 적절한 조명을 확산 할 수 있도록 구멍의 복수가 액체 주입 채널 TION.

통계에 사용되는 샘플의 수는 6 살 (가 실수로 오염 된 튜브의 일부 중 하나 또는 두 가지 경우였다 그리고 그들은 통계에서 찍은). P 값은 0.05 이하이다.

우리는 항생제의 서로 다른 농도에 대한 우리의 실험을 반복하지 않았다고합니다. 우리의 실험 모두에서 농도가 매우 높았다. 그 이유는 좋은 박테리아가 여전히 조명없이 항생제 영향을받지 않았다과 조명으로 파괴 된 높은 농도의 경우, 그것은 분명 낮은 농도에 대한 것이기 때문에 우리의 접근의 힘을 보여이었다.

조명 파장 선택을위한 이론적 근거 중 하나는 파장을 선택했다하는 bacteri그리고 항생제가 투명입니다. 이 그림 4에 나와 있습니다. 532 nm의 파장의 레이저를 사용하기위한 추가 동기는 우리의 실험실에있는 그것의 가용성 때문에 그것은 높은 조명 전력 (스펙트럼 필터를 정기적으로 백색 광원에 비해)뿐만 아니라에 대한 조정 기능을 얻기 위하여 저희도 허용한다는 사실 때문이 전력 및 조명의 시간적 행동.

그림 1
그림 1. . 박테리아 조명 설치 레이저 CW 다코타 중 하나를했다 : YAG 레이저, Q-스위치 노스 다코타 펄스 : YAG 레이저. 왼쪽에 하나의 동일한 조건에서 둘을 조명하기 위해, 레이저가 두 개의 튜브, 항생제와 하나와 하나없이 분할 된 실험 장치의 이미지를 볼 수 있습니다. 두 튜브의 위치입니다 교반기 ED. 실험 장치의 개략도 스케치 그림의 오른쪽 부분을 볼 수 있습니다.

그림 2
그림 2. (). P.에 CW 레이저와 젠타 마이신의 효과 녹농균. 샘플은 CW 레이저 광 (전력은 100mW)와 함께하고 젠타 마이신 (50 ㎍ / ㎖)이없는 조명 하였다. 3 실험의 평균이 표시됩니다. (B). 녹농균에 Q-스위치 레이저와 젠타 마이신의 효과. 샘플은 P.에 함께하고 젠타 마이신 (50 ㎍ / ㎖)이없는 Q-스위치 레이저 광 (1.65 MW)으로 조명했다 녹농균의 가능성. 3 실험의 평균이 표시됩니다.

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그림 3. P.에 대한 생물 치료를 위해 제안 된 카테터 기반 장치 녹농균. 그림에서 점은 빛이 처리 된 조직으로 확산 될 일으키는 빛의 산란 점을 나타냅니다.

그림 4
그림 4 532 ㎚의 파장 정도 흡수 스펙트럼 (AU에서). (). 박테리아, (B). 젠타 마이신은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

광선 치료 여러 질환에 대한 유망한 접근 방식으로 부상하고 최근 몇 년 동안 첨단 전문 분야의 연구 분야이다. 이러한 맥락에서 가시 범위에서 빛의 사용은 광범위하게 연구되어왔다. 예를 들어, 감염된 상처 소독을 위해 강렬한 가시 광선에 노출하여보다 효과적으로 치유 할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 방법에 대한 작용 기전은 세균에게 11를 죽일 빛 유도 산소 라디칼의 유도 (ROS)를 통해이 입증되었다.

6 이전 연구는 빨간색과 가까운 적외선 빛에 의해 유도 된보다 푸른 빛으로 조명 박테리아 ROS 훨씬 높은 금액을 증명하고있다. 문학에있는 대부분의 증거가 푸른 빛의 살균 효과에 집중하는 이유는 설명합니다.

내성 박테리아를 싸우는 레이저 빛의 사용에 대한 또 다른 최근의 예 Kresp에 의해 증명되었다나는 등. 12. 그 연구 레이저에서 발생하는 충격파 기술은 바이오 필름을 근절하기 위해 이용되었다. YAG 레이저 얇은 섬유, 충격파 효과를 생산 플라즈마 형성을 생성 특수 프로브 : 소형 Q-스위치 노스 다코타를 사용하여. 저자는이 방법을 효과적으로 P.을 방해 할 수 것을 보여 주었다 체외에서 녹농균 바이오 필름.

우리는 레이저 빛을 사용하여 비 감작 항균제의 효과를 높이기 위해 시도로 우리는이 연구에서 제시 한 방법은 다소 차이가 13 살. 우리의 결과는 조명 항생제 치료를 결합하여, 항균 활성이 크게 증가 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

사실, 혼자 항생제에서 관찰 완전 내성 표현형에서 박테리아가 항생제 빛 치료의 존재에 민감했다. 이 효과의 작용 기전은 명확하지 않고 더 investigat가 필요합니다이온. 그러나, 우리는 ROS가 치료 기간 동안 생성 여부를 조사하기 위해 수행 한 전자 - 상자성 공명 (EPR) 측정에 다른 처리간에 유의 한 차이는 13 얻을 수 없었다. 이러한 결과는 결합 치료의 효과가 ROS 생산을 포함하지 않는 다른 메커니즘으로 간주해야하는 것이 좋습니다. 그것은 빛 치료 막 투과성을 변경하고 결국 항생제의 살해를 산출 박테리아 세포에 침투 할 수 있다는 가설을 할 수 있습니다.

조작의 메커니즘이 완전히 탐구되지 않지만, 우리의 접근 방식이 조합을 적용하여 현재 병원에서 효과적으로 재사용 할 수있는 반면 항생제 내성으로 인해 삭제되었을 수 있습니다 상용 항생제 빛의 결합 치료의 가능성을 강조 표시합니다.

분명히 같은 원고에 언급, 몇 시간의 조명은 실내를 위해 필요합니다 항생제의 효능을 향상시켰다. 이 실제로 제안 된 방법의 단점입니다. 이러한 조명의 실현은 카테터 내부의 조명 소스 (그림 3에 의해 제안 된)를 설치 예를 얻을 수 있습니다. 상처가 외부에있는 경우뿐만 아니라, 조명 소스와 석고로 밴딩 특수는 상처의 상단에 넣어 수 있으며, 환자가 밤에 자고있는 동안 예를 들어 몇 시간 동안 그것을 조명. 감염이 내부 일부 기관에 대해, 몇 시간 동안 환자가 입​​원하고 그가 / 그녀가 주입 가방에 연결되어있는 경우 이러한 내시경이나 특수 섬유로 조명 채널은 기관에 접근하고 지속적으로 (로 조명 될 수있다 환자가 (주입 부대는 많은 시간 동안 환자에 연결되어 정확히) 입원하는 동안) 항생제 치료를 적용했다. 우리는 완전히 접근 방식은 일반적으로 감염 장기의 치료에 좋지 않다는 것을 동의합니다.

NT는 "이 논문에서 우리는 빠르고 실용적인 응용 프로그램에 대해 제안 된 기법의 장점을 보여 것을하지만 다른 연구와 같은 생체 내 실험에서와 같이 필요한 달성하기 위해합니다.> 참고 섬유 아세포 나 상피 세포에 독성 연구뿐만 아니라 도움이 될 것입니다 박테리아 세포에서 제안 된 치료의 메커니즘을 설명 할 것이다 연구가 필요하므로. 본 논문에서 또한 우리는 항생제에보다 투과 한 세균 막 빛에 의한 변화가. 분명히 상황이 다른 것이라고 가설이 . 세균 감염이 생물막로 인한 임상 적 설정은 다음 두 가지 문제가 있습니다. 생물막 세균이 제한됩니다 생물막 질량 항균제 자신의 플랑크톤 대응 및 침투에 비해 저항력이 될 것입니다 따라서, 빛과 젠타 마이신의 효과를 탐구 녹농균 바이오 필름 ​​모델은 우리의 미래 연구의 목적이다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lauria Broth Difco 241420
Gentamycin Sigma G1914
Bacto Agar Difco 231710

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References

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