La perfusión intravascular de Carbono Negro Tinta fiable permite la visualización de los vasos cerebrales

Neuroscience

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Summary

Análisis de la anatomía cerebrovascular roedor juega un papel importante en la investigación de accidente cerebrovascular experimental. En este contexto, la perfusión intravascular con látex de color ha sido considerado como una herramienta estándar para varios años. Sin embargo, esta técnica implica distintas limitaciones técnicas, que socavan su reproducibilidad. Aquí se describe un método simple para visualizar los vasos cerebrales de una manera reproducible. La inyección de una mezcla de dos tintas negras de carbono comercialmente disponibles a través de los resultados de miocardio en el ventrículo izquierdo llenado adecuado de los vasos cerebrales, con visualización de alto contraste. Hemos aplicado con éxito esta técnica para identificar los puntos de anastomosis entre territorios vasculares cerebrales de ratones con diferentes antecedentes genéticos. Finalmente dan evidencia de que este método novedoso y sencillo para la tinción recipiente se pueden combinar con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) Tinción - una herramienta ampliamente utilizada para observar y analizar los volúmenes de infarto en ratones.

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Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels. J. Vis. Exp. (71), e4374, doi:10.3791/4374 (2013).

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Abstract

La estructura anatómica de los vasos cerebrales es un factor determinante para la hemodinámica cerebral, así como la gravedad de la lesión después de lesiones isquémicas. La vasculatura cerebral dinámicamente responde a varios estados fisiopatológicos y presenta considerables diferencias entre cepas y bajo condiciones de manipulaciones genéticas. Esencialmente, una técnica fiable para la tinción de vasos intracraneales es esencial con el fin de estudiar la patogénesis de la apoplejía isquémica. Hasta hace poco, un conjunto de diferentes técnicas se ha empleado para visualizar la vasculatura cerebral incluyendo la inyección de resina de baja viscosidad, araldite F, gelatina mezclada con diversos colorantes 1 (es decir, rojo carmín, India tinta) o látex con 2 o 3 sin negro de carbón. La perfusión de blanco compuesto de látex a través de la aorta ascendente se ha reportado por primera Coyle y Jokelainen 3. Maeda et al. 2 han modificado el protocolo mediante la adición de carbon negro de tinta para el compuesto de látex para la visualización mejorada de contraste de los vasos después de la perfusión de solución salina del cerebro. Sin embargo, la perfusión ineficiente y llenado inadecuado de los recipientes se experimentan con frecuencia debido a la alta viscosidad del compuesto de látex 4. Por lo tanto, se ha descrito una técnica simple y rentable utilizando una mezcla de dos tintas de carbono comercialmente disponibles negros (CB1 y CB2) para visualizar la vasculatura cerebral de una manera reproducible 5. Hemos mostrado que la perfusión con CB1 CB2 + en ratones resulta en la tinción de los vasos cerebrales significativamente más pequeños en una densidad más alta en comparación con la perfusión de látex 5. A continuación, describimos nuestro protocolo para identificar los puntos de anastomosis entre la parte anterior (ACA) y las arterias cerebrales medias (MCA) para el estudio de las variaciones de los vasos en ratones con diferentes antecedentes genéticos. Por último, demostrar la viabilidad de nuestra técnica en un modelo transitorio de isquemia cerebral focal en ratones mediante la combinación de CB1 +CB2 mediada recipiente de tinción con tinción con TTC en diversos grados de lesiones isquémicas.

Protocol

1. Animales

  1. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por las autoridades locales. Para todos los experimentos, C57BL6 / J ratones de tipo salvaje, ApolipoproteinE - / - (ApoE KO) y ratones SV129 (12-16 semanas de edad, 26-30 g de peso corporal, 5-6 animales por grupo experimental) fueron utilizados.

