Dissection, תרבות וניתוח של * These authors contributed equally

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. K. L. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התהליך שבו האזור הקדמי של הצלחת העצבית מעורר רשתית החוליות ממשיך להיות מוקד עיקרי של מחקר קליני ובסיסי. בנוסף לרלוונטיות הרפואיות הברורות להבנה וטיפול במחל רשתית, הפיתוח של רשתית החוליות ממשיך לשמש כמערכת מודל חשובה ואלגנטית לנחישות הבנה עצבית תא סוג ובידול 1-16. הרשתית העצבית מורכבת משישה סוגים בדידים תא (גנגליון, photoreceptors amacrine, אופקי, תאים דו קוטביים, ותאי גליה מולר) מסודרים בשכבות סטריאוטיפיות, דפוס הנשמר במידה רבה בין כל החוליות 12,14-18.

בעוד לומד רשתית בעובר מתפתח בשלמות נדרשה באופן ברור להבנה כיצד האיבר המורכב הזה מתפתח מבליטה של ​​המוח הקדמי למבנה שכבתי, ישנן שאלות רבות שתועלנה לכאן ולכאןמ העסקת גישות באמצעות תרבית תאים ראשוניות של תאי רשתית משוערים 7,19-23. לדוגמה, ניתוח תאים מרקמות שהוסרו וניתקו בשלבים שונים מאפשר לאדם להבחין במצב של מפרט של תאים בודדים בשלבי התפתחות שונים, כלומר, גורלם של התאים בהיעדר אינטראקציות עם רקמות שכנות 8,19-22 ,24-33. תרבית תאים עיקרית גם מאפשרת לחוקר לטיפול בתרבות עם חומרים כימיים מסוימים ולנתח את התוצאות ברמת תא בודדה 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, מערכת מודל קלסית ללימוד התפתחות עצבית מוקדמת 19,27,29,31-32,40-42, משמשת כמערכת מתאימה במיוחד לתרבות הראשונית של תאי רשתית 10,38,43-45.

רקמת רשתית משוערת היא נגישה מהשלבים המוקדמים של פיתוח, מייד לאחר השראה עצבית 25,38,43. בנוסף, ניתן הבכל תא בעובר מכיל אספקה ​​של חלמון, תאי רשתית יכולים להיות מתורבתים בטכניקה פשוטה מאוד שהוגדרה בהיקף של תמיסת מלח שנאגר, וכך להסיר את ההשפעות המבלבלות של דגירה או מוצרים אחרים המבוססים על סרום 10,24,44-45 .

עם זאת, הבידוד של רקמת הרשתית מרקמות סובבות ועיבוד שלאחר מכן מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה לנתיחה והניתוק של תאי רשתית בXenopus laevis שישמשו להכנת תרביות תאים ראשוניות שיהיו, בתורו, להיות מנותחים לפעילות הסידן וביטוי גנים ברזולוציה של תאים בודדים. בעוד הנושא שהוצג במאמר זה הוא הניתוח של הארעיים סיד ספונטניים, הטכניקה היא רחב ישימה למגוון רחב של שאלות מחקר וגישות (איור 1).

Protocol

כל הניסויים שבוצעו בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי הוועדה השתמש במכללת ויליאם ומרי. שלבי התפתחות הפניה בפרוטוקול זה הם על פי Nieuwkoop ופייבר 46.

