विच्छेदन, संस्कृति, और विश्लेषण * These authors contributed equally

Neuroscience

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Summary

Xenopus laevis सेल भाग्य विनिर्देश और प्राथमिक सेल संस्कृति में व्यक्ति रेटिना की कोशिकाओं के शारीरिक कार्य के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. यहाँ हम रेटिना ऊतकों विदारक और प्राथमिक सेल संस्कृतियों कि कैल्शियम गतिविधि के लिए imaged और स्वस्थानी संकरण द्वारा विश्लेषण पैदा करने के लिए एक तकनीक मौजूद है.

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McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. K. L. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

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Abstract

Protocol

सभी प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और विलियम और मरियम के कॉलेज में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है. विकास इस प्रोटोकॉल में संदर्भित चरणों Nieuwkoop और फैबर 46 के अनुसार कर रहे हैं.

1. विच्छेदन

  1. सेल संस्कृति मध्यम और कैल्शियम, मैग्नीशियम मुफ्त मध्यम (सीएमएफ) कमरे के तापमान को संतुलन में लाना की अनुमति दें. तुम भी 0.1X मार्क संशोधित घंटी (एमएमआर) पीएच 7.4-7.6 की आवश्यकता होगी.
  2. एक सेल संस्कृति लामिना का प्रवाह हुड में 30 मिनट के लिए एक यूवी प्रकाश को लागू करने से निम्नलिखित मदों जीवाणुरहित. (70% इथेनॉल साथ हुड में रखने से पहले प्रत्येक आइटम स्प्रे)
    • 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश.
    • 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश.
    • 35 मिमी Nunclon सतह व्यंजन हैं.
    • 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब.
    • P1000 micropipette (1000 μl micropipette).
    • एयरोसोल प्रतिरोधी P1000 युक्तियाँ (1000 μl micropipette एयरोसोल प्रतिरोधी सुझावों).
    • शराबप्रतिरोधी कलम.
    • ठीक संदंश विदारक.
    • * 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (केवल इमेजिंग कैल्शियम गतिविधि के लिए).
    • केवल * कैल्शियम गतिविधि के इमेजिंग के लिए.
  3. एक बार हुड यूवी किया गया निष्फल गया है और समाधान करने के लिए कमरे के तापमान equilibrated है, लामिना हुड में हवा का प्रवाह पर बारी, 70% और हुड में इथेनॉल जगह मीडिया की बोतलों के साथ दस्ताने और मीडिया की बोतलें नीचे स्प्रे.
  4. हुड के अंदर एक P1000 micropipette के साथ कोशिकाओं के एक थाली के लिए निम्नलिखित, तैयार उचित लेबलिंग सुनिश्चित करने.
    • विच्छेदन प्लेट 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश 10 मिलीलीटर सेल संस्कृति मध्यम युक्त.
    • संस्कृति प्लेट - एक 35 मिमी Nunclon सतह पकवान 2 मिलीलीटर सेल संस्कृति मध्यम युक्त. (Nunclon प्लास्टिक के बर्तन और किसी भी चिपकने के साथ व्यवहार कर रहे हैं.)
    • एक खाली 1.5 मिलीलीटर ट्यूब Explant microcentrifuge पृथक्करण ट्यूब.
    • * एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार बाज़ट्यूब 15 मिलीलीटर सेल संस्कृति मध्यम युक्त. अतिरिक्त Fluo4 AM जब इमेजिंग कैल्शियम गतिविधि धोने के लिए.
  5. हुड के अंदर, एक P1000 micropipette प्रत्येक विच्छेदन सत्र के लिए (एक सत्र में एक से अधिक रेटिना dissected किया जा सकता है) के साथ निम्न तैयार करते हैं.
    • 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री पकवान युक्त 2 मिलीलीटर सीएमएफ - Explant प्लेट कुल्ला.
    • - Explant पृथक्करण प्लेट 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री 2 मिलीलीटर सीएमएफ युक्त पकवान.
  6. हुड के बाहर निम्नलिखित तैयार है:
    • 60 मिमी प्रति 10 मिलीलीटर 0.1X MMR युक्त कोशिकाओं की थाली प्लास्टिक पेट्री डिश प्लेट होल्डिंग.
    • 60 मिमी 10 मिलीलीटर 0.1X एमएमआर युक्त कोशिकाओं की थाली के अनुसार प्लास्टिक पेट्री डिश - सहोदर प्लेट.
    • विच्छेदन सत्र प्रति 10 मिलीलीटर 0.1X + मिलीग्राम / एमएल MS-222 0.5 (tricaine) एमएमआर युक्त Anesthetization प्लेट एक 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश.
  7. Explant पृथक्करण (0.1% trypsin समाधान में जिसके परिणामस्वरूप) प्लेट, मिश्रण ज़ुल्फ़ सीएमएफ में 40 μl 5% trypsin जोड़ें, और अलग निर्धारित करें.
  8. यदि एक भ्रूण है कि 30 चरण की तुलना में छोटी है विदारक, विच्छेदन (एक 1 मिलीग्राम / एमएल Collagenase बी समाधान में जिसके परिणामस्वरूप) प्लेट, ज़ुल्फ़ को भंग करने के लिए और अलग सेट के लिए 10 मिलीग्राम Collagenase बी.
  9. वांछित चरण के एक भ्रूण का चयन करने के लिए एक गैर बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ होल्डिंग प्लेट हस्तांतरण, और पीतक (अगर भ्रूण अभी तक नहीं रची है) झिल्ली ठीक संदंश का उपयोग कर हटा दें.
  10. स्थानांतरण कई हूबहू एक गैर बाँझ हस्तांतरण विंदुक साथ सहोदर प्लेट के लिए भ्रूण का मंचन किया.
  11. यदि भ्रूण 25 या पहले चरण है, विच्छेदन के साथ सीधे आगे बढ़ना है, अन्यथा Anesthetization प्लेट और एक गैर बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ भ्रूण हस्तांतरण भ्रूण आंदोलन और उत्तेजनाओं के जवाब रहता है जब तक बैठने के लिए अनुमति देते हैं. यह ले सकता हैएक मिनट के लिए.
  12. एक विदारक गुंजाइश (4X उद्देश्य, 10X ऐपिस) के तहत विच्छेदन (2 चित्रा) के साथ आगे बढ़ें.