2. La tinción de los vasos cerebrales con látex de color

  1. Preparar una mezcla de 25 l tinta de carbón negro (Herlitz, Alemania) con 0,5 ml de compuesto de látex (Pébéo, Francia) en una proporción 1:20 en un tubo de PE y calentar la mezcla a 37 ° C en un baño de agua. Recoger la mezcla en una jeringa de 2 ml con una aguja de 28-30G antes de anestesiar al animal.
  2. Disolver 50 mg de polvo de hidrocloruro de papaverina en 1 ml de solución salina normal estéril. Recoger la solución en una jeringa de insulina. Rompa la aguja de otra jeringa de insulina estéril. Colocar esta aguja en el extremo de un c 20m de largo PE10 tubo. Ahora fije este tubo PE10 en la aguja de la jeringa de insulina que contiene solución de hidrocloruro de papaverina para ser inyectado a través de la vena femoral para asegurar la vasodilatación y el llenado adecuado de los vasos.
  3. Preparar otros dos jeringas de insulina que contienen cada uno 1 ml de solución salina. Las jeringas de insulina permitir la entrega suave del fluido inyectado en una ubicación precisa. Sin embargo, debido a la alta viscosidad del látex, alternativa jeringas de 1 ml con agujas extraíbles más amplios deben ser utilizados.
  4. Tome todas las jeringas esterilizadas y los instrumentos de disección cercanas a la etapa de operación. Extender una hoja draper quirúrgico alrededor de la etapa de operación. La etapa de operación debe estar suficientemente iluminada y un microscopio de operación puede ser utilizado si es necesario.
  5. Ahora se mide el peso corporal de un ratón C57BL6 / J y luego inducir la anestesia con isoflurano 5% vaporizado en 70% de N 2 O y 30% O 2. Continuar la anestesia con isoflurano 1% de vaporizado. Después POSICIONAM adecuadag del ratón sobre su espalda y la fijación de las extremidades, evaluar la profundidad de la anestesia. A continuación, cortar la piel sobre la vena femoral izquierda y localizar la vena. Insertar la punta afilada de la aguja que se coloca en PE10 tubo e inyecte lentamente solución de hidrocloruro de papaverina a una velocidad de 100 l por min (50 mg / kg de peso corporal).
  6. Después de la inyección, corte de la cavidad abdominal y el diafragma perforar el. Cortar las costillas para exponer el corazón sin dañar o hematomas ella. Clip de la aorta torácica descendente con un fórceps arteriales. Haga un corte brusco en el atrio derecho para permitir que la sangre venosa drene hacia fuera. Inyectar 2 ml de solución salina en el ventrículo izquierdo, seguido por la inyección del látex coloreado manualmente con una ligera presión sobre 18-20 seg. Use las jeringas precargadas uno tras otro. Evitar la inyección de burbujas.
  7. Después de la inyección de látex, dejar al animal durante 5 min. Decapita el animal y retire con cuidado todo el cerebro. Tome el buen cuidado de no dañar la arquitectura recipiente y cortex mientras se quita el hueso del cráneo y las meninges. Coloque el cerebro en un plato de cultivo celular de 60 mm que contiene 8.6 ml de 4% PFA para tomar una foto. Coloque una regla de medición en el plato transparente. Tomar fotos con un aumento de 25x de la dorsal y la superficie ventral del cerebro con una cámara conectada al microscopio. Las fotos se deben tomar en un ángulo de 90 ° entre la placa de Petri y el objetivo del microscopio con el fin de cuantificar la distancia original.
  8. Repita el procedimiento en el otro 4-5 animales.