1. בתור

  1. אפשר בינוני תא תרבות והבינונית סידן מגנזיום חינם (CMF) כדי לאזן לטמפרטורת חדר. אתה גם צריך 0.1x של מארק שינוי הצלצול של (MMR) pH 7.4-7.6.
  2. לעקר את הפריטים הבאים על ידי יישום אור UV למשך 30 דקות במכסת מנוע זרימה למינרית תרבות תא. (לרסס כל פריט עם אתנול 70% לפני ההכנסה למכסת המנוע.)
    • 35 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ.
    • 60 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ.
    • 35 מנות משטח Nunclon מ"מ.
    • 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל.
    • P1000 micropipette (1000 micropipette μl).
    • תרסיס P1000 טיפים עמידים (1000 טיפים עמידים תרסיסי micropipette μl).
    • אלכוהולעט עמיד.
    • ביתור פיין מלקחיים.
    • * 15 צינורות חרוטי מ"ל (רק לפעילות הסידן הדמיה).
    • * רק להדמיה של פעילות הסידן.
  3. ברגע שמכסה המנוע כבר לעקר UV ופתרונות לי מתאזנים לטמפרטורת חדר, להפעיל את זרימת האוויר למינרית במכסת המנוע, לרסס את הכפפות ובקבוקי תקשורת עם אתנול 70% ומקום בקבוקי תקשורת במכסת המנוע.
  4. בתוך מכסה המנוע להכין הבאה עם micropipette P1000 לכל צלחת של תאים, להבטיח תיוג מתאים.
    • צלחת אחת 60 מ"מ פטרי פלסטיק המכילה 10 מ"ל בינוני סלולרי תרבות - פלייט Dissection.
    • צלחת אחת 35 מ"מ Nunclon משטח המכילה 2 מ"ל בינוני סלולרי תרבות - פלייט תרבות. (מנות פלסטיק Nunclon אינן מטופלים נוספים עם כל דבקים.)
    • 1.5 צינור Explant Tube אחד הריק המ"ל microcentrifuge דיסוציאציה.
    • * אחד 15 מיליליטר חרוטי בזמבחנה המכילה בינונית תא תרבות מ"ל 15. לשטיפה החוצה כאשר פעילות עודפת Fluo4-AM הדמית סידן.
  5. בתוך מכסה המנוע, להכין את הדברים הבאים עם micropipette P1000 לכל מפגש דיסקציה (רשתית אחד או יותר יכולה להיות גזורה בפגישה אחת).
    • 35 מ"מ צלחת הפטר שמכילה אחד פלסטיק 2 המ"ל CMF - Explant שוטף את הצלחת.
    • 35 מ"מ צלחת הפטר שמכילה אחד פלסטיק 2 המ"ל CMF - פלייט דיסוציאציה Explant.
  6. מחוץ למכסת המנוע להכין את הדברים הבאים:
    • צלחת אחת 60 מ"מ פטרי פלסטיק לצלחת של תאים המכילים 10 המ"ל 0.1x MMR - מחזיק את הצלחת.
    • צלחת אחת 60 מ"מ פטרי פלסטיק לצלחת של תאים המכילים 10 מ"ל MMR 0.1x - פלייט אחים.
    • 60 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק אחד בכל הפעלת נתיחה המכילה 10 המ"ל 0.1x MMR + 0.5 מ"ג / מיליליטר MS-222 (tricaine) - צלחת הרדמה.
  7. לפלייט Explant דיסוציאציה (וכתוצאה מכך 0.1% פתרון טריפסין), המערבולת לערבב, ומניח בצד.
  8. אם לנתח עובר שהוא יותר צעיר מן השלב 30, להוסיף 10 מ"ג collagenase B ל פלייט Dissection (וכתוצאה מכך פתרון 1 מ"ג / מיליליטר collagenase B), המערבולת לפזר ומניח בצד.
  9. בחר עובר של השלב הרצוי, להעביר לצלחת אחזקות עם פיפטה העברה אינה סטרילי, ולהסיר את קרום vitelline (אם העובר עדיין לא בקעה) באמצעות מלקחיים עדינים.
  10. להעביר כמה עוברים זהים מבוים לפלייט האחים עם פיפטה העברה הלא סטרילית.
  11. אם העובר הוא השלב 25 או קודם לכן, להמשיך ישירות עם נתיחה, אחרת תעביר את העובר לצלחת ההרדמה עם פיפטה העברה אינה סטרילי ומאפשרים לעובר לשבת עד תנועה ותגובה לגירויים נפסקים. זה יכול לקחתעד דקה.
  12. המשך בדיסקציה (איור 2) תחת ביתור (אובייקטיבי 4X, עינית 10X).

לעוברי שלב 25 או צעיר יותר:

  1. חזרת עוברים לפלייט Dissection עם פיפטה העברה הלא סטרילית.
  2. שימוש בשני זוגות של מלקחיים עדינים, לעשות חתך midsagittal בצד הגחון של העובר, מתחיל בקצה האחורי וממשיך עד לבלוטת המלט בחלק הקדמי של העובר.
  3. בזהירות לפתוח את העובר על ידי אחיזה או הקצה לחתוך ומתפשט שמאלה וימינה. הדבר מביא לעובר עם הצד הגבה פונה אל פלייט Dissection, ועם אקטודרם הגחון פרוש לחשוף האנדודרם ומזודרם בפנים.
  4. בגין הסרת האנדודרם ומזודרם (איור 2 א ו -2). השכבה הראשונה וגדולה ביותר של רקמה זו היא מאוד "רכה" בהופעה עםתאים גדולים וארגון ברור קטן.
  5. לאחר הסרת שכבה זו, וsomites notochord יהיו גלוי. לניגוד טוב יותר, להעביר את העובר לצלחת נפרדת 60 מ"מ פטרי פלסטיק המכילה 10 מ"ל בינוני סלולרי תרבות ו100 μl של פתרון 1% מסולפט הנילוס הכחולה (במים) במשך 2-3 דקות לפני ההעברה בחזרה לפלייט Dissection. זה יהיה כתם אקטודרם, somites, וnotochord לזיהוי והתמצאות קלים יותר.
  6. ההתמקדות בחלק הקדמי של העובר, להסיר בזהירות את notochord וכל שנותר מזודרם חושף את המוח ושלפוחית ​​אופטית (האיור 2C).
  7. ברגע שהמוח והשלפוחית ​​אופטית חשופים לחלוטין, השתמש במלקחיים לנתק את הצינור העצבי ואקטודרם הבסיסי רק האחורי למוח.
  8. הפעל את החלק הזה (המוח ושלפוחית ​​אופטית) על כך שאקטודרם הוא על העליונה.
  9. נזהרים שלא לפגוע בשלפוחית ​​האופטית הבסיסית, בזהירות מחדשלהזיז את אקטודרם (האיור 2D).
  10. לבסוף, באמצעות מלקחיים, להפריד את השלפוחית ​​האופטית מהמוח (איור 2D ו2E).