भ्रूण चरण के लिए 25 या छोटी:

  1. विच्छेदन प्लेट एक गैर बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ भ्रूण स्थानांतरण.
  2. ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग, भ्रूण के उदर पक्ष पर एक midsagittal काट कर, पीछे के अंत पर शुरुआत और भ्रूण के अग्र भाग में सीमेंट ग्रंथि के माध्यम से जारी है.
  3. कटौती के दोनों किनारे लोभी और बाएँ और दाएँ के प्रसार के द्वारा ध्यान भ्रूण खुला. पृष्ठीय विच्छेदन प्लेट में सामना करना पड़ पक्ष के साथ एक भ्रूण में, और उदर बाहरी झिल्ली के साथ यह परिणाम खुले प्रसार करने के लिए और अन्तस्त्वक् भीतर mesoderm प्रकट.
  4. अन्तस्त्वक् और mesoderm (चित्रा 2A और 2B) को हटाने शुरू करो. इस ऊतक की पहली और सबसे बड़ी परत के साथ उपस्थिति में बहुत "शराबी"बड़े कोशिकाओं और थोड़ा स्पष्ट संगठन.
  5. इस परत को हटाने के बाद, somites और पृष्ठदंड दृश्यमान हो जाएगा. बेहतर विपरीत के लिए, एक अलग 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री 10 मिलीलीटर सेल संस्कृति मध्यम और नील ब्लू सल्फेट 1% समाधान के विच्छेदन प्लेट वापस स्थानांतरित करने से पहले 2-3 मिनट के लिए 100 μl (पानी में) युक्त डिश के लिए भ्रूण को स्थानांतरित. यह बाहरी झिल्ली, somites, आसान पहचान और उन्मुखीकरण के लिए पृष्ठदंड दाग होगा.
  6. भ्रूण के अग्र भाग पर केंद्रित है, ध्यान से पृष्ठदंड और किसी भी शेष मस्तिष्क और ऑप्टिक vesicles (चित्रा 2C) उजागर mesoderm हटा दें.
  7. एक बार मस्तिष्क और ऑप्टिक vesicles पूरी तरह से उजागर कर रहे हैं, संदंश का उपयोग करने के लिए न्यूरल ट्यूब और अंतर्निहित बाहरी झिल्ली सिर्फ मस्तिष्क के पीछे तोड़.
  8. इतना अधिक इस भाग (मस्तिष्क और ऑप्टिक vesicles) कि बाहरी झिल्ली शीर्ष पर है मुड़ें.
  9. देखभाल करने के लिए अंतर्निहित ऑप्टिक vesicles नुकसान नहीं, ध्यान रहेबाहरी झिल्ली चाल (चित्रा 2 डी).
  10. अंत में, संदंश का प्रयोग हो रहा है, मस्तिष्क (चित्रा 2 डी और 2 ई) से ऑप्टिक vesicles अलग.

भ्रूण चरण 25 से अधिक पुराने के लिए:

  1. जबकि भ्रूण Anesthetization थाली में है, संदंश के साथ भ्रूण के उदर भाग को हटा दें.
  2. बेहतर विपरीत के लिए, एक 60 मिमी 10 मिलीलीटर 0.1X एमएमआर और विच्छेदन प्लेट के लिए स्थानांतरित करने से पहले 2-3 मिनट के लिए 100 μl 1% नील ब्लू सल्फेट युक्त प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए भ्रूण को स्थानांतरित. यह बाहरी झिल्ली नीले रंग के दाग होगा.
  3. विच्छेदन प्लेट में एक बार वापस खींच बाहरी झिल्ली रेटिना (या भ्रूण 26-30 चरण के लिए ऑप्टिक पुटिका) (चित्रा 2 एफ और 2G) overlying. यदि नील ब्लू सल्फेट का इस्तेमाल किया गया था, नीले रंग की बाहरी झिल्ली दाग ​​जाएगा लेकिन अंतर्निहित रेटिना ऊतक नहीं होगा.
  4. रेटिना या ऑप्टिक पुटिका ध्यान हटाने के लिए साथrceps (चित्रा 2H, 2I, और 2j). संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में भ्रूण और पकड़ रेटिना या अन्य के साथ ऑप्टिक पुटिका हटा यह उपयोगी है.

2. ऊतक और कोशिकाओं के चढ़ाना की हदबंदी

महत्वपूर्ण नोट - ऊतकों को स्थानांतरित करने, रेटिना या ऑप्टिक पुटिका किसी भी हवा तरल सीमाओं को छूने के लिए नहीं की अनुमति नहीं है, अगर यह होता है कोशिकाओं lyse जाएगा.