3. La tinción de los vasos cerebrales con mezcla de tintas de Carbono Negro

  1. Para comparar los resultados de base de látex tinción vascular cerebral con nuestro protocolo, prepara una mezcla de 100 l de Herlitz Stempelfarbe tinta (CB1) con 900 l de Pelican Scribtol Schwarz tinta (CB2) en un tubo de 1,5 ml EP. Preparar dos tubos de PE para hacer un volumen total de 2 ml de mezcla de CB1 y CB2 en una relación 1:9. Recoger la mezcla en dos jeringas de insulina separadas (1ml cada uno). Tapar las jeringas y colocarlos en un baño de agua caliente a 37 ° C. Recoger 2 ml de solución salina en otros dos jeringas de insulina, y colocarlos en un baño de agua también.
  2. Se anestesia el animal y repetir el mismo procedimiento descrito anteriormente, excepto para la inyección de hidrocloruro de papaverina. Después de la inyección de 2 ml salaine en el ventrículo izquierdo, inyectar una mezcla de 2 ml de tintas de negro de carbono en lugar del látex de color. Realice las inyecciones a mano con una ligera presión sobre 18-20 segundos por ml. Clip de la aorta torácica descendente antes de las inyecciones.
  3. El sacrificio del animal, retire el cerebro y tomar fotos.
  4. Para conservación a largo plazo del cerebro, poner el cerebro en 4% de PFA durante la noche seguido por incubación con sacarosa con una concentración gradualmente creciente hasta que el cerebro flotante sumerge totalmente (5% seguido de 15% y luego% 30). Los cerebros de los animales perfundidos con el látex de color también puede ser conservada de la misma manera.
  5. Lleve a cabo elprocedimiento en otros animales de 4-5. Para comparar la diferencia en la anatomía cerebral vascular debido a diferentes antecedentes genéticos o cepas, repita el protocolo en igual número de ratones ApoE KO y SV129, respectivamente.
  6. Para estudiar la anatomía vascular en condiciones isquémicas, inducir transitorio de isquemia cerebral focal por 45 min o 90 min de acuerdo con un protocolo estándar de la oclusión intraluminal de la MCA bajo anestesia profunda (una descripción detallada de la cirugía está más allá del alcance de este artículo, la lector es referido a Doeppner et al., 2010). Al final del período de reperfusión planeado (1 día, o 5 días), lleve a cabo la tinción vascular con CB1 + CB2 únicas tintas y manchar todo el cerebro con 2% TTC solución a 37 ° C durante 5-10 minutos para identificar el volumen de infarto . TTC se reduce a formazán coloreado rojo por las enzimas mitocondriales (particularmente succinato deshidrogenasa). Después de la tinción TTC, las manchas de los tejidos metabólicamente activas de color rojo oscuro, mientras que el tejido infartado se mantiene unstained y parece blanco debido a la enzima mitocondrial disfuncional y desnaturalizado. Recoger imágenes de la misma manera como se describió anteriormente.

4. Estudio de los territorios vasculares cerebrales

  1. Para analizar la anatomía de los vasos cerebrales, las imágenes de la superficie dorsal del cerebro o bien teñidas con colores látex o CB1 CB2 + tintas pueden ser analizados con el software ImageJ (a Java basada en software de dominio público utilizado para el procesamiento de imágenes y análisis). Los cerebros perfundidos con látex de color puede mostrar grados variables de tinción recipiente situado en la superficie dorsal, mientras CB1 CB2 + perfusión se mancha todos los vasos en ambas superficies ventral y dorsal.
  2. Abra un archivo de imagen con el software ImageJ. Identificar todos los puntos de anastomosis entre la ACA y MCA. Un punto de la anastomosis se define como el lugar donde el diámetro de los vasos es el más restringido o la distancia media entre los puntos más próximos de ramificación de la ACA y las ramas de MCA, respectivamente 2.
  3. Establecer la escala en mm. Mida la distancia entre la línea anastomótica y la línea media a 4 mm caudal al polo frontal del cerebro utilizando la herramienta de dibujo de línea recta y una herramienta de "medida". Hacer lo mismo a 6 mm en sentido caudal desde el polo frontal. Analizar imágenes 3-4 por animal y calcular el valor medio. Compare los valores de los diferentes grupos de animales para identificar la variación de la anatomía vascular cerebral. En C57BL6 / J animales, la línea anastomótica entre la ACA y MCA se puede remontar más cerca de la línea media a 4 mm de menos 6 mm caudal del polo frontal. Ratones KO ApoE presentará ninguna diferencia significativa en este sentido. Por el contrario, en ratones SV129 la línea anastomótica se encuentran mm más allá y paralelamente a la línea tanto a 4 mm y 6 caudalmente desde el polo frontal.
  4. Para el análisis de la anatomía vascular in condiciones isquémicas, realizar los mismos cálculos antes mencionados. Identifique el borde del infarto como el margen de tejido de color rojo y negro que representa el tejido metabólicamente activo y el tejido necrótico sin teñir, respectivamente. Medir la distancia de la frontera infarto de la línea media a 4 mm y 6 mm caudal a partir del polo frontal del cerebro. Se recoge el valor medio de las imágenes 3-4 por animal. Comparar los resultados entre diferentes isquemia y reperfusión períodos.