לעוברים מבוגרים יותר משלב 25:

  1. בעוד העובר הוא בצלחת ההרדמה, להסיר את החלק הגחוני של העובר עם מלקחיים.
  2. לניגוד טוב יותר, להעביר את העובר לצלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מימ המכילות 10 מ"ל ו 100 0.1x MMR μl של 1% סולפט הנילוס הכחול במשך 2-3 דקות לפני ההעברה לצלחת Dissection. זה יהיה כתם הכחול אקטודרם.
  3. ברגע בצלחת Dissection, למשוך בחזרה אקטודרם גבי הרשתית (או שלפוחית ​​אופטית לבמת עוברי 26-30) (האיור 2F ו2G). אם סולפט הנילוס הכחולה היה בשימוש, אקטודרם יהיה מוכתם בכחול אבל רקמת הרשתית הבסיסית לא.
  4. הסר את הרשתית או שלפוחית ​​אופטית בזהירות עם forceps (האיור 2H, ט 2, וי 2). זה מועיל כדי להחזיק את העובר במקום עם זוג אחד של מלקחיים ולהסיר את הרשתית או שלפוחית ​​אופטית עם השני.

2. התפרקות של רקמות ותאי ציפוי של

הערה חשובה - כאשר העברת רקמות, אל תאפשרו רשתית או שלפוחית ​​אופטית לגעת שום גבולות אוויר נוזליים, ואם זה קורה בתאי lyse.

  1. ברגע שהשלפוחית ​​או הרשתית האופטית כבר גזורה, להעביר בזהירות לExplant שוטף את הצלחת עם P100 micropipette באמצעות טיפים עמידים תרסיסים ולאפשר לשבת במשך 30 שניות.
  2. העברת 80 μl של טריפסין 0.1% בCMF מפלייט דיסוציאציה Explant לTube דיסוציאציה Explant.
  3. שימוש micropipette P100 וטיפים עמידים תרסיס, להעביר את הרשתית או שלפוחית ​​אופטית מExplant שוטף את הצלחת לExplant Dissociatiברכבת תחתית, הימנעות מהעברת explants לשטוף פתרון.
  4. אפשר לנתק את הרקמה ברכבת התחתית דיסוציאציה Explant לשעה 1 בטמפרטורת חדר. רשתית אחת שמשה לצלחת, עם זאת נציין, כי ניתן להשתמש בצלחת ליותר מאדם אחד שירצה בכך כדי להגדיל את מספר תאים לכל צלחת.
  5. לצלחת התאים, תחילה להסיר לאט 40 μl של הפתרון מהרכבת התחתית דיסוציאציה Explant ולמחוק באמצעות micropipette P100 וטיפים עמידים בתרסיס. שימוש P100 סט עד 40 μl וטיפים עמידים תרסיס, להעביר את התאים (עכשיו שיש ניתקת הרקמה) לצלחת התרבות. כאשר aspirating התאים לצלחת, פיפטה לאט ולשמור על התאים בשטח קטן במרכז הצלחת.

הערה: אם תמונות מרובות של התאים הן שיש לנקוט בכל הניסוי, לצרף רשת (Cellattice) לחלק התחתון של צלחת התרבות

  1. אפשר התאים לשבת באין מפריעים במשך שעה לפחות 1 לדבוק צלחת Nunclon. לאחר פרק זמן זה, הם חייבים להיות מטופלים בעדינות, או שהם יכולים להיות מנותקים.
  2. תאים מתרבים לשלב רצוי על ידי התבוננות בעוברי האחים, אשר גודלו באותה הטמפרטורה כמו תאים. אם תאי חיים שאינם בשימוש למניפולציה נוספת, הם יכולים להיות קבועים בפתרון MEMFA בשלב זה.

הערה חשובה: רוב הניסויים שלנו הם קבועים בתוך 6 שעות של ציפוי לתאים. אריכות הימים של התאים בתרבית תלויה בשלב שבו הרקמה הייתה גזורות וכמות החלמון עדיין קיימות בתאים, התאים הגזורים מצעיר (שלבי neurula) להישאר בריאים בתרבות עבור 5-6 ימים ואילו תאים שנרכשו עוברים מבוגרים (שחי ראשןשלבים) יישארו קיימא בתרבות במשך 2-3 ימים.

3. הדמית סיד 47-49

פרוטוקול זה משתמש בסידן הרגישה מיקרוסקופיה Fluo4 AM-confocal ולכמת ארעיים הסידן בתאים בודדים. כל הצעדים באמצעות Fluo4-AM צריכים להתבצע הרחק מאור, כFluo4-AM הוא רגיש לאור. כל הכביסות שיש להוסיף או להסיר באמצעות micropipette P1000 וטיפי אירוסול עמידים. Pipetting צריך להיעשות לאט ובכיוון הקצה של הצלחת כדי לא להפריע לתאים. תקשורת לא השתנתה, כי התרבויות הנן קבועות בדרך כלל בתוך 6 שעות של ינותח. לתרבויות לטווח ארוך, התקשורת צריכה להיות שונה מדי יום.