  1. एक बार ऑप्टिक पुटिका या रेटिना dissected किया गया है, ध्यान से Explant हस्तांतरण एक P100 micropipette एयरोसोल प्रतिरोधी युक्तियों का उपयोग के साथ प्लेट कुल्ला और 30 सेकंड के लिए बैठने की अनुमति.
  2. हदबंदी से Explant का प्लेट Explant पृथक्करण ट्यूब सीएमएफ में 0.1% trypsin के 80 μl स्थानांतरण.
  3. एक P100 micropipette और एयरोसोल प्रतिरोधी सुझावों का उपयोग, Explant से रेटिना या ऑप्टिक पुटिका हस्तांतरण Explant Dissociati में प्लेट कुल्लाट्यूब पर, explants के हस्तांतरण से परहेज समाधान कुल्ला.
  4. ऊतक Explant पृथक्करण ट्यूब में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अलग कर देना करने के लिए अनुमति दें. एक रेटिना प्लेट प्रति इस्तेमाल किया गया था, लेकिन हम ध्यान दें कि यह संभव है कि एक से अधिक प्रति प्लेट का उपयोग करें, यदि ऐसा है तो प्लेट प्रति कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए वांछित है.
  5. कोशिकाओं थाली करने के लिए, पहले धीरे Explant पृथक्करण ट्यूब से समाधान के 40 μl को हटा दें और एक P100 micropipette और एयरोसोल प्रतिरोधी सुझावों का उपयोग त्यागें. एक P100 सेट करने के लिए 40 μl और एयरोसोल प्रतिरोधी सुझावों का प्रयोग, संस्कृति की थाली कोशिकाओं (अब कि ऊतक dissociated है) हस्तांतरण. जब थाली पर कोशिकाओं aspirating, धीरे धीरे विंदुक और प्लेट के केंद्र में एक छोटे से क्षेत्र में कोशिकाओं रखना.

नोट: यदि कोशिकाओं के कई छवियों के लिए प्रयोग में लिया जा, संस्कृति प्लेट के नीचे करने के लिए एक ग्रिड (Cellattice) संलग्न

  1. कोशिकाओं को कम से कम 1 घंटा के लिए undisturbed बैठने के लिए अनुमति दें Nunclon थाली का पालन. इस समय के बाद, वे बहुत धीरे से इलाज किया जाना चाहिए या वे अलग हो सकता है.
  2. भाई भ्रूण है, जो कोशिकाओं के रूप में एक ही तापमान में पाला जाता देख संस्कृति वांछित चरण के लिए कोशिकाओं. यदि जीवित कोशिकाओं आगे हेरफेर के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा रहे हैं, वे इस समय MEMFA समाधान में तय किया जा सकता है.

महत्वपूर्ण नोट: अपने प्रयोगों के अधिकांश कोशिकाओं चढ़ाना के 6 घंटे के भीतर तय कर रहे हैं. संस्कृति में कोशिकाओं के दीर्घायु जो मंच पर ऊतक dissected किया गया था और जर्दी में अभी भी कोशिकाओं में मौजूद राशि पर निर्भर करता है, छोटी (neurula चरणों) से dissected कोशिकाओं संस्कृति में 5-6 दिनों के लिए स्वस्थ रहते हैं जबकि कक्षों से प्राप्त कर लिया उम्र भ्रूण (मेढक तैराकीचरण) संस्कृति में 2-3 दिनों के लिए व्यवहार्य रहेगा.

3. कैल्शियम 47-49 इमेजिंग

इस प्रोटोकॉल कैल्शियम संवेदनशील Fluo4-AM और confocal व्यक्ति की कोशिकाओं में कैल्शियम यात्रियों यों माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है. Fluo4-AM कदम प्रकाश से दूर किया जाना चाहिए Fluo4-AM प्रकाश के प्रति संवेदनशील है. सभी washes या जोड़ा जाना चाहिए और एक P1000 micropipette और एयरोसोल प्रतिरोधी सुझावों का उपयोग कर हटाया. Pipetting धीरे और कोशिकाओं को परेशान करने से बचने के लिए प्लेट के किनारे की ओर से किया जाना चाहिए. मीडिया क्योंकि संस्कृतियों dissected की 6 घंटा के भीतर आम तौर पर तय कर रहे हैं नहीं बदला है. लंबी अवधि संस्कृतियों के लिए, मीडिया दैनिक परिवर्तित किया जाना चाहिए.

