可见光和庆大霉素的协同作用

Immunology and Infection

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Summary

我们表明,涉及连续的或脉冲可见激光为基础的治疗发达的生物医学装置结合使用抗生素治疗(庆大霉素),结果在统计上显着的协同效应导致的生存能力的降低

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Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Polak, P., Zalevsky, Z. The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms. J. Vis. Exp. (77), e4370, doi:10.3791/4370 (2013).

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Abstract

最近有一些出版物对可见光的杀菌效果,他们大多声称,蓝色部分光谱(400纳米- 500纳米)负责杀死各种病原体1-5。建议蓝色光的光毒效应是光诱导的活性氧(ROS)的形成内源性细菌大多光敏剂吸收光线中的蓝色区域4,6,7的结果。也有红色和近红外以及绿灯9灭菌效果的报告。

在本研究中,我们开发了一种方法,使我们能够表征高功率绿色(波长为532 nm)连续(CW)和脉冲Q开关(QS)光对铜绿假单胞菌的效果。使用这种方法,我们也研究了绿灯上的细菌生存能力结合使用抗生素治疗(庆大霉素)。P.绿脓杆菌是交流OMMON noscomial条件致病菌引起的各种疾病。该菌株是相当耐各种抗生素,并包含了许多预测ACRB / MEX型RND多药外排系统10。

该方法利用固定相的自由生活的革兰阴性菌( 铜绿假单胞菌 PAO1株),生长在Luria肉汤(LB)培养基中有和没有添加抗生素庆大霉素暴露于Q-开关和/或连续波激光器。在不同时间点测定细胞存活率。所得到的结果表明,单纯激光治疗并没有降低细胞的存活率与未处理的对照和只导致P.中的活菌数为0.5的对数减少,庆大霉素治疗绿脓杆菌 。将合并的激光和庆大霉素处理,然而,导致了协同效应和P.的可行性减少了8日志的绿脓杆菌

该方法可以进一步实施通过导管像设备能够注入到被感染器官的抗生素溶液同时照射光区的发展来实现。

Protocol

1。细菌培养

  1. 革兰氏阴性的P。铜绿假单胞菌菌株PAO1菌株在37℃下在Luria肉汤(LB)中生长18小时。
  2. 的细胞培养物,然后在7500转(发每分钟)离心分离5分钟,除去上清液。
  3. 将细菌重新悬浮于10%LB,并重新生长另外2小时,,允许文化重新输入固定相。
  4. 的细菌悬浮液,然后分成两组:第一组中的(2管)中加入无抗生素,在第二组中,我们添加了抗生素庆大霉素(50微克/毫升)。

2。测定菌落形成单位(CFU)

  1. 要确定细胞活力20微升样品从实验中,大约每2个小时,24个小时的时间框架内。对样品进行连续稀释,接种LB琼脂平板上,并在37℃下温育过夜。
  2. 对于每个治疗,每个平台的CFUsE是确定之间的时间周期和各种治疗方法进行了比较。式中所描述的计算中菌落形成单位的对数减少。 (1):
    日志减少= LogU LOGC [CFU /毫升]
    其中U是菌落形成单位值,在每个时间点; CFU为菌落形成单位,而单位CFU /毫升等于:
    CFU /毫升=(菌落×稀释因子数)/(接种量)
    和C是在开始时的对照样品中发现的CFU。请注意,美指定菌落形成因子测量瞬间。
  3. 而在他们每个人的细菌的浓度降低了10倍,稀释倍数的稀释度是多少。接种量总是200微升,它关系到我们的测试管的大小。

因此,要总结的浓度的角度来看,是在浓度为50微克/毫升庆大霉素抗生素。关于细菌,直到结束整体的过程中,我们有8稀释。每一种稀释了10倍,它是在为200μl的管子。出发点是20微升的样品加入到200微升管(因此,初始浓度为0 20/200C = 0.1C0与C 0是在20μl的样品的初始浓度)的终浓度降低8订单的数量级,由于8稀释。

3。照明

  1. 连续波Nd:YAG激光(波长为532 nm和平均光功率为200 mW)被分成两个光路,使用光的50%/ 50%的分束器。的光束直径约为10毫米。曝光时间为24小时。
  2. Q-开关脉冲Nd:YAG激光(波长532nm,平均功率为300 mW和光峰值功率为2.5兆瓦)也被使用光的50%/ 50%的分束器分成两路。光斑直径为6毫米。的Q开关激光的脉冲宽度为6毫微秒,重复频率为15Hz的。该平均功率密度为106毫瓦/厘米2,并在峰值功率密度为8.83千瓦/毫米2。曝光时间为24小时。

请注意,在辐照过程中细菌的悬浮液搅拌和保持在适当的培养条件下细菌生长(在所有的管子的Luria肉汤培养基,使细菌的生长)。

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Representative Results

的激光为基础的设置在图1中示意性地呈现。第一实验条件下利用连续波Nd:YAG激光具有波长532nm(第二高次谐波的Nd:YAG)和平均光功率为200 mW。此光束被分成两个光路采用光学50%/ 50%,分光镜等分裂波束,每个功率为100 mW。的光束直径约为10毫米,因此,功率密度为约100毫瓦/厘米2。曝光时间为24小时。虽然照明电源是比较高的,它没有高到足以引起加热样品。

第二实验条件下利用Q-开关脉冲的Nd:YAG激光的波长为532nm(二次谐波)和光点直径为6毫米。平均功耗为300 mW和光峰值功率为2.5兆瓦。的Q开关激光的脉冲宽度为6毫微秒,重复频率为15Hz的。该光束也被分成两路,利用光学50%/ 70%的分束器。的平均功率密度为约100毫瓦/厘米2的峰值功率密度为8.83千瓦/毫米2。这种峰值功率密度相当于能源流利88.3μJ/毫米2个脉冲,每个脉冲在时域长为10纳秒。曝光时间为24小时。两个实验进行了类似的增长条件下,没有光照射( 无庆大霉素)作为对照。

图2(a)和图2(b)获得的效果,由于照明CW激光的Q开关激光的样品分别与不含抗生素的第铜绿假单胞菌

在样品中,没有暴露在光线下( 控制)有没有降低细胞活力带或不带庆大霉素治疗。这一结果表明,细菌耐庆大霉素处理,模仿在门诊中经常遇到的情况。

单独的激光灯也没有引起任何杀害。然而,结合激光和庆大霉素的细菌存活率降低几个数量级。最突出的效果,测定24小时后,顺时针或Q开关激光的组合相比,对照组(抗生素单独使用或单独的光)的测量中得到的由8个数量级降低的可行性。

这是一个重要的结果可能会建议这种类型的抗药性细菌的溶液处理。不减少的事实,则需要几个小时,以获得有效地杀死细菌所建议的治疗,因为这种方法可以被纳入在医院中使用的导管和其他设备的临床潜力。例如,在图3中,我们提出了一种设计的导管的例子中,除了tion到液体喷射通道,有多个孔,允许同时扩散到受感染的器官的适当的照明。

进行了统计所用的样本的数目是6(有1个或2个例的一些无意中污染的管,然后将其取出的统计)。 P 低于0.05。

请注意,我们没有重复我们的实验中,不同浓度的抗生素。在我们的实验中的浓度非常高。其中的原因是,如果中浓度最高的细菌仍然没有抗生素无光照的影响和被毁坏与照明,它显然会发生低浓度的实力,以更好地展示我们的方法。

照明波长的选择理由之一是选择一个波长细菌学和抗生素是透明的。在图4中说明了这一点。使用532纳米波长的激光的其他动机是由于其可用的,在我们的实验室,由于这样的事实,它允许我们也取得较高的照明功率(相对于正规的白色光源的光谱过滤器),以及为调谐能力功率和时间行为的照明。

图1
图1。细菌照明设置的激光不是连续Nd:YAG激光,Q开关脉冲Nd:YAG激光。在左边的一个可能的实验装置中,激光被分成两管之间,用抗生素和一个没有它,可以查看该图像,以照亮他们都在相同的条件。两个管位置上一个搅拌器。看出,在图中的右侧部分的实验装置的示意性草图。

图2
图2(a)的 CW激光和庆大霉素P.绿脓杆菌 。样品照明的CW激光器光(功率为100 mW)与无庆大霉素(50微克/毫升)。的3个实验的平均值(b)所示 。 Q开关激光和庆大霉素绿脓杆菌 。样品照射Q开关激光(1.65兆瓦),庆大霉素(50微克/毫升)和P.假单胞菌的生存能力。 3个实验的平均值。

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图3。建议导管为基础的生物医学治疗设备,对体育铜绿假单胞菌图中的点表示使光扩散到被治疗的组织中的光散射点。

图4
图4(盟)的吸收光谱波长为532 nm的周围:(a)所示。细菌,(b)所示 。庆大霉素点击这里查看大图

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Discussion

光疗一直是近年来新兴的一种很有前途的方法用于治疗许多疾病在先进的多学科研究领域。在可见光范围内的光在此上下文中的使用已被广泛研究。例如,它已经发现,伤口感染是可以治愈的,更有效地让他们接触到强烈的可见光杀菌的目的。这种方法的作用机制被证明是通过感应光诱导的氧自由基(ROS),杀灭细菌11。

以往的研究已经证明亮起蓝色的光比红色和近红外光诱导的ROS在细菌量高得多。这就解释了为什么大部分文献中的证据集中在蓝灯的杀菌效果。

另一个最近的例子使用激光对抗耐药细菌由Kresp证明我12。在这项研究中激光产生的冲击波技术是用来消除生物膜。通过使用微型Q开关Nd:YAG激光和细纤维,特殊的探头产生的等离子体的形成产生冲击波的影响。作者表明,该方法能够有效地破坏P.绿脓杆菌生物膜体外

在这项研究中提出的方法,我们是有点不同的13,当我们试图以增加疗效非光敏剂的抗菌剂使用激光。我们的结果表明,通过带照明的抗生素治疗相结合,可以显着提高抗菌活性。

事实上,从一个完全的抗性表型,仅观察到抗生素成为细菌敏感抗生素和光照处理的存在下。这种效应的作用机制尚不清楚,将需要进一步investigat根离子。然而,在电子顺磁共振(EPR),我们已经完成的测量,以检查是否ROS在治疗过程中产生的,不同处理之间没有显着差异获得13。这些结果表明,联合治疗的效果不涉及活性氧的产生,必须考虑到不同的机制。可以推测光治疗,改变细胞膜的通透性,并最终使抗生素渗透入细菌细胞得到其杀害。

虽然还没有充分探讨的操作的机制,我们的方法突出显示的光具有商业抗生素的联合治疗可能已被丢弃,由于抗菌素耐药性的,而通过施加这样的组合现在可以被有效地再利用在诊所的电位。

显然,在稿件中指出,需要几个小时的照明,以便连接 HANCE抗生素的功效。这的确是一个缺点,所提出的方法。实现这种照明方式获得, 例如通过安装在导管内的照明源( 图3中所提出的)。除此之外,如果伤口外部特殊的条纹作为照明光源的石膏可以放在伤口上,照亮了好几个小时, 例如病人晚上睡觉时。如果感染是内部的,住院治疗的病人,他/她被连接到输液袋好几个小时,对一些器官的内窥镜或一个特殊的纤维,如照明通道可以接近的器官,并不断地照亮(附带应用抗生素治疗),而病人住院(完全是多个小时的输液袋连接到患者)。我们完全同意,该方法治疗一般感染的器官都不好。

核苷酸“>请注意,在这个手稿,我们表明所提出的方法的优点是快速和实际应用,但为了实现这个其他的研究是必要的,如在体内实验。成纤维细胞或上皮细胞的毒性研究将是有用的,以及将展示在细菌细胞中的建议的治疗机制的研究是必需的。此外,在本文中,我们推测,更可渗透的抗菌素的细菌膜,使光致变化,很明显的事情会在不同临床上细菌感染是由于生物膜。然后有两个主要问题:生物膜细菌相比更耐浮​​游同行和抗菌剂渗透生物膜中的质量将受到限制,因此,探索光与庆大霉素的影响一个的绿脓杆菌生物膜模型是我们未来研究的目的。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lauria Broth Difco 241420
Gentamycin Sigma G1914
Bacto Agar Difco 231710

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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