  1. Fluo4-AM מאוחסן ב -20 ° C, ואנו מציעים אחסון ב5 aliquots μl. לפני השימוש, להפשיר aliquot μl 5 של Fluo4 AM-הרחק מאור ולהוסיף 2 μl של Pluronic F-127 ישירות לaliquot זה.
  2. לאחר culturing התאים לסכום הרצוי של זמן (לפחות1 שעות), הסר 1 מ"ל של מדיום תרבית התאים מצלחת התרבות. הוסף את זה לFluo4-AM וPluronic, ערבוב על ידי pipetting העדין.
  3. לאט לאט להעביר את כל הפתרון הזה חזרה לקצה צלחת התרבות של התאים להיות צלם ולהשאיר את התאים בתמיסה באין מפריע במשך שעה 1 לספוג Fluo4-AM זה.
  4. כדי לשטוף את עודפי Fluo4 AM-ממדיום תרבית התאים, להשלים את הסדרה לשטוף הבאה:
    • הסר 1 מ"ל של מדיה מהצלחת.
    • הוסף 3 מ"ל של תקשורת סלולרית תרבות הטריה (מצינור 15 מיליליטר החרוטים) לצלחת.
    • לבצע שתי שטיפות נוספות, בכל פעם שמוציאה לאט 3 מ"ל של תמיסה מהצלחת והוסיפה 3 מ"ל של תקשורת סלולרית תרבות הטריה.
  5. התאים אמורים להיות עכשיו ב4 מ"ל של מדיום תרבות תא ומכילים Fluo4-AM. Fluo4-AM הוא בקע enzymatically פעם בתוך התא, ומונע ממנו לצאת מלשדר את התא או לכל תאים בממברנה כפותים. לפני טעינת הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ confocal הדמיה, לצייר קו אדום אנכי עם סמן קבע על הצלחת, תוך שמירה על כיסוי על מנת למנוע את זיהום חלקיקי סמן התרבות. הקו האנכי נמשך למטה בצד של צלחת פטרי (הבסיס של צלחת פטרי, ולא את המכסה). מטרתו היא מצביעה על הכיוון של צלחת התרבות ביחס לשדה ראייה, כך שההתמצאות והתיאום המדויקת של התאים הבודדים יכולות להיות הוקמו מחדש בשלב מאוחר יותר.
  6. הצלחת עכשיו הוא מוכן להעמסה על הבמה של מיקרוסקופ confocal להדמיה. דמיינו את התאים באמצעות הגדרות שדה הבהירות בסריקת ליזר מיקרוסקופ confocal (אובייקטיבי 20X). מצא את שטח של תאים צפופים שלא מכיל גושים, רצוי עם שדה הראייה שמכיל את מספרי הרשת הגדולות על coverslip Cellatice לעשות למצוא את אותו שדה ראייה קלה מאוחר יותר כאשר הדמית התרבות לאחר בsiהכלאת טו. לפני ההדמיה, להתמקד במורד דרך התרבות ולקחת תמונת שדה בהירה של הרשת מתחת לתאים כדי להקליט את המיקום והכיוון של תרבות התאים. זה מאפשר להתכנסות של התאים לניתוח שלאחר מכן.
  7. הרם את מישור המוקד וללכוד תמונה בהירה תחום התאים לפני הדמית סידן מתחיל (איור 3 א).
  8. ברגע שמטוס המרכז של התאים הוא בפוקוס, הצלחת מוכנה להדמיה של פעילות הסידן. הגדרות תשתנינה בהתאם למיקרוסקופ ויישום. אנחנו תמונת התאים באמצעות ליזר ננומטר ארגון 488 ל1, 2, או 12 שעות עם הפרמטרים הבאים:
    • 1 תמונות hr:
      • ליזר ננומטר ארגון 488 סריקות ב4% מכוח mW 30 המרבי שלו.
      • סרוקות פעם אחת כל 4 שניות (900 סריקות לשעה).
    • 2 תמונות hr:
      • ליזר ננומטר ארגון 488 סריקות ב4% מכוח mW 30 המרבי שלו.
      • סרוק פעם אחת בכל8 שניות (450 סריקות לשעה).
    • 12 תמונות hr:
      • ליזר ננומטר ארגון 488 סריקות ב2% מכוח mW 30 המרבי שלו.
      • סרוקות פעם אחת בכל 48 שניות (75 סריקות לשעה).

פרמטרים אלה יגרמו לקבוצה של סטילס 900 תמונות מסגרת עבור כל מסגרת זמן. פעילות סיד אז ניתן להקליט באמצעות ניתוח רמות קרינה מעל את התמונות כמובן הזמן (איור 3 ב ') עם השימוש ביישום עיבוד תמונה כגון ImageJ 50.