  1. Fluo4 AM -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, और हम 5 μl aliquots में भंडारण के सुझाव देते हैं. उपयोग करने से पहले, एक प्रकाश से दूर Fluo4-5 μl अशेष भाजक पिघलना और सीधे इस अशेष भाजक F-127 Pluronic के 2 μl जोड़ें.
  2. संवर्धन के बाद कोशिकाओं (कम से कम समय के वांछित राशि के लिए1 घंटा), संस्कृति की थाली से सेल संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर हटा दें. AM और Pluronic Fluo4 के लिए इस जोड़ें, कोमल pipetting द्वारा मिश्रण.
  3. धीरे धीरे इस समाधान का सब वापस imaged किया जा कोशिकाओं की संस्कृति प्लेट के किनारे करने के लिए और हस्तांतरण इस 1 को अवशोषित Fluo4-AM घंटा के लिए undisturbed समाधान में कोशिकाओं को छोड़.
  4. बाहर धोने सेल संस्कृति के माध्यम से Fluo4 AM अतिरिक्त, निम्नलिखित धोने श्रृंखला को पूरा:
    • थाली से मीडिया के 1 मिलीलीटर निकालें.
    • थाली ताजा सेल संस्कृति मीडिया के 3 मिलीलीटर (15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से) जोड़ें.
    • दो अतिरिक्त washes, हर बार धीरे थाली से समाधान के 3 मिलीलीटर हटाने और ताजा सेल संस्कृति मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ने प्रदर्शन.
  5. कोशिकाओं को अब सेल संस्कृति के माध्यम के 4 मिलीलीटर में होना चाहिए और Fluo4 AM होते हैं. Fluo4 AM enzymatically सेल के अंदर एक बार cleaved, यह सेल के diffusing बाहर से या किसी भी झिल्ली बाध्य डिब्बों में रोकने. इमेजिंग के लिए confocal खुर्दबीन के मंच पर प्लेट लोड करने से पहले, पकवान पर स्थायी मार्कर के साथ एक खड़ी लाल रेखा आकर्षित जबकि संस्कृति contaminating से मार्कर कण को ​​रोकने के कवर रखने के. खड़ी रेखा के नीचे पेट्री डिश (पेट्री, ढक्कन नहीं पकवान के आधार) की ओर खींचा है. इसका उद्देश्य देखने के क्षेत्र में सम्मान के साथ संस्कृति की थाली के उन्मुखीकरण का संकेत मिलता है कि इतना सटीक और व्यक्ति की कोशिकाओं के उन्मुखीकरण संरेखण जा सकता है बाद में एक बिंदु पर फिर से स्थापित करने के लिए है.
  6. थाली अब इमेजिंग के लिए confocal खुर्दबीन के मंच पर लोड करने के लिए तैयार है. एक स्कैनिंग लेजर confocal खुर्दबीन (20X उद्देश्य) पर उज्ज्वल क्षेत्र सेटिंग्स का उपयोग कोशिकाओं कल्पना. घने कोशिकाओं के एक क्षेत्र है कि clumps नहीं होते हैं, देखने के क्षेत्र एक कि Cellatice coverslip पर बड़ी ग्रिड संख्या आसान देखने के वही क्षेत्र खोजने पर बाद में कर सकते हैं साथ अधिमानतः जब सी में के बाद संस्कृति इमेजिंगतू संकरण. इमेजिंग के लिए पहले, संस्कृति के माध्यम से नीचे ध्यान केंद्रित करने और कोशिकाओं नीचे ग्रिड और सेल संस्कृति के स्थान अभिविन्यास रिकॉर्ड की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि ले. यह बाद के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है.
  7. फोकल हवाई जहाज़ उठाएँ और कोशिकाओं के एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि शुरुआत कैल्शियम इमेजिंग (चित्रा 3 ए) पर कब्जा करने से पहले.
  8. एक बार कोशिकाओं के केंद्र विमान ध्यान में है, थाली कैल्शियम गतिविधि की इमेजिंग के लिए तैयार है. सेटिंग्स खुर्दबीन और आवेदन के आधार पर अलग अलग होंगे. हम निम्नलिखित मानकों के साथ 1, 2, या 12 घंटे के लिए एक आर्गन 488 एनएम लेजर का उपयोग कोशिकाओं छवि:
    • 1 घंटे छवियों:
      • आर्गन 488 एनएम लेजर इसकी अधिकतम 30 मेगावाट बिजली का 4% पर स्कैन.
      • एक बार स्कैन हर 4 सेकंड (प्रति घंटा 900 स्कैन).
    • 2 घंटे छवियों:
      • आर्गन 488 एनएम लेजर इसकी अधिकतम 30 मेगावाट बिजली का 4% पर स्कैन.
      • एक बार स्कैन हर8 सेकंड (प्रति घंटा 450 स्कैन).
    • 12 घंटा छवियों:
      • आर्गन 488 एनएम लेजर इसकी अधिकतम 30 मेगावाट बिजली के 2% पर स्कैन.
      • एक बार स्कैन हर 48 सेकंड (प्रति घंटा 75 स्कैन).

इन मानकों को एक समय सीमा के लिए अभी भी 900 फ्रेम छवियों का एक सेट में परिणाम होगा. कैल्शियम गतिविधि तो समय बेशक छवियों (3B चित्रा) से अधिक 50 ImageJ के रूप में एक छवि प्रसंस्करण आवेदन के उपयोग के साथ प्रतिदीप्ति के स्तर का विश्लेषण करके दर्ज किया जा सकता है.

4. कोशिकाओं फिक्सिंग

  1. इमेजिंग के बाद, कोशिकाओं थाली से समाधान के 3 मिलीलीटर हटाने और संस्कृति मीडिया के शेष 1 मिलीग्राम 1 मिलीलीटर 2X MEMFA जोड़ने से 30 मिनट के लिए निर्धारित किया जा सकता है.
  2. नियतन के बाद, MEMFA को हटाने और 5 मिनट washes 1 मिलीलीटर की मात्रा प्रत्येक की एक श्रृंखला के साथ कोशिकाओं निर्जलीकरण:
    • 1X फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) में 25% इथेनॉल.
    • 1X पीबीएस में 50% इथेनॉल.
    • <ली> sdd एच 2 ओ (बाँझ विआयनीकृत आसुत जल) में 75% इथेनॉल.
    • 1 मिलीग्राम 100% इथेनॉल और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान की थाली के साथ पिछले धोने बदलें

नोट: मेथनॉल भी इन washes के लिए और भंडारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

5. स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्त (मछली)

संस्कृति Xenopus के लिए मानक मछली प्रोटोकॉल का उपयोग assayed किया जा सकता है के रूप में सेल संस्कृति के लिए संशोधनों के साथ 51 के रूप में वर्णित एंडरसन 52 लैब द्वारा उल्लिखित. एंडरसन लैब प्रोटोकॉल संशोधन नीचे सूचीबद्ध हैं. सभी washes 35 मिमी Nunclon प्लेटों पर लगभग 1 मिलीलीटर की मात्रा में आयोजित की जाती हैं, जब तक अन्यथा नोट. समाधान के रूप में परिभाषित कर रहे हैं sive एट अल में 53 जब तक अन्यथा नोट.