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Representative Results

El protocolo descrito aquí supera las limitaciones técnicas de visualización convencional a base de látex de la vasculatura cerebral de roedor. Figura 1A muestra que la perfusión de la siguiente látex coloreado, sólo los vasos grandes en la superficie ventral están manchadas, dejando la superficie dorsal sin teñir. El resultado es también muy variable. Sólo un animal de cada seis muestra la tinción parcial de la ACA y MCA el visible en la superficie dorsal del cerebro (datos no mostrados). Por el contrario, CB1 CB2 + resultados de perfusión en el llenado suficiente de buques grandes y pequeños de una manera igual (fig. 1B). La tinción es estable hasta 7 días sin ningún cambio de calidad. Utilizando el programa ImageJ, hemos cuantificado la distancia de los puntos de anastomosis entre la ACA y MCA de la línea media en forma natural C57BL6 / J ratones (Figura 1 C). Se compararon estos valores con ApoE ratones KO para observar si el MODIFICACI genéticaen tenía algún efecto sobre la anatomía de la región vascular (Figura 1D). Aunque noquear de ApoE no afecta a la estructura anatómica de los vasos cerebrales en C57BL6 / J ratones, una diferencia significativa se observó entre C57BL/6J y SV129 cepas (Figura 1E, F). Por lo tanto, estamos en condiciones de demostrar la viabilidad de este protocolo de tinción para evaluar las diferencias anatómicas de la vascularización cerebral debido a diferencias genéticas o cepa en ratones.

En modelos de roedores experimentales accidente cerebrovascular, la tinción de TTC se utiliza ampliamente para observar el volumen del infarto. Visualización simultánea de los vasos cerebrales y el volumen de infarto nos dará la oportunidad de analizar los cambios morfológicos después de la isquemia-reperfusión. Por lo tanto, hemos verificado o no CB1 CB2 + mediada por tinción vascular era estable con la tinción de TTC en diversos grados de lesiones por isquemia-reperfusión (Figura 2A-H). Además, hemos analizado la anastomosis puntos entre el ACA y MCA el después de 45 min o 90 min de isquemia emparejados con cualquiera de 1 día o 5 periodos de reperfusión días (Figura I, J). Como era de esperar, la distancia media entre la línea media y los puntos anastomóticas no mostró diferencias significativas entre los grupos (Figura 2I, J) y estaba en el mismo rango que no isquémicas animales (Figura 1F). Sin embargo, la distancia de la línea media de la frontera infarto difieren significativamente, lo que refleja el aumento de volumen del infarto con mayor grado de lesión de isquemia-reperfusión (Figura 2K, L). Estos datos muestran que CB1 CB2 + tinción puede ser reproducido en los animales sometidos a diversos grados de lesión de isquemia-reperfusión y la estabilidad de la tinción cuando se combina con la tinción de TTC.

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Figura 1. La observación de la anatomía vascular cerebral en ratones con diferencias genéticas y la tensión. Figura 1A muestra que la perfusión intravascular de manchas de color de látex solamente vasos grandes en la superficie ventral, mientras que la superficie dorsal permanece sin teñir. A la inversa, CB1 CB2 + resultados de perfusión en el teñido permanente de ambos vasos pequeños y grandes en la ventral y la superficie dorsal del cerebro (Figura 1B). La cuantificación de la distancia de los puntos de anastomosis entre la arteria cerebral anterior (ACA) y la arteria cerebral media (ACM) de la línea media en el tipo salvaje C57BL6 / J ratones (Figura 1C) no muestran ninguna diferencia con sus homólogos genéticamente mutantes ApoE KO (Figura 1D). Sin embargo, se notó una diferencia significativa entre C57BL6 / J y SV129 cepas (Figura 1E, F). Barra de escala = 2 mm. * Significativamente diferente de ambos C57BL6 / J de tipo salvaje y ratones ApoE KO a 4 mm, p p <0,01.

Figura 2
Figura 2. Análisis de la anatomía vascular en los cerebros isquémicos. Figura 2A-H muestran imágenes de las superficies ventral y dorsal de los cerebros sometidos a isquemia min 45 min o 90 seguido por 1 día o 5 días tiempo de reperfusión. El panel izquierdo muestra CB1 CB2 + tinción vascular mediada, mientras que el panel derecho muestra la combinación de ambos la tinción vascular y tinción con TTC, lo que indica la estabilidad de la tinción vascular en diversos grados de lesiones por isquemia-reperfusión (Figura 2A-H). Análisis de los puntos de anastomosis entre la arteria cerebral anterior (ACA) y la arteria cerebral media (MCA) después de la isquemia min 45 min o 90 coincide con el período de reperfusión o bien 1 día, o 5 días depictos ninguna diferencia significativa entre los grupos (Figura 2I, J). Sin embargo, una diferencia significativa se puede observar en la distancia de la línea media de la frontera infarto, indicando el aumento del volumen del infarto con mayor grado de lesión de isquemia-reperfusión (Figura 2K, L). Barra de escala = 2 mm. * Significativamente diferente de la isquemia reperfusión min 45 con el día 1, p <0,05 y ** 5 reperfusión días, p <0,01. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Discussion

La perfusión de CB1 + CB2 por inyección manual puede llevarse a cabo con éxito por sin entrenamiento intensivo, ya que no implica ningún dispositivo específico para implicar cierta presión 2,3. La heterogeneidad de los resultados de perfusión en nuestro protocolo es también insignificante. Sólo 1 de cada 16 animales no isquémicas animales y 3 de cada 20 animales isquémicos han mostrado perfusión incompleta. En estos casos, la incorporación de burbujas durante la perfusión de solución salina que conduce a oclusión de los vasos era más probable que la razón del resultado infructuosos.

Aunque la perfusión de látex ha sido originalmente lleva a cabo a través de la aorta ascendente 2,3 de vías alternativas de perfusión también se informó incluyendo el ventrículo izquierdo 7,8 o la arteria carótida común 9. No se encontraron diferencias significativas en los resultados después de la perfusión ya sea a través de la aorta ascendente o el ventrículo izquierdo (observaciones no publicadas). Como tal, este último fueelegido debido a su accesibilidad más fácil.

Antes de seleccionar las tintas negras de carbono específicos mencionados en el presente estudio, se han evaluado los resultados de la perfusión intravascular con una gama de tintas de carbono comercialmente disponibles negros. CB1 y CB2 son seleccionados por su eficiencia de perfusión y la estabilidad de la tinción. CB1 tiene una viscosidad muy baja (1,1 mPa / s) que contiene 2,1% de negro de carbono mientras CB2 - originalmente fabricado como una tinta de caligrafía - contiene 2,5% de negro de carbono con una viscosidad más elevada (10-50 mPa / s). Aplicación individual de estas tintas se ha encontrado que es insuficiente con respecto a la eficiencia y la estabilidad de la tinción. En consecuencia, hemos combinado las tintas y se valoró las relaciones de combinación. La perfusión con CB1: CB2 en una proporción de 1:9 en los resultados de la tinción permanente de ambos vasos grandes y pequeños. Por lo tanto, los puntos arteriales anastomóticas puede localizar fácilmente para definir la unión entre dos territorios vasculares, es decir. la ACA y MCA. Estos findings son consistentes con reportes previos 2,10,11.

Ratones KO ApoE presentan 5-8 veces más alto nivel de colesterol en plasma y son altamente susceptibles al desarrollo de la aterosclerosis cuando se ponen sobre la dieta rica en colesterol 12. Si la modificación genética también afecta a la anatomía de los vasos cerebrales no se ha informado todavía. Por otro lado, los ratones SV129 ya se facilitan para presentar un mayor volumen de infarto en comparación con los ratones C57BL6 / J por su anatomía diferente vascular 2. Se verificó el protocolo en estos tres grupos de animales para comparar la diferencia en la anatomía vascular.

Para validar el protocolo de tinción en cerebros isquémicos, que participan transitorio de isquemia cerebral focal para incluir los efectos de la reperfusión en contraste con estudios anteriores, que se centraron principalmente en la oclusión permanente de la MCA 2-4, 10,13. Como era de esperar, no se observó ninguna diferencia significativa en el patrón de la line de anastomosis después de diferentes períodos de isquemia y reperfusión en C57BL6 / J ratones. No hay cambios en diámetros de los vasos entre los hemisferios isquémicos y no isquémicos se observaron, presumiblemente, tales cambios se producen en tiempos de reperfusión más largos, es decir, 2-3 semanas después del ictus 14. En conclusión, el protocolo demostrada por nosotros es un menos complicada, rentable técnica, que se pueden reproducir fácilmente en comparación con la perfusión convencional a base de látex para visualizar la vasculatura cerebral. Se puede considerar como una herramienta eficaz para analizar la anatomía de los vasos cerebrales y territorios vasculares en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Mediante la combinación con la tinción de TTC esta técnica proporciona una nueva oportunidad para identificar la extensión de una lesión isquémica en el contexto de las zonas de suministro vasculares en el cerebro.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a Britta Kaltwasser por su excelente asistencia técnica y Mahesh Kumar Teli para organizar la preparación de la filmación de video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scribtol Schwarz (CB2) Pelican, Germany 221 135
Stempelfarbe (CB1) Herlitz PBS AG, Germany 10417202
Gedeo Latex Pebeo, France 13042B

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References

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