4. תיקון תאים

  1. בעקבות הדמיה, תאים יכולים להיות קבועים למשך 30 דקות על ידי הסרת 3 מ"ל של תמיסה מהצלחת והוספת 1 המ"ל 2X MEMFA למ"ל נותר 1 מתוך תקשורת התרבות.
  2. לאחר קיבוע, להסיר MEMFA ומייבש תאים עם סדרה של 5 כביסות דקות, כל אחד בנפח של 1 מ"ל:
    • 25% אתנול בתמיסת מלח 1X פוספט שנאגר-(PBS).
    • 50% אתנול ב1X PBS.
    • <li> 75% אתנול בSDD H 2 O (מים מזוקקים deionized סטרילית).
    • החלף את השטיפה האחרונה עם המ"ל 1 100% אתנול וצלחת חנות ב -20 ° C.

הערה: מתנול יכול לשמש גם לשטיפות אלו ולאחסון.

5. פלורסנט כלאה באתר (FISH)

תרבויות ניתן assayed באמצעות פרוטוקול הסטנדרטי לדגי Xenopus כמתואר 51 עם תיקונים לתרבית תאים כפי שמתואר על ידי אנדרסון מעבדת 52. שינויים שבוצעו במעבדת אנדרסון הפרוטוקול מפורטים להלן. כל הכביסות מתבצעות על 35 צלחות Nunclon מ"מ בנפחים של כ 1 מ"ל, אלא אם צוינה אחר. פתרונות כמוגדרים בסייב et al. 53 אלא אם צוין אחר.

הערה חשובה: אין להשתמש בfluorescein שכותרתו RNA בעת ביצוע בדיקות כלאה באתר על תאים לצפו ביפעילות הסידן. נוגדני Anti-fluorescein יהיו לאגד שיורי Fluo4 AM-בתאים ועלולים לגרום לאיתות חיובית בכל התאים בתרבית.

יום 1: Permeabilization והכלאה

  1. כביסות החזרת נוזלים צריכות להיות מדורגות להתייבשות הממס המשמש לאחסון. על הניסויים שלנו, מתרחץ קבלו ציונים לאתנול ב1X PBS.
  2. בעקבות התייבשות, לשטוף את התאים שלוש פעמים נוספות ב1X PBS למשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת חדר.
  3. ערבב 25 מ"ל של 0.1 מ 'triethanolamine (pH 8.0) עם 62.5 μl של אנהידריד אצטית בצינור פלקון ומערבב במהירות עד שהתפזר ביסודיות כפי שפורט בפרוטוקול 52 מעבדת אנדרסון. דגירת תרבויות בתערובת זו למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. בעקבות טיפול אנהידריד אצטית, לשטוף תאים בציטרט הנתרן המלוח 1X (SSC) למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. הסר את שטיפת SSC האחרונה ולהחליף עם 0.2 M HCl (בSDD H 2 O) למשך 10 דקות לpermeabilize תאים. </ Li>
  5. לשטוף את HCl עם שתי כביסות ב1X PBS למשך 5 דקות.
  6. Prehybridize בחיץ איש ב 60 ° C באמבט מים רועד למינימום של 6 שעות, אבל לא prehybridize הלילה כמו זה קשה מפחית אות.
  7. להכליא בין הלילה ב 60 המעלות צלזיוס למשך 8-14 שעות ב750 μl של חללית מדוללת (1:250 דילול מחללית מטוהרת). מטוהר טווחי ריכוז בדיקה 1.0-1.5 מיקרוגרם / μl.

יום 2: הסרת Probe הפזור ודגירת נוגדן

  1. הסר את החללית ולשטוף תרבויות למשך 5 דקות ב0.2X SSC ב 60 ° C. שטוף בטרי 0.2X SSC לשעה 1 ב 60 ° C.
  2. הסר תרבויות מאמבט המים ולאפשר להם להסתגל לטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  3. שטוף ב0.2X SSC בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  4. שטוף במשך 15 דקות ב1X PBS עם 0.1% Triton-X-100 (PBT).
  5. כדי להשבית peroxidases אנדוגניים, לשטוף לשעה 1 ב2% 2 פתרון H 2 O בPBT.
  6. לחסום במגיבים חסימה של 2% במאגר חומצת Maleic (MAB) עבור 1 שעה בטמפרטורת חדר. אנחנו גילינו ששיטת חסימה זו מגבירה את הרגישות בהשוואה לשיטות הקודמות של חסימה ב20% כבשים בסרום PBT.
  7. דגירת תרבויות ב1 מ"ל של מגיב 2% חסימה בMAB מכיל 1:1,000 דילול של נוגדן POD מצומדות לילה ב 4 ° C.

יום 3: הסרת הנוגדן פזור ופיתוח פלואורסצנטי

  1. הסר פתרון נוגדן ולשטוף 3 פעמים בTBST למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  2. לשטוף 4 פעמים בTBST למשך 15 דקות בטמפרטורת חדר ואילו ברציפות מתנדנד במהירות איטית.
  3. לשטוף פעמים בPBT בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
  4. החל 750 μl של 1:200 Cy3 tyramide tyramide-fluorescein או 1:25 בדילול PBT. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולהוסיף 2.5 μl 0.3% H 2 2. רוק עבור 40 דקות כדי לאפשר לאות לפיתוח.
  5. שטוף לפחות 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד בTBST בטמפרטורת חדר עם נדנדה.
  6. ברגע שהאות התפתחה באופן מלא, למשך 5 דקות לשטוף ב1X PBT.
  7. תקן ב1X MEMFA לשעה 1 בטמפרטורת חדר וחנות ב1X PBS ב 4 ° C.