महत्वपूर्ण नोट: fluorescein लेबल शाही सेना जांच का उपयोग नहीं जब स्वस्थानी संकरण में प्रदर्शन के लिए imaged कोशिकाओं पर क्याकैल्शियम गतिविधि. विरोधी fluorescein एंटीबॉडी अवशिष्ट कोशिकाओं में Fluo4 AM और संस्कृति में सभी कोशिकाओं में सकारात्मक संकेत के कारण हो सकता है के लिए बाध्य होगा.

दिन 1: Permeabilization संकरण और

  1. पुनर्जलपूरण washes निर्जलीकरण भंडारण के लिए इस्तेमाल विलायक वर्गीकृत किया जाना चाहिए. अपने प्रयोगों के लिए, washes 1X पीबीएस में इथेनॉल के लिए वर्गीकृत किया गया.
  2. पुनर्जलीकरण के बाद कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन अतिरिक्त बार धोने 1X पीबीएस में.
  3. एक बाज़ ट्यूब में 62.5 μl एसिटिक एनहाइड्राइड के साथ मिक्स 0.1 एम triethanolamine (8.0 पीएच) की 25 मिलीलीटर और जल्दी से मिश्रण जब तक अच्छी तरह से एंडरसन लैब 52 प्रोटोकॉल में चर्चा के रूप में छितरी हुई है. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इस मिश्रण में संस्कृतियों सेते हैं. एसिटिक एनहाइड्राइड उपचार के बाद, 1X खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को धो लो.
  4. पिछले एसएससी धोने निकालें और 0.2 एम एचसीएल (sdd एच 2 हे में) के साथ 10 मिनट के लिए जगह कोशिकाओं permeabilize <./ Li>
  5. 1X पीबीएस में 5 मिनट के लिए दो washes के साथ एचसीएल को धो लें.
  6. 60 ° सी 6 घंटा की एक न्यूनतम के लिए एक मिलाते हुए पानी में स्नान ISH बफर में Prehybridize, लेकिन prehybridize के रूप में इस गंभीर संकेत रातोंरात नहीं घटता.
  7. पतला जांच के 750 μl (एक विशुद्ध जांच से 1:250 कमजोर पड़ने) में 8-14 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संकरण. 1.0-1.5 से जांच एकाग्रता पर्वतमाला शुद्ध / छ μl.

2 दिन: अपार जांच और एंटीबॉडी ऊष्मायन का हटाया जाना

  1. जांच निकालें और 0.2X एसएससी में 5 मिनट के लिए 60 बजे संस्कृतियों कुल्ला ° सी. ताजा 0.2X एसएससी में 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर धो
  2. पानी से स्नान संस्कृतियों निकालें और उन्हें 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान को समायोजित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.2X एसएससी में कुल्ला.
  4. 0.1% Triton एक्स 100 (पीबीटी) के साथ 1X पीबीएस में 15 मिनट के लिए धो लें.
  5. अंतर्जात पराक्सिडेजों को निष्क्रिय करने के लिए, 2% एच पीबीटी में 2 हे 2 समाधान में 1 घंटे के लिए धो लो.
  6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 2% Maleic एसिड बफर (एमएबी) में अवरुद्ध अभिकर्मक में मै. हमने पाया है कि इस विधि अवरुद्ध पीबीटी में 20% भेड़ सीरम में अवरुद्ध करने के तरीकों के पिछले की तुलना में संवेदनशीलता बढ़ जाती है.
  7. 1% 2 एमएबी में अवरुद्ध अभिकर्मक एक फली संयुग्मित एंटीबॉडी का एक 1:1,000 कमजोर पड़ने रातोंरात युक्त मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते

दिन 3: अपार एंटीबॉडी का हटाया जाना और प्रतिदीप्ति विकास

  1. एंटीबॉडी समाधान निकालें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए TBST में 3 बार कुल्ला.
  2. TBST में 4 बार कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए, जबकि लगातार एक धीमी गति से कमाल धो लें.
  3. पीबीटी में दो बार 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धो लें.
  4. 1:200 fluorescein tyramide या 1:25 Cy3 पीबीटी में पतला tyramide के 750 μl लागू. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते और 2.5 μl 0.3% एच 2 2 हे. 40 मिनट के लिए रॉक संकेत विकसित करने की अनुमति है.
  5. TBST में प्रत्येक 15 मिनट के लिए कमाल के साथ कमरे के तापमान पर कम से कम 4 बार धोएं.
  6. एक बार संकेत पूरी तरह से विकसित किया गया है, 1X पीबीटी में 5 मिनट के लिए धो लो.
  7. कमरे के तापमान पर 1 घंटा और 1X पीबीएस में दुकान के लिए 1X MEMFA में 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्स