6. תוצאות דגים לתמונה ובשיתוף עם הרשמת נתוני הדמית סיד

  1. עם השלמת דגים, צלחות תרביות תאים הם צלמו כדי לקבוע אילו תאים להציג אות פלואורסצנציה חיובית לבדיקה נתונה. השתמש coverslip Cellattice למצוא את התחום המדויק של נוף למד במהלך הדמית הסיד וליישר את הצלחת לכיוון של מסגרות התמונה הסידן.
  2. תתמקד למישור המרכז של התאים ולקחת תמונה ברזולוציה גבוהה יחידה באמצעות ליזר ננומטר הליום ניאון HeNe 543 ב 15% מכוחה המרבי 1 mW (האיור 3C).
  3. במסגרת המקורית 900 סט של תמונות שצולמו מפרוטוקול הדמית סידן,לזהות תאים בודדים כמו אזורים של עניין (Rois) באמצעות השימוש בתוכנת עיבוד תמונה (כגון ImageJ 50). לחלץ את נתוני קרינת החזר על השקעה כערכה של נקודתי נתונים המייצגים ערכי זוג הזמן פלואורסצנטי (איור 4).
  4. כיסוי תמונת תוצאות הדגים עם Rois זיהה מתמונות הסיד (האיור 3D).
  5. הרשמה לכל החזר על השקעה חיובית לבדיקה, שלילי לבדיקה, או לא ידוע - במקרה שהתא המתאים להחזר על ההשקעה כבר לא ניתן למצוא בתוך שדה הראייה של תמונת הדגים.
  6. נתוני קרינת ROI תהליך באמצעות תסריטי ניתוח סטטיסטיים (כפי שתוכנן באמצעות MATLAB או שפת תכנות אחרת) כדי להשוות בין רמות פעילות סיד שלבים שונים גזורים (האיור 5A ו5C) או תאים חיוביים לבדיקות דגים שונות (5B האיור ו5D). כל הסקריפטים משמשים במעבדה שלנו זמינים באופן חופשי על פי דרישה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמאות לשלפוחית ​​נתחה בהצלחה אופטית (שלב 25) ורשתיות עיניים (שלב 35) מוצגות באיורי 2E וי 2. בעוד שניתן להשתמש בפרוטוקול זה בשלבים שונים של פיתוח, זה הוא קריטי להשגת רקמת רשתית רק כדי להבטיח דיוק לניסויים נוספים. מוציא בזהירות את האפידרמיס בכל השלבים ולהבטיח כי המלקחיים שלך לא לנקב את רקמת הרשתית. בשלב 35 ומעלה, העדשה ניתן לראות כשכבה ברורה על גבי הרשתית וניתן להסיר על ידי גירוד זהיר באמצעות מלקחיים.

תרבית תאים עיקרית בהצלחה מצופית מוצגת באיור 3 א. כאשר dissociating רקמות, חשוב לא להשאיר explant הרשתית בפתרון לשטוף ליותר מהזמן המומלץ 30 שניות כדי למנוע דגירת הרקמה מdissociating בפתרון לשטוף. בנוסף, יש לוודא כי הרקמה מותרת לנתק בפתרון טריפסין לשעה שלמה(עובריים מבוגרים ושלבי זחל עשוי לדרוש אפילו יותר) כדי לאפשר חלוקה שווה של תאים בצלחת התרבות. ברגע שהתאים מצופים, לנהוג בזהירות בעת העברת צלחת ושינוי פתרונות כדי להימנע משטיפת התאים מהצלחת.

דמויות 3B ו3C להפגין תמונות מסריקת סידן ופעילות ניאון בניסויי כלאה באתר (FISH), בהתאמה. תאים המופיעים ירוק בהיר בתמונת הסידן הם תאים שעוברים ספייק חולף ברמות הסידן תאיים, כתוצאה משחרורו של חנויות סיד הפנימיות. תאים לאחר מכן ניתן assayed על ביטוי גנים בעזרת דגים, ודפוסי ביטוי גנים יכולים להיות בקורלציה לדפוסי פעילות סיד spiking ידי כיסה את התמונות (האיור 3D). באמצעות שילוב של פייתון וMATLAB תסריטים (זמין באופן חופשי על פי בקשה), נתונים מתקבלים על ידי ניתוח פעילות הקרינה של כל individuאזור אל של עניין (ROI) דרך הקורס של ההדמיה. דוגמה לפעילות הסידן לתא בודד (ROI) מעל 1 שעה של הדמיה מוצגת באיור 4; ספייק גלוי בכ 57 דקות של הדמיה. בלוח 1, נתונים מייצגים עבור אחוז התאים חיוביים לבדיקות שונות מוצגים, בעוד שאין נתונים ספציפיים לניסוי הזה דווח בספרות (הנקודה של הניסויים הנוכחיים שלנו היא לקבוע אחוזים אלה), הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם נתונים מסוגים דומים של ניסויים הקשורים לפעילות הסידן בחוט השדרה 17,55,56.

פרמטרים מנוצלים לניתוח כוללים את המספר, תדירות, משרעת של קוצים. איור 5 מספק תוצאות מייצגות של הדמית סיד וניסויי FISH בתאי רשתית עובריים באמצעות בדיקות לxVglut1, Ptf1a, וxGAD67. שימוש MATLAB תסריטים, מספר הקוצים לEACח החזר ההשקעה נקבע ומספר הקוצים הוא ממוצע לכל Rois בניסוי. מספר הממוצע של קוצים מכל ניסוי ואז יכול להיות הידור בניסויים אחרים, וכתוצאה מהממוצע לקבוצה של ניסויים. חלקות התפלגות מצטברות ניתן ליצור כדי להציג את התפלגות המספר הממוצע של קוצים לכל הניסויים בתוך קבוצה. תסריטי MATLAB משמשים לאחר מכן לניתוח סטטיסטי של הנתונים.

איור 5 מראה נתונים מייצגים בעקבות ניתוח, MATLAB. בקצרה, התוצאות שלנו מראות שפעילות סידן מוסדרת התפתחותית, עם spiking השיא בשלב 35 (p <0.002) (5A דמויות ו5C). במונחים של פעילות correlating סידן עם תאים חיוביים לבדיקה ספציפית, ואילו לא היו הבדלים משמעותיים סטטיסטי, עם זאת יש מגמה (p = 0.08) לתאים חיוביים לxGAD67 (סמן לתאי GABAergic בדיל) כדי להציג highe רמות r פעילות סיד spiking מאשר תאים חיוביים עבור סמן glutamatergic או לPtf1a, גן מקודד גן גורם שעתוק בקורלציה עם קידום פנוטיפ GABAeric. למרות ראשוני, נתונים אלה מראים כי ייתכן שיש תאי GABAergic, המתפתחים באופן בלתי תלוי בPtf1a או שמפרט הנוירוטרנסמיטר פעילות תלוי לא פועל ברמה של Ptf1a.

איור 1
איור 1. סכמטי פרוצדורלי. רגע רקמת רשתית היא גזורה ותרבית תאים מנותקת, עיקרית יכולה לשמש למגוון רחב של יישומים.

s.jpg "/>
איור 2. תצלומי נתיחה. עוברים היו מוכתמים בסולפט הנילוס הכחול לניגוד גדל. AE: 24 שלב. FJ: שלב 35. קיצורים:. Ov, שלפוחית ​​אופטית; fb, המוח הקדמי; sc, חוט שדרה: אני, מזודרם, ולכן, somites; le, עדשה; אייקו, בלוטת מלט; מחדש, רשתית עין, EP, האפיתל לחצו כאן לקבלת דמות גדולה.

איור 3
איור 3. תמונות של תרבות תא עם Rois הקיפו. א שדה מואר. תמונה ב 'בעקבות Fluo-4 טיפול (בבוקר) עם Rois הקיפה. תמונת דגי ג (חצים מציינים דוגמאות של תאים חיוביים למקטע אלפא של תעלות סידן המגודרת מתח CaV2.1). ד 'כיסוי של שדה בהיר, Fluo-4, ותמונות דגים.

7/4377fig4.jpg "alt =" איור 4 "fo: תוכן רוחב =" 3.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg "/>
איור 4. דוגמה לפעילות הסידן לתא בודד (ROI). מגרש של הקרינה (ביחידות קרינה יחסיות, rfu) לעומת הזמן (בדקות) מתמונת פלואורסצנטי סיד Fluo4.

איור 5
איור 5. תוצאות הצגת spiking הסידן השלב ובדיקה. א מספר הממוצע של קוצי הסידן בשלבים 30 (n = 4), 35 (n = 8), ו38 (n = 13). מספר הממוצע של קוצי B. סידן לתרבות בין בדיקות שונות המשמשות לכלאה באתר בשלב 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), וPtf1a (n = 4). עלילת ג מצטבר הפצה של המספר הממוצע של קוצים לתרבות ליום 30 בשלבים, 35, 38. ד מצטבר distributiבעלילה של המספר הממוצע של קוצים לתרבות לתאים זוהו כבעל איתות חיובית לבדיקות בהכלאה באתר, בשלב 35;. xVglut1, xGAD67, וPtf1a לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.