6. छवि मछली परिणाम और सह के साथ रजिस्टर कैल्शियम इमेजिंग डेटा

  1. मछली के पूरा होने पर, सेल संस्कृति प्लेटों को निर्धारित कोशिकाएं होती हैं जो किसी भी जांच के लिए एक सकारात्मक प्रतिदीप्ति संकेत प्रदर्शित imaged. Cellattice coverslip प्रयोग देखने के सटीक क्षेत्र कैल्शियम इमेजिंग के दौरान अध्ययन पाते हैं और कैल्शियम छवि फ्रेम के उन्मुखीकरण के लिए थाली संरेखित करें.
  2. कोशिकाओं के केंद्र विमान फोकस करने के लिए और एक उच्च संकल्प इसकी अधिकतम 1 मेगावाट बिजली (चित्रा 3C) के 15% पर हीलियम नियॉन HeNe 543 एनएम लेजर का उपयोग कर छवि ले.
  3. मूल 900 फ्रेम में कैल्शियम इमेजिंग प्रोटोकॉल से लिए गए चित्रों का सेट,हित के क्षेत्रों के रूप में एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम (50 ImageJ जैसे) के प्रयोग के माध्यम से व्यक्तिगत कोशिकाओं (ROIs) की पहचान. डेटा समय प्रतिदीप्ति जोड़ी मूल्यों का प्रतिनिधित्व (4 चित्रा) अंक का एक सेट के रूप में आरओआई प्रतिदीप्ति डेटा निकालें.
  4. कैल्शियम छवियों (चित्रा 3 डी) से पहचान ROIs के साथ मछली परिणाम छवि ढ़कें.
  5. कि लागत पर लाभ इसी सेल अब मछली के छवि के देखने के क्षेत्र के भीतर पाया जा सकता है मामले में जांच के लिए सकारात्मक है, जांच के लिए नकारात्मक है, या अज्ञात के रूप में पंजीकरण प्रत्येक ROI ज़्यादा से ज़्यादा.
  6. प्रक्रिया आरओआई प्रतिदीप्ति डेटा सांख्यिकीय विश्लेषण लिपियों (MATLAB या अन्य प्रोग्रामिंग भाषा के माध्यम से बनाया गया) का उपयोग करने के लिए अलग dissected (चित्रा 5A और 5C) चरणों या अलग मछली जांच (चित्रा 5B और 5D) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के बीच कैल्शियम गतिविधि के स्तर की तुलना में. हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल लिपियों सभी अनुरोध पर आसानी से उपलब्ध हैं.

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Representative Results

सफलतापूर्वक dissected ऑप्टिक (25 चरण) vesicles और दृष्टिपटल (35 चरण) के उदाहरण 2E और 2j आंकड़े में दिखाया जाता है. जबकि इस प्रोटोकॉल के विकास के विभिन्न चरणों में किया जा सकता है, यह केवल रेटिना ऊतक को प्राप्त करने के लिए आगे के प्रयोगों के लिए शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ध्यान से सभी स्तरों पर epidermis को हटा दें और यह सुनिश्चित करें कि आपके संदंश रेटिना ऊतक पंचर नहीं करते. चरण में 35 या पुराने, लेंस रेटिना के शीर्ष पर एक स्पष्ट परत के रूप में देखा जा सकता है और सतर्क संदंश का उपयोग कर scraping द्वारा हटाया जा सकता है.

एक सफलतापूर्वक मढ़वाया प्राथमिक सेल संस्कृति चित्रा 3A में दिखाया गया है. जब ऊतक dissociating, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सिफारिश की 30 सेकंड ऊष्मायन समाधान कुल्ला में dissociating से ऊतक को रोकने के समय की तुलना में लंबे समय तक के लिए रेटिना explant समाधान कुल्ला में नहीं छोड़. इसके अलावा यह सुनिश्चित करें कि ऊतकों को एक पूर्ण घंटे के लिए trypsin समाधान में अलग कर देना करने की अनुमति दी है(पुराने भ्रूण और लार्वा चरणों अब भी आवश्यकता हो सकती है) संस्कृति की थाली में एक कोशिकाओं का भी वितरण की अनुमति. एक बार कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है, सावधानी बरतें जब प्लेट और समाधान को बदलने थाली से कोशिकाओं धोने से बचने.

आंकड़े 3B और 3C कैल्शियम गतिविधि स्कैनिंग और स्वस्थानी संकरण प्रयोगों (मछली) में फ्लोरोसेंट से चित्र प्रदर्शित, क्रमशः. कक्ष कि कैल्शियम छवि में चमकीले हरे रंग दिखाई देते हैं कोशिकाओं है कि आंतरिक कैल्शियम स्टोर की रिहाई का एक परिणाम के रूप में intracellular कैल्शियम के स्तर में एक क्षणिक स्पाइक के दौर से गुजर रहे हैं. कोशिकाओं तो जीन मछली का उपयोग कर अभिव्यक्ति के लिए assayed किया जा सकता है, और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न छवियों overlaying (चित्रा 3 डी) द्वारा कैल्शियम spiking गतिविधि के पैटर्न सहसंबद्ध किया जा सकता है. पायथन और MATLAB लिपियों (अनुरोध पर आसानी से उपलब्ध) का एक संयोजन का उपयोग करना है, डेटा प्रत्येक individu प्रतिदीप्ति गतिविधि का विश्लेषण करके प्राप्त की हैब्याज की इमेजिंग के पाठ्यक्रम के माध्यम से अल क्षेत्र (आरओआई). इमेजिंग के 1 घंटे से अधिक एक व्यक्ति के सेल (आरओआई) के लिए कैल्शियम की गतिविधि का एक उदाहरण 4 चित्र में दिखाया गया है, एक कील इमेजिंग के लगभग 57 मिनट पर दिखाई देता है. तालिका 1 में, विभिन्न जांच के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए प्रतिनिधि डेटा दिखाए जाते हैं, जबकि कोई साहित्य की रिपोर्ट में इस प्रयोग (हमारे वर्तमान प्रयोगों की बात करने के लिए इन प्रतिशत निर्धारित है) के लिए विशिष्ट डेटा कर रहे हैं, हमारे निष्कर्ष के साथ संगत कर रहे हैं रीढ़ की हड्डी 17,55,56 की हड्डी में कैल्शियम गतिविधि से संबंधित प्रयोगों के समान प्रकार से डेटा.

विश्लेषण के लिए उपयोग पैरामीटर संख्या, आवृत्ति, और spikes के आयाम चित्रा 5 शामिल हैं. भ्रूण रेटिना xVglut1, Ptf1a, और xGAD67 के लिए जांच का उपयोग कोशिकाओं में कैल्शियम इमेजिंग और मछली प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है. MATLAB स्क्रिप्ट, पूर्वी वायु कमान के लिए spikes की संख्या का प्रयोगघंटे आरओआई निर्धारित और spikes की संख्या प्रयोग में सभी ROIs के लिए औसत है. प्रत्येक प्रयोग से spikes की औसत संख्या तो अन्य प्रयोगों के साथ संकलित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रयोगों के एक समूह के लिए औसत. संचयी वितरण भूखंडों के लिए एक समूह के भीतर सभी प्रयोगों के लिए spikes की औसत संख्या के वितरण को प्रदर्शित करने के लिए बनाया जा सकता है. MATLAB लिपियों तो डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया जाता है.

चित्रा 5 MATLAB विश्लेषण के बाद प्रतिनिधि आंकड़ों से पता चलता है. संक्षेप में, हमारे परिणाम बताते हैं कि कैल्शियम गतिविधि developmentally नियंत्रित किया जाता है, 35 स्तर पर spiking peaking के साथ (पी 0.002 <) (आंकड़े 5A और 5C). एक विशिष्ट जांच के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के साथ कैल्शियम गतिविधि correlating, जबकि वहाँ कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद थे के संदर्भ में, लेकिन वहाँ के लिए xGAD67 (विभेदित GABAergic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए एक (= पी 0.08) की प्रवृत्ति है highe प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कैल्शियम spiking गतिविधि का एक glutamatergic मार्कर के लिए या Ptf1a, एक प्रतिलेखन कारक जीन GABAeric phenotype को बढ़ावा देने के साथ सहसंबद्ध जीन एन्कोडिंग के लिए पॉजिटिव कोशिकाओं से r स्तरों. प्रारंभिक हालांकि, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि वहाँ GABAergic कोशिकाओं, जो एक Ptf1a की स्वतंत्र तरीके से या कि गतिविधि पर निर्भर neurotransmitter विनिर्देश में विकसित Ptf1a के स्तर पर काम कर रहा है हो सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रक्रियात्मक योजनाबद्ध एक बार रेटिना ऊतक dissected और dissociated, प्राथमिक सेल संस्कृति आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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चित्रा 2. विच्छेदन फोटो. भ्रूण नील बढ़ा विपरीत के लिए ब्लू सल्फेट में दाग थे. AE: 24 स्टेज. FJ: 35 स्टेज. Abbreviations: ov, ऑप्टिक पुटिका, fb, अग्रमस्तिष्क, अनुसूचित जाति, रीढ़ की हड्डी, मुझे, mesoderm, ले, लेंस, तटरक्षक, सीमेंट ग्रंथि, तो, somites फिर रेटिना, ep, उपकला बड़ा आंकड़ा के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. ROIs साथ सेल संस्कृति की छवियाँ परिक्रमा ए. उज्ज्वल क्षेत्र. बी ROIs Fluo-4 (AM) के साथ इलाज के बाद छवि की परिक्रमा की. सी. मछली छवि (तीर वोल्टेज gated कैल्शियम CaV2.1 चैनल के अल्फा सबयूनिट के लिए पॉजिटिव कोशिकाओं के उदाहरण से संकेत मिलता है). डी. ओवरले उज्ज्वल क्षेत्र, Fluo-4, और मछली छवियों.

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चित्रा 4. एक एकल कोशिका (आरओआई) के लिए कैल्शियम की गतिविधि के उदाहरण (रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों में, RFU) एक Fluo4 कैल्शियम प्रतिदीप्ति छवि बनाम प्रतिदीप्ति समय (मिनट में) के प्लॉट.

चित्रा 5
चित्रा 5. परिणाम चरण में है और जांच से कैल्शियम spiking प्रदर्शित ए. 30 चरणों में कैल्शियम spikes की औसत संख्या (n = 4), 35 (n = 8), और 38 (n = 13). बी अलग स्वस्थानी संकरण में xVglut1 35 (n = 3) चरण में इस्तेमाल किया जांच में संस्कृति के प्रति कैल्शियम spikes की औसत संख्या, xGAD67 (n = 3), और Ptf1a (एन 4 =). सी. चरणों 30, 35, 38 में संस्कृति के प्रति spikes की औसत संख्या का संचयी वितरण साजिश है. डी. संचयी distributi35 स्तर पर स्वस्थानी संकरण जांच के लिए सकारात्मक संकेत होने के रूप में पहचान की कोशिकाओं के लिए संस्कृति के प्रति spikes की औसत संख्या के भूखंड पर, xVglut1, xGAD67, और Ptf1a बड़ा आंकड़ा के लिए यहाँ क्लिक करें .

जांच मंच n (प्लेट) n (कोशिकाओं) सकारात्मक प्रतिशत
xGAD67 35 4 1042 2%
38 4 690 2%
Ptf1a 30 3 352 1%
35 6 1856 1%
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2%
38 3 364 4%

तालिका 1 प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं.

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Discussion

इसकी अच्छी तरह से विशेषता कोशिका प्रकार है कि सभी रीढ़ भर में संरक्षित कर रहे हैं, रेटिना आणविक सेलुलर सेल प्रकार विनिर्देश और भेदभाव से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराता है. प्राथमिक सेल संस्कृति जीन की अभिव्यक्ति, प्रोटीन गतिशीलता, कैल्शियम और और एकल कक्ष संकल्प के स्तर पर बिजली की गतिविधि सहित प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका देता है. यहाँ हम dissected Xenopus laevis, इस तरह के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से उत्तरदायी जीव दिया प्रकल्पित रेटिना ऊतक से प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए एक सरल तकनीक मौजूद है कि प्रकल्पित रेटिना विकास और कि प्राथमिक सेल संस्कृति के बहुत जल्द से जल्द चरणों से आसानी से सुलभ है एक में हो सकता है परिभाषित एक सरल नमकीन घोल से मिलकर मीडिया.

आसानी से सबसे प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए अनुकूलनीय हालांकि, वहाँ कई कदम है कि विशेष रूप से करीब ध्यान की आवश्यकता होती है. Dissections हौसले से बढ़ाई संदंश के साथ किया जाना चाहिए. छोटी चरणों (<सेंट 30) Collagenase बी के साथ उपचार सेल संस्कृति मध्यम के साथ मिश्रित से लाभ. दूसरे करने के लिए ऊतक या एक मीडिया से कोशिकाओं के हस्तांतरण को शामिल सभी कदम विशेष देखभाल के साथ किया जाना चाहिए हवा समाधान इंटरफ़ेस की निकटता में आने से ऊतक या कोशिकाओं को रोकने के लिए. विंदुक ऊतक युक्त पूरी तरह से तरल पदार्थ की बहुत में डुबकी लगाये हुए किया जाना चाहिए और कोशिकाओं ऊतक या बहुत धीरे धीरे से निष्कासित कर दिया. बाद कोशिकाओं को चढ़ाया किया गया है, सहित, Fluo4-AM अलावा, और सेल संस्कृति मध्यम, या निर्धारण washes सभी तरल पदार्थ स्थानान्तरण, ध्यान दिया है कि कोशिकाओं को आसानी से उखाड़ फेंकना जा सकता है प्रदर्शन किया जाना चाहिए. सभी सेल संस्कृति के साथ के रूप में, बाँझपन चिंता का विषय है, तो देखभाल करने के लिए सभी सामग्री बाँझ लिया जाना चाहिए. अंत में, दे dissociated रेटिना explants हदबंदी मध्यम में निर्दिष्ट समय सीमा के लिए बैठने सफल सेल कुर्की के लिए महत्वपूर्ण है और clumping से बचने के लिए.

दौरानविच्छेदन और संस्कृति इस प्रोटोकॉल में वर्णित हालत, दोनों परिगलन और apoptosis अत्यंत सीमित (कोशिकाओं की 5-10% से कम) कर रहे हैं. थाली पर कोशिकाओं की हानि (apoptosis) के पूर्व और बाद confocal इमेजिंग सत्र के दौरान शायद ही कभी देखा है. सेल संस्कृतियों ध्यान हैंडलिंग सेल व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है. समाधान परिवर्तन बहुत धीरे धीरे और लगातार प्रदर्शन किया जाना चाहिए सेल परिगलन और apoptosis रोकता. जबकि रेटिना सेल प्रकार की सटीक अनुपात को चित्रित करना प्रयोगों वर्तमान में चल रहे हैं, हम ध्यान दें कि रेटिना सेल प्रकार की एक किस्म प्रकट संस्कृतियों और कि मुलर glial कोशिकाओं (जो एक अलग आकारिकी) में प्रतिनिधित्व किया संस्कृतियों में प्रभावी नहीं हैं .

एक संभावित चिंता जब प्रयोगों में स्वस्थानी संकरण के बाद प्लेटों का विश्लेषण करने के लिए है कि कोशिकाओं में से कुछ को स्थानांतरित हो सकता है, लेकिन इस सेल ट्रैकिंग कार्यक्रमों के उपयोग के साथ संबोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, प्राथमिक सेल संस्कृति की तकनीक में निहित है, एक प्रमुख सीमा वें हैई स्थानिक patterning में स्पष्ट नुकसान है कि बरकरार ऊतकों में मौजूद है. व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान ऊतक में स्थिति द्वारा आणविक assays का उपयोग करने के बजाय स्थापित करना चाहिए. हालांकि, यह सुविधा भी बहुत ठीक है और जारी रखने के लिए सेल सेल बातचीत के अभाव में कोशिकाओं के विनिर्देशन का राज्य का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है. यह भी अन्वेषक चुनिंदा वृद्धि कारक या अन्य यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए अनुमति देता है और ठीक पड़ोसी कोशिकाओं से संकेतों के प्रभाव के बिना प्रभाव का विश्लेषण. जब तक हम इस रेटिना विच्छेदन और प्राथमिक सेल संस्कृति तकनीक विशिष्ट neurotransmitter phenotype मार्कर के साथ कैल्शियम इमेजिंग correlating के लिए कार्यरत है, इस तकनीक RT-पीसीआर का उपयोग electrophysiological रिकॉर्डिंग और एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति assays सहित अन्य बहाव के अनुप्रयोगों के एक विस्तृत रेंज के लिए अनुकूल या "अगले है जनरल transcriptome "विश्लेषण (1 चित्रा).

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम कृपा से लिपियों के लिए धन्यवाद डॉ. जॉन Hayes, डीआरएस. एरिक ब्राडली और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए क्रिस्टोफर डेल हबशी, आकर्षित किया ह्यूजेस, लौरा ODORIZZI, एलेक्स Garafalo, रेबेका Lowden, और लिज़ MacMurray परियोजना को विकसित करने और प्रारंभिक डेटा उपलब्ध कराने में अपने काम के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण पर उपयोगी सुझाव के लिए डा. ग्रेग स्मिथ. यह काम एक NIH एमएसएस के लिए (NINDS IR15N5067566 01) अनुदान और एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट विज्ञान शिक्षा विलियम और मरियम के कॉलेज के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.

Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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