בדיקה שלב n (צלחות) n (תאים) אחוזים חיוביים
xGAD67 35 4 1042 2%
38 4 690 2%
Ptf1a 30 3 352 1%
35 6 1856 1%
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2%
38 3 364 4%

לוח 1. תאים חיוביים אחוזים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עם סוגי תאים המאופיינים היטב הנשמרים לאורך כל החוליות, הרשתית מספקת מודל שימושי לחקר התהליכים מולקולריים התאיים המסדירים מפרט ובידול סוג תא. תרבית תאים ראשונית מקנה שיטה רבה עצמה לחקר מגוון רחב של תהליכים, כולל ביטוי גנים, דינמיקת חלבון וסידן ופעילות חשמלית ברמת רזולוצית תא בודדה. כאן אנו מציגים טכניקה פשוטה לתרבית תאים ראשונית מרקמת רשתית משוערת גזורה בXenopus laevis, האורגניזם במיוחד נוח ללימודים כאלה בהתחשב בכך שהרשתית המשוערת היא נגישה מהשלבים מאוד המוקדמים של פיתוח ושתרבית התאים הראשונית יכול להתרחש ב תקשורת מוגדרת בהיקף של תמיסת מלח פשוטה.

למרות להתאמה בקלות לרוב הגדרות מעבדה, ישנם מספר צעדים שדורשים תשומת לב קרובה במיוחד. Dissectiתוספות צריכות להתבצע עם מלקחיים חודדו זה עתה. שלבים צעירים (<st. 30) תועלת מטיפול עם collagenase B מעורבב עם מדיום תרבות התא. כל הצעדים של העברת רקמה או תאים מ1 מדיה אחרת חייבים להתבצע בזהירות מיוחדת כדי למנוע רקמות או תאים מלהגיע לקרבתו של ממשק אוויר הפתרון. פיפטה המכילה רקמה צריכה להיות טבלה באופן מלא בשפע של נוזלים והתאים או הרקמות גורשו לאט מאוד. לאחר שהתאים היו מצופים, כל העברות הנוזלים כוללים, בנוסף Fluo4-AM, ובינוני תא תרבות, או שטיפות קיבעון, חייבות להתבצע בזהירות בהתחשב בעובדה שתאים, אפשר לדחות בקלות. כמו בכל תרבות התאים, עקרות חשש, כך יש להקפיד לחטא את כל החומרים. לבסוף, מניח את explants הרשתית ניתק לשבת במשך פרק הזמן שיקבע במדיום דיסוציאציה הוא קריטי עבור קובץ מצורף תא מוצלח ולהימנע מיצירת גושים.

במהלךמצב הנתיחה והתרבות המתוארת בפרוטוקול זה, שניהם נימק ואפופטוזיס הם מצומצם ביותר (פחות מ 5-10% מהתאים). אובדן של תאים בצלחת (אפופטוזיס) הוא שם לב רק לעתים נדירות במהלך פגישות הדמית confocal לפני ואחרי. טיפול בתרביות תאים בזהירות הוא מפתח לכדאיויות תא. שינויי פתרון חייבים להתבצע באיטיות ובהתמדה כדי למנוע נימק תא ואפופטוזיס. בעוד ניסויים להתוות את היחס המדויק של סוגי תאי רשתית הם מתמשכים כרגע, אנחנו עושים את הלב שמגוון של סוגי תאי רשתית מופיע להיות מיוצג בתרבויות וכי תאי גלייה מולר (שיש מורפולוגיה מובחנת) הם לא דומיננטיים בתרבויות .

בעיה פוטנציאלית בעת ניתוח לאחר צלחות בניסויי הכלאה באתר היא שחלק מגוף אדם התאים שעבר, אבל זה ניתן לטיפול עם השימוש בתוכנות מעקב סלולרי. כמו כן, טמון בטכניקה של תרבית תאים ראשונית, מגבלה עיקרית היא הדואר הפסד ברור של דפוסים מרחבית שקיים ברקמה השלמה. הזהות של תאים בודדים יש לקבוע באמצעות מבחנים מולקולריים ולא על ידי עמדה ברקמות. עם זאת, תכונה זו גם מספקת את ההזדמנות לנתח את המצב של מפרט של תאים בדיוק רבים ובהיעדר של אינטראקציות מתמשכות תא סלולרי. זה גם מאפשר לחוקר לטיפול סלקטיבי את התאים עם גורמי גדילה או תרכובות אחרות ודווקא לנתח את ההשפעות ללא השפעה של אותות מתאים שכנים. אמנם יש לנו מועסקים נתיחה זו רשתית וטכניקת תרבית תאים עיקרית לcorrelating הדמית סידן עם מוליך עצבי ספציפיים סמני פנוטיפ, טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של יישומים במורד זרם אחרים כולל הקלטות אלקטרו מבחני ביטוי גני תא בודדים באמצעות RT-PCR או "בא "הניתוח של הדור transcriptome (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו מודים אדיבות ד"ר ג'ון הייס לתסריטים; בני זוג. אריק בראדלי וכריסטופר דל ניגר לקבלת סיוע במיקרוסקופיה confocal; דר יוז, לורה Odorizzi, אלכס Garafalo, רבקה Lowden, וליז MacMurray עבור עבודתם בפיתוח פרויקט ומתן נתונים ראשוניים; ד"ר גרג סמית להצעות מועילות על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (NINDS IR15N5067566-01) לMSS והווארד יוז הרפואי במכון לחינוך מדעי גרנט למכללת ויליאם ומרי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.

Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110 (2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940 (2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11 (2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics