Dissection, Kultur und Analyse der * These authors contributed equally

Neuroscience

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Summary

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

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McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. K. L. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

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Abstract

Der Prozess, durch den vorderen Bereich des Neuralplatte ergibt sich die Retina von Wirbeltieren weiterhin ein wichtiger Schwerpunkt der klinischen und der Grundlagenforschung sein. Neben der offensichtlichen medizinischen Relevanz für das Verständnis und die Behandlung von Netzhauterkrankungen, weiterhin die Entwicklung der Retina von Wirbeltieren als ein wichtiges und elegantes Modell für das Verständnis neuronaler Zelltyp Bestimmung und Unterscheidung 1-16 dienen. Das neurale Retina besteht aus sechs diskrete Zelltypen (Ganglion amakrinen, horizontal, Fotorezeptoren, bipolaren Zellen, und Müller Gliazellen) in stereotypen Schichten angeordnet sind, ein Muster, das weitgehend unter allen Vertebraten 12,14-18 konserviert ist.

Während des Studiums der Netzhaut im intakten entwickelnden Embryo ist eindeutig für das Verständnis erforderlich, wie dieses komplexe Organ von einem Vorsprung des Vorderhirns in eine geschichtete Struktur entwickelt, gibt es viele Fragen, die fro profitierenm Einsatz Ansätze unter Verwendung von primären Zellkulturen von mutmaßlichem Netzhautzellen 7,19-23. Beispielsweise Analysieren von Zellen aus Geweben entfernt und dissoziiert in verschiedenen Phasen ermöglicht es, den Stand der Spezifikation der einzelnen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden, das heißt, das Schicksal der Zellen in Abwesenheit von Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben 8,19-22 ,24-33. Primäre Zellkultur ermöglicht auch die Ermittler, die Kultur mit spezifischen Reagenzien zu behandeln und analysieren die Ergebnisse auf einer einzigen Zellebene 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, ein klassisches Modellsystem für die Untersuchung von frühen neuralen Entwicklung 19,27,29,31-32,40-42, dient als ein besonders geeignetes System zur Netzhaut primäre Zellkultur 10,38,43-45.

Mutmaßlich Netzhautgewebe ist von den frühesten Stadien der Entwicklung, unmittelbar nach neuralen Induktion 25,38,43. Darüber hinaus, th gegebenbei dem jede Zelle im Embryo eines Vorrats von Eigelb enthält, retinaler Zellen in einem sehr einfachen definierten Medien, bestehend aus einer gepufferten Salzlösung kultiviert werden, wodurch das Entfernen der Wirkung von Störfaktoren Inkubation Seren oder anderen Produkten auf 10,24,44-45 .

Allerdings ist die Isolierung des Retinagewebe vom umgebenden Gewebe und der nachfolgenden Verarbeitung schwierig. Hier stellen wir ein Verfahren zur Präparation und Dissoziation von Retinazellen in Xenopus laevis, die zum primären Zellkulturen, die wiederum für Calcium Aktivität und Genexpression bei der Auflösung von einzelnen Zellen analysiert werden vorbereitet wird. Während das Thema in diesem Papier ist die Analyse der spontanen Kalzium Transienten ist die Technik breit anwendbar auf ein breites Spektrum von Fragestellungen und Ansätze (Abbildung 1).

Protocol

Alle Versuche werden folgende Protokolle durch die Institutional Animal Care und Use Committee am College of William and Mary genehmigte durchgeführt. Entwicklungsstadien in diesem Protokoll verwiesen werden nach Nieuwkoop and Faber 46.

Ein. Präparation

  1. Lassen Sie das Zellkulturmedium und Calcium Magnesium Kostenlose Medium (CMF) auf Raumtemperatur äquilibrieren. Sie müssen auch 0,1 er Marcs modifizierte Ringer-(MMR) pH 7,4-7,6.
  2. Sterilisieren die folgenden Elemente durch Aufbringen eines UV-Licht für 30 min in einer Zellkultur Sterilbank. (Spray jedes Element mit 70% Ethanol, bevor sie in der Motorhaube.)
    • 35 mm Kunststoff-Petrischalen.
    • 60 mm Kunststoff-Petrischalen.
    • 35 mm Nunclon Oberfläche Gerichte.
    • 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    • p1000 Mikropipette (1.000 ul Mikropipette).
    • Aerosol beständig p1000 Tipps (1.000 ul Mikropipette Aerosol beständig Tipps).
    • Alkoholresistenten Stift.
    • Feine Pinzette.
    • * 15 ml konischen Röhrchen (nur für die Bildgebung Calcium-Aktivität).
    • * Nur für die Bildgebung von Kalzium Aktivität.
  3. Sobald die Haube UV sterilisiert worden und Lösungen auf Raumtemperatur gebracht, auf dem laminaren Luftstrom wiederum in der Motorhaube, abspritzen Handschuhe und Medien-Flaschen mit 70% Ethanol und Ort media Flaschen in der Haube.
  4. Im Inneren der Haube bereiten Sie die folgenden mit einem p1000 Mikropipette für jede Platte von Zellen, eine angemessene Etikettierung.
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale mit 10 ml Zellkulturmedium - Dissection Plate.
    • Ein 35 mm Nunclon Oberfläche Schale mit 2 ml Zellkulturmedium - Kultur Plate. (Nunclon Plastikschalen nicht weiter mit irgendwelchen Klebstoffen behandelt.)
    • Eine leere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen-Explantation Dissoziation Tube.
    • * Ein 15 ml konischen FalkenRöhrchen, enthaltend 15 ml Zellkulturmedium. Zum Waschen überschüssiges Fluo4-AM bei der Bildgebung Calcium Aktivität.
  5. Im Inneren der Kapuze, bereiten Sie die folgenden mit einem p1000 Mikropipette für jeden Dissektion Sitzung (mehr als ein Netzhaut kann in einer Sitzung seziert werden).
    • Ein 35 mm Kunststoff-Petrischale mit 2 ml CMF - Explantation spülen Plate.
    • Ein 35 mm Kunststoff-Petrischale mit 2 ml CMF - Explantation Dissoziation Plate.
  6. Außerhalb der Haube bereiten Sie die folgenden:
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale pro Platte von Zellen mit 10 ml 0,1 x MMR - Holding Plate.
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale pro Platte von Zellen mit 10 ml 0,1 x MMR - Sibling Plate.
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale pro Dissektion Sitzung, die 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (Tricain) - anesthetization Plate.
  7. Explantation Dissoziation Plate (was in einer 0,1% Trypsin-Lösung), Schwenken vermischen und beiseite stellen.
  8. Wenn Sezieren eines Embryos, die jünger als Stufe 30 ist, fügen Sie 10 mg Collagenase B der Dissection Plate (was in einer 1 mg / ml Collagenase B-Lösung), wirbeln zu lösen und beiseite stellen.
  9. Wählen Sie einen Embryo des gewünschten Zeitpunkt an der Halteplatte mit einem nicht-sterile Pipette übertragen, und entfernen Sie die Dotterhaut (wenn der Embryo noch nicht schraffiert) mit feinen Pinzette.
  10. Übertragen mehrere identisch inszeniert Embryonen in die Geschwister-Platte mit einem nicht-sterile Pipette.
  11. Wenn der Embryo-Stufe 25 oder früher, direkt weiter mit Dissektion, anderweitig die Embryos zur Anästhesierung Platte mit einer nicht-sterilen Pipette und erlauben der Embryo zu sitzen, bis Bewegung und der Reaktion auf Reize aufhört. Dies könntebis zu einer Minute.
  12. Fahren Sie mit Dissektion (Abbildung 2) unter einem Binokular (4X Ziel, 10x Okular).

Bei Embryonen Stufe 25 oder jünger:

  1. Übertragen Embryo in die Dissektion Platte mit einer nicht-sterilen Pipette.
  2. Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, einen sagittalen Schnitt auf der Bauchseite des Embryos, die am hinteren Ende und weiter durch den Zement Drüse im anterioren Abschnitt des Embryos.
  3. Öffnen Sie vorsichtig den Embryo durch Greifen entweder Rande des Schnittes und die Verbreitung links und rechts. Dies resultiert in einem Embryo mit der dorsalen zugewandten Seite in die Dissektion Platte, und mit der ventralen Ektoderm aufgespreizt die Endoderm und Mesoderm innerhalb offenbaren.
  4. Beginnen Sie das Entfernen der Endoderm und Mesoderm (2A und 2B). Der erste und größte Schicht dieser Gewebe ist sehr "fluffy" in Erscheinung mitgroßen Zellen und wenig offensichtlich Organisation.
  5. Nach dem Entfernen dieser Schicht wird die Somiten und Chorda sichtbar. Für einen besseren Kontrast, bewegen Sie den Embryo zu einem separaten 60 mm Kunststoff-Petrischale mit 10 ml Zellkulturmedium und 100 ul 1% ige Lösung von Nile Blue Sulfate (in Wasser) für 2-3 min, bevor sie wieder an die Dissection Plate. Dies färbt das Ektoderm, Somiten und Chorda zur leichteren Identifikation und Orientierung.
  6. Die Fokussierung auf den vorderen Teil des Embryos, entfernen Sie vorsichtig die Chorda und alle verbleibenden Mesoderm Aussetzen des Gehirns und Augenblasen (Abbildung 2C).
  7. Sobald das Gehirn und Augenblasen vollständig ausgesetzt sind, verwenden Sie die Zange, um das Neuralrohr und die zugrunde liegenden Ektoderm unmittelbar hinter dem Gehirn zu trennen.
  8. Drehen Sie diesen Teil (das Gehirn und Augenblasen) über, so dass die Ektoderm oben ist.
  9. Dabei nicht um die zugrunde liegenden Augenblasen beschädigen, vorsichtig wiederbewegen Sie den Ektoderm (Abb. 2D).
  10. Schließlich, unter Verwendung einer Pinzette, trennen die Augenblasen vom Gehirn (2D und 2E).

Bei Embryonen älter als Stufe 25:

  1. Während der Embryo in der Betäubung Plate, entfernen Sie das ventrale Teil des Embryos mit einer Pinzette.
  2. Für einen besseren Kontrast, bewegen Sie den Embryo zu einem 60 mm Kunststoff-Petrischale mit 10 ml 0,1 x MMR und 100 ul von 1% Nile Blue Sulfate für 2-3 min vor der Übertragung an den Dissection Plate. Dies färbt das Ektoderm blau.
  3. Einmal in der Dissection Plate, ziehen Sie den Ektoderm über der Netzhaut (oder Augenblase für die Embryonen Bühne 26-30) (Abbildung 2F und 2G). Wenn Nilblau Sulfat eingesetzt wurde, wird die Ektoderm angefärbt werden, aber die darunter liegenden Netzhautgewebe nicht.
  4. Entfernen Sie die Netzhaut oder Augenblase vorsichtig mit forceps (2H, 2I, und 2J). Es ist hilfreich, um den Embryo in Position zu halten mit einer Pinzette und entfernen Sie die Netzhaut oder Augenblase mit dem anderen.

2. Dissoziation von Tissue und Oberflächen von Zellen

Wichtiger Hinweis - Bei der Übertragung von Gewebe, darf die Netzhaut oder Augenblase, um alle Luft-Flüssigkeit-Grenzen berühren, wenn dies der Fall ist, werden die Zellen zu lysieren.

  1. Sobald die Augenblase oder Netzhaut seziert hat, sorgfältig auf die Explantation zu übertragen spülen Platte mit einem p100 Mikropipette mit Aerosol beständig Tipps und lassen für 30 Sekunden sitzen.
  2. Übertragen 80 ul 0,1% Trypsin in CMF aus dem Explantat Dissoziation Platte zur Explantation Dissoziation Tube.
  3. Mit einem p100 Mikropipette und Aerosol-resistente Tipps, übertragen die Netzhaut oder Augenblase aus dem Explantat spülen Platte zur Explantation Dissociatimit Tube, Vermeidung einer Übertragung von den Explantaten Spüllösung.
  4. Erlauben das Gewebe in der Explantation Dissoziation Tube für 1 Stunde bei Raumtemperatur dissoziieren. Einer Retina pro Platte verwendet wurde jedoch bemerken wir, dass es möglich ist, mehr als einen pro Platte zu verwenden, wenn dies gewünscht wird, die Anzahl der Zellen pro Platte zu erhöhen.
  5. Auf die Platte, die Zellen, erst langsam zu entfernen 40 ul der Lösung aus dem Explantat Dissoziation Tube und entsorgen mit einem p100 Mikropipette und Aerosol-resistenten Spitzen. Mit einem p100-Set bis 40 ul und Aerosol-resistente Tipps, übertragen die Zellen (jetzt, dass das Gewebe dissoziiert hat) auf die Kultur Plate. Zum Ansaugen der Zellen auf der Platte, langsam pipettieren und halten die Zellen in einem kleinen Bereich in der Mitte der Platte.

Anmerkung: Wenn mehrere Bilder der Zellen während des Experiments zu fassen sind, befestigen eines Gitters (Cellattice) an die Unterseite der Kulturplatte

  1. Damit die Zellen zu sitzen für mindestens 1 Stunde ungestört auf die Nunclon Platte haften. Nach dieser Zeit muss sie sehr schonend behandelt werden oder sie könnten sich ablösen.
  2. Kulturzellen um gewünschte Stufe durch Beobachtung der nebengeordneten Embryonen, die bei der gleichen Temperatur wie die Zellen gezüchtet werden. Wenn lebenden Zellen nicht zur weiteren Bearbeitung verwendet wird, können sie in MEMFA Lösung zu diesem Zeitpunkt festgesetzt.

Wichtiger Hinweis: Die meisten unserer Experimente sind innerhalb von 6 h Ausplattieren der Zellen fixiert. Die Langlebigkeit der Zellen in Kultur ist abhängig von dem Stadium, in dem das Gewebe wurde seziert und der Menge an noch vorhandenen Dotter in den Zellen; Zellen aus J. (Neurula Stufen) seziert gesund bleiben in Kultur für 5-6 Tage, während Zellen von erworbenen älteren Embryonen (Schwimmen tadpoleStufen) bleiben in der Kultur lebensfähig für 2-3 Tage.

3. Calcium Imaging 47-49

Dieses Protokoll nutzt Calcium-sensitiven Fluo4-AM und konfokale Mikroskopie, Kalzium Transienten in einzelnen Zellen zu quantifizieren. Alle Schritte mit Fluo4-AM sollte weg vom Licht durchgeführt werden, wie Fluo4-AM ist lichtempfindlich. Alle Wäschen sollte hinzugefügt oder entfernt werden mit einem p1000 Mikropipette und Aerosol-resistenten Spitzen. Pipettiervorgänge langsam und in Richtung der Kante der Platte zu verhindern, daß die Zellen erfolgen. Die Medien werden nicht geändert, weil die Kulturen in der Regel innerhalb von 6 h wird seziert befestigt sind. Für längerfristige Kulturen, sollten die Medien täglich gewechselt werden.

  1. Fluo4-AM wird bei -20 ° C gelagert, und wir empfehlen in 5 ul Aliquots lagern. Vor der Verwendung auftauen eine 5 ul Aliquot Fluo4-AM weg vom Licht und fügen 2 ul Pluronic F-127 direkt zu diesem Aliquot.
  2. Nach dem Kultivieren der Zellen für die gewünschte Menge an Zeit (mindestens1 Std.), entfernen 1 ml des Zellkulturmediums von der Kulturplatte. Fügen Sie diese auf der Fluo4-AM und Pluronic, Mischen durch vorsichtiges Pipettieren.
  3. Langsam übertragen alle dieser Lösung zurück zu dem Rand der Platte Kultur der Zellen abzubildenden und verlassen die Zellen in dieser Lösung für 1 Stunde ungestört die Fluo4-AM absorbieren.
  4. Zum Auswaschen überschüssigen Fluo4-Uhr aus dem Zellkulturmedium, füllen Sie das folgende wash Serie:
    • Entfernen 1 ml Medium von der Platte.
    • 3 ml frisches Zellkulturmedium (aus den 15 ml konischen Röhrchen) an der Platte.
    • Führen zwei zusätzliche Wäschen jeweils langsam Entfernen von 3 ml Lösung von der Platte und Zugabe von 3 ml frisches Zellkulturmedien.
  5. Die Zellen sollten nun in 4 ml Zellkulturmedium sein und darf Fluo4-AM. Fluo4-AM wird enzymatisch einmal innerhalb der Zelle abgespalten wird, verhindern, dass es Diffundieren aus der Zelle oder in jede membrangebundene Kompartimente. Vor dem Laden der Platte auf die Stufe des konfokalen Mikroskops zum Abbilden Ziehung einer vertikalen roten Linie mit permanenten Markierung auf der Schale, während Deckel auf Markerpartikel verunreinigen die Kultur zu verhindern. Die vertikale Linie ist an der Seite der Petrischale (die Basis der Petrischale, nicht der Deckel) erstellt. Sein Zweck ist es, die Orientierung der Kulturplatte gegenüber dem Sichtfeld angeben, so daß die genaue Orientierung und Ausrichtung der einzelnen Zellen kann zu einem späteren Zeitpunkt wieder aufgenommen werden.
  6. Die Platte ist nun bereit zum Laden auf der Bühne des konfokalen Mikroskops zum Abbilden. Visualisieren Sie die Zellen mit den Hellfeld-Einstellungen auf einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (Objektiv 20x). Finden einer Fläche von dichten Zellen nicht enthält Klumpen, vorzugsweise mit einem Sichtfeld, das die großen Raster Zahlen auf der Cellatice Deckplättchen, um das Auffinden der gleichen Sichtfelds später leichter bei der Abbildung enthält die Kultur nach der in situ-Hybridisierung. Vor der Bebilderung, konzentrieren unten durch die Kultur und einen Hellfeldbild des Gitters unter den Zellen, um den Ort und die Orientierung der Zellkultur aufzuzeichnen. Dies ermöglicht Neuausrichtung der Zellen für eine nachfolgende Analyse.
  7. Heben Sie die Brennebene und erfassen einen Hellfeldbild der Zellen vor Beginn Calcium Imaging (Abbildung 3A).
  8. Sobald der Mittelebene der Zellen im Fokus ist, ist die Platte bereit zum Abbilden von Calcium-Aktivität. Einstellungen variiert in Abhängigkeit von dem Mikroskop und der Anwendung. Wir Bild der Zellen unter Verwendung eines Argon-Laser 488 nm für 1, 2 oder 12 h mit den folgenden Parametern:
    • 1 hr Bilder:
      • Argon 488 nm Laser tastet bei 4% der maximal 30 mW Leistung.
      • Einmal scannen alle 4 Sek. (900 Scans pro Stunde).
    • 2 Stunden Bilder:
      • Argon 488 nm Laser tastet bei 4% der maximal 30 mW Leistung.
      • Einmal scannen jeden8 sec (450 Scans pro Stunde).
    • 12-Stunden-Bilder:
      • Argon 488 nm Laser tastet bei 2% der maximal 30 mW Leistung.
      • Einmal scannen alle 48 sec (75 Scans pro Stunde).

Diese Parameter werden in einer Menge von 900 Standbild Bilder für jeden Zeitrahmen führen. Calcium-Aktivität kann dann durch Analyse Fluoreszenzwerte in den Zeitverlauf Bilder (3B) mit der Verwendung von einer Bildverarbeitungs-Anwendung wie ImageJ 50 aufgezeichnet werden.

4. Fixierung von Zellen

  1. Nach Bildgebung können die Zellen für 30 min mit dem Entfernen von 3 ml Lösung von der Platte und Zugabe von 1 ml 2X MEMFA dem restlichen 1 ml Kulturmedium fixiert werden.
  2. Nach der Fixierung und Entfernen MEMFA dehydratisieren Zellen mit einer Reihe von 5 Wäschen min, jeweils ein Volumen von 1 ml:
    • 25% Ethanol in 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
    • 50% Ethanol in 1X PBS.
    • <li> 75% Ethanol in H 2 O sdd (steriles entionisiertes destilliertes Wasser).
    • Ersetzen Sie die letzte Waschung mit 1 ml 100% Ethanol und speichern Platte bei -20 ° C.

Hinweis: Methanol kann auch für diese wäscht und für die Lagerung verwendet werden.

5. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Kulturen können unter Verwendung der Standard-FISH-Protokoll für Xenopus wie beschrieben 51 mit Modifikationen für die Zellkultur durch das Anderson Lab 52 skizziert. Modifikationen an der Anderson Lab-Protokoll sind unten aufgeführt. Alle Wäschen sind auf den 35 mm Nunclon Platten in einem Volumen von ca. 1 ml durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Lösungen werden wie in Sive et al. 53, sofern nicht anders vermerkt.

Wichtiger Hinweis: Verwenden Sie keine Fluorescein-markierten RNA-Sonden bei der Durchführung von in situ Hybridisierung auf Zellen abgebildet fürCalcium Aktivität. Anti-Fluorescein Antikörper werden, um restliche Fluo4-AM in die Zellen und können positive Signal in allen Zellen in der Kultur verursachen binden.

Tag 1: Permeabilisierung und Hybridisierung

  1. Rehydration Wäschen sollte die Dehydratisierung Lösungsmittel für die Speicherung verwendet benotet. Für unsere Experimente wurden Wäschen zu Ethanol in 1X PBS benotet.
  2. Nach Rehydrierung Waschen Sie die Zellen drei weitere Male in 1X PBS für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. 25 ml von 0,1 M Triethanolamin (pH 8,0) mit 62,5 ul Essigsäureanhydrid in einem Falcon-Röhrchen und schnell mischen, bis gründlich verteilt wie bereits in der Anderson Lab 52 Protokoll. Inkubieren Kulturen in dieser Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Essigsäureanhydrid Behandlung, Waschen Zellen in 1X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie die letzte SSC waschen und ersetzen mit 0,2 M HCl (in sdd H 2 O) für 10 min, um Zellen permeabilisiert. </ Li>
  5. Auswaschen HCl mit zwei Waschungen in 1X PBS für 5 min.
  6. Prehybridize in ISH-Puffer bei 60 ° C in einem Schüttelwasserbad für mindestens 6 Stunden, aber nicht prehybridize Nacht, da dies stark verringert Signal.
  7. Hybridisierung über Nacht bei 60 ° C für 8-14 h in 750 ul verdünnte Probe (1:250 Verdünnung einer gereinigte Sonde). Das gereinigte Sonde Konzentrationsbereichen von 1,0 bis 1,5 ug / ul.

Tag 2: Entfernung der ungebundenen Sonde und Antikörper Inkubation

  1. Nehmen Sie die Sonde und spülen Kulturen für 5 min in 0,2 x SSC bei 60 ° C. Waschen in frischem 0.2X SSC für 1 Stunde bei 60 ° C.
  2. Entfernen Kulturen aus dem Wasserbad und ihnen zu erlauben auf Raumtemperatur für 5 min einzustellen.
  3. Spülen in 0,2 × SSC bei Raumtemperatur für 5 min.
  4. Waschen für 15 Minuten in 1X PBS mit 0,1% Triton-X-100 (PBT).
  5. Um endogene Peroxidasen inaktiviert, für 1 Stunde in einer 2% H 2 O 2-Lösung in PBT gewaschen.
  6. Blockieren in 2% Blocking Reagenz in Maleinsäure-Puffer (MAB) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wir haben festgestellt, dass diese blockierende Methode Empfindlichkeit erhöht im Vergleich zu bisherigen Methoden der Blockade in 20% Schafserum in PBT.
  7. Inkubieren Kulturen in 1 ml 2% Blocking Reagenz in MAB enthaltend eine 1:1000 Verdünnung eines POD-konjugierten Antikörper über Nacht bei 4 ° C.

Tag 3: Entfernen des ungebundenen Antikörper und Fluoreszenz Entwicklung

  1. Entfernen Antikörperlösung und spülen 3 mal in TBST für 5 min bei Raumtemperatur.
  2. 4 mal Waschen mit TBST für 15 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln bei einer geringen Geschwindigkeit.
  3. Zweimal waschen in PBT bei Raumtemperatur für 10 min.
  4. Übernehmen 750 ul von 1:200 Fluorescein-Tyramid oder 1:25 Cy3 Tyramid in PBT verdünnt. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur und fügen 2,5 ul 0,3% H 2 2. Rock für 40 min zu ermöglichen Signals zu entwickeln.
  5. Waschen Sie mindestens 4 Mal für je 15 min in TBST bei Raumtemperatur unter Schütteln.
  6. Sobald Signal vollständig entwickelt hat, für 5 min in 1X PBT waschen.
  7. Fix in 1X MEMFA für 1 Stunde bei Raumtemperatur und Shop in 1X PBS bei 4 ° C.

6. Bild FISH Ergebnisse und Co-Register Calcium Imaging Daten

  1. Bei Abschluss FISH werden Zellkulturplatten abgebildet zu bestimmen, welche Zellen zeigen eine positive Fluoreszenzsignal für eine gegebene Sonde. Verwenden des Deckplättchens Cellattice um die genaue Sichtfeld während Calcium Imaging untersucht finden und Ausrichten der Platte an der Orientierung der Calcium Bildframes.
  2. Konzentrieren Sie sich auf die Mittelebene der Zellen und nehmen Sie ein einzelnes hochauflösendes Bild mit dem Helium-Neon HeNe 543 nm Laser bei 15% der maximal 1 mW Leistung (3C).
  3. In der ursprünglichen 900-Rahmen von Bildern aus dem Calcium Imaging-Protokoll übernommen gesetzt,Identifizierung einzelner Zellen als Regions of Interest (ROI) durch die Verwendung von einem Bildverarbeitungsprogramm (wie ImageJ 50). Extrahieren ROI Fluoreszenz Daten als ein Satz von Datenpunkten repräsentiert Time-Fluoreszenz Paars Werte (Abbildung 4).
  4. Überlagern die FISH-Ergebnisse Bildes mit der identifizierten ROIs aus den Calcium-Bilder (Abbildung 3D).
  5. Registrieren jedes ROI als positiv für die Sonde, negativ für die Sonde oder unbekannt - im Fall, dass die Zelle, die dem ROI nicht mehr innerhalb des Sichtfeldes des FISH Bild gefunden werden.
  6. Verfahren ROI Fluoreszenzdaten anhand einer statistischen Analyse der Script (wie durch MATLAB oder anderen Programmiersprache bezeichnet), die Calcium-Aktivität zwischen verschiedenen Ebenen seziert Stufen (5A und 5C) oder Zellen positiv für unterschiedliche FISH-Sonden (5B und 5D) zu vergleichen. Alle Skripte in unserem Labor verwendet werden, sind frei verfügbar auf Anfrage.

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Representative Results

Beispiele von erfolgreich seziert Augenblasen (Stadium 25) und retinae (Stufe 35) sind in den Figuren 2E und 2J gezeigt. Während dieses Protokoll in verschiedenen Stadien der Entwicklung verwendet werden kann, ist es entscheidend, um nur Retinagewebe zu erhalten, um die Genauigkeit für weitere Experimente gewährleisten. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis in allen Phasen und sicherzustellen, dass Ihre Pinzette nicht Punktion der Netzhautgewebe. In der Stufe 35 oder älter, kann die Linse als klare Schicht oben auf der Netzhaut zu sehen und kann durch vorsichtiges Abschaben unter Verwendung einer Pinzette entfernt werden.

Eine erfolgreich plattierten primären Zellkultur wird in 3A gezeigt. Wenn Dissoziieren Gewebe, ist es wichtig, nicht die retinalen Explantat in der Spüllösung zu verlassen länger als die empfohlenen 30 sec Inkubationszeit auf das Gewebe vor Dissoziieren in der Spüllösung zu verhindern. Außerdem sicher, dass das Gewebe erlaubt ist, in der Trypsin-Lösung für eine volle Stunde distanzieren(Ältere embryonalen und Larvenstadien kann sogar mehr benötigen), um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Kultur Platte ermöglichen. Sobald die Zellen überzogen sind, Vorsicht walten lassen, wenn Sie den Teller und wechselnden Lösungen zur Vermeidung Waschen der Zellen von der Platte.

Figuren 3B und 3C zeigen, Bilder von Calciumaktivität Abtastung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsexperimente (FISH) sind. Zellen, die leuchtend grün erscheinen in der Calcium-Bild sind Zellen, die sich in einem transienten Anstieg der intrazellulären Calcium-Spiegel werden als Folge der Freisetzung der internen Kalziumspeichern. Zellen können dann für die Genexpression unter Verwendung von FISH untersucht werden, und Genexpressionsmuster können, um Muster von Calcium Spiking-Aktivität durch Übereinanderlegen der Bilder (3D) korreliert werden. Mit einer Kombination aus Python und MATLAB Script (frei verfügbar auf Anfrage), werden die Daten durch die Analyse der Fluoreszenz-Aktivität jedes einzeln erhältlichal Region of Interest (ROI) durch den Verlauf der Bildgebung. Ein Beispiel für die Calcium-Aktivität für eine einzelne Zelle (ROI) über 1 h Bildgebung ist in Abbildung 4 gezeigt; eine Spitze bei etwa 57 min von bildgebenden sichtbar. In Tabelle 1, repräsentative Daten für den Prozentsatz der Zellen positiv für verschiedene Sonden dargestellt sind, während es keine Daten für dieses Experiment in der Literatur berichtet (der Punkt, in unserem aktuellen Experimenten ist es, diese Prozentsätze zu bestimmen), sind unsere Befunde, die mit Daten aus ähnlichen Arten von Experimenten zur Calcium-Aktivität im Rückenmark 17,55,56.

Parameter für die Analyse verwendet werden, umfassen die Anzahl, Frequenz und Amplitude der Spikes. Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse von Calcium Bildgebung und FISH-Experimente in embryonale Retinazellen Verwendung von Sonden für xVglut1, Ptf1a und xGAD67. Mit MATLAB Script, die Anzahl der Spikes für each ROI bestimmt wird und die Anzahl der Spitzen wird für alle ROIs in dem Experiment gemittelt. Die durchschnittliche Anzahl der Spitzen von jedem Experiment kann dann mit anderen Experimenten zusammengestellt werden, was zu dem Durchschnitt einer Gruppe von Experimenten. Summenverteilung Plots erstellt werden, um die Verteilung der durchschnittlichen Anzahl von Spikes für alle Versuche in der Gruppe angezeigt werden. MATLAB Script werden dann für die statistische Analyse der Daten verwendet.

Abbildung 5 zeigt repräsentative Daten nach MATLAB Analyse. Kurz gesagt, zeigen unsere Ergebnisse, dass Kalzium Aktivität entwicklungspolitisch geregelt ist, mit Spiking Höchststand im Stadium 35 (p <0,002) (5A und 5C). In Bezug auf die Korrelation Calcium Tätigkeit mit Zellen positiv für eine spezifische Sonde, während es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede, aber es zeigte sich ein Trend (p = 0,08) für die Zellen positiv für xGAD67 (ein Marker für differenzierte GABAergen Zellen) highe angezeigt r Kalziumspiegel Spiking Aktivität als Zellen positiv für einen Marker oder für glutamatergen Ptf1a, einem Gen, das ein Gen mit Transkriptionsfaktor Förderung der GABAeric Phänotyp korreliert. Obwohl vorläufige legen diese Daten nahe, dass es möglicherweise GABAergen Zellen, die in einer Weise unabhängig von Ptf1a oder jener leistungsabhängige Neurotransmitter Spezifikation entwickeln handelt nicht auf der Ebene der Ptf1a sein.

Abbildung 1
Abbildung 1. Prozeduralen schematische. Sobald Netzhautgewebe wird seziert und dissoziiert, primäre Zellkultur kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden.

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Abbildung 2. Dissection Fotografien. Embryonen wurden in Nile Blue Sulfate für erhöhten Kontrast gefärbt. AE: Stage 24. FJ: Stage 35. Abkürzungen:. Ov, Augenblase; fb, Vorderhirn; sc, Rückenmark; mich, Mesoderm, so, Somiten; le, Linse; cg, Zement Verschraubung; re, Netzhaut; ep, Epithel Klicken Sie hier für eine größere Abbildung .

Abbildung 3
Abbildung 3. Bilder von Zellkultur mit ROIs eingekreist. A. Hellfeld. B. Bild nach Fluo-4 (AM) Behandlung mit ROIs eingekreist. C. FISH Bildes (Pfeile zeigen Beispiele von Zellen positiv für die alpha-Untereinheit des Calciumkanals spannungsgesteuerten CaV2.1). D. Überlagerung von Hellfeld, Fluo-4 und FISH Bilder.

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Abbildung 4. Beispiel Calcium-Aktivität für eine einzelne Zelle (ROI). Plot der Fluoreszenz (in relativen Fluoreszenz Einheiten, RFU) gegen die Zeit (in Minuten) aus einer Fluo4 Calcium Fluoreszenzbild.

Abbildung 5
Abbildung 5. Ergebnisse anzeigt Calcium spiking von der Bühne und Sonde. A. Durchschnittliche Anzahl von Calcium Spitzen an Stufen 30 (n = 4), 35 (n = 8), und 38 (n = 13). B. Anzahl der Spitzen pro Calcium Kultur unter verschiedenen Sonden verwendet für die in situ-Hybridisierung bei der Stufe 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), und Ptf1a (n = 4). C. Verteilungsfunktion Grundstück von der durchschnittlichen Anzahl von Spikes pro Kultur Stufen 30, 35, 38. D. Kumulierte erfassungstafelnauf einem Grundstück von der durchschnittlichen Anzahl von Spikes pro Kultur für Zellen mit positives Signal für die in-situ-Hybridisierung Sonden auf Stufe 35 identifiziert;. xVglut1, xGAD67 und Ptf1a Klicken Sie hier für eine größere Abbildung .

Sonde Bühne n (Platten) n (Zellen) Prozent Positiv
xGAD67 35 4 1042 2%
38 4 690 2%
Ptf1a 30 3 352 1%
35 6 1856 1%
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2%
38 3 364 4%

Tabelle 1. Prozent positive Zellen.

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Discussion

Mit seinen gut charakterisierten Zelltypen, die in allen Wirbeltieren konserviert sind, bietet die Netzhaut ein nützliches Modell für die Untersuchung der molekularen zellulären Prozesse, die die Zelltyp Spezifizierung und Differenzierung. Primäre Zellkultur bietet eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung einer Vielzahl von Prozessen einschließlich Genexpression, Protein Dynamik und Kalzium und elektrische Aktivität auf der Ebene der einzelnen Zelle Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Technik für die primäre Zellkultur aus seziert mutmaßlichen Netzhautgewebe in Xenopus laevis, ein besonders zugänglich Organismus für solche Studien gegeben, dass die mutmaßlichen Netzhaut leicht erreichbar von den frühesten Stadien der Entwicklung und dem primären Zellkultur ist, kann bei einer bestimmten definierten Medien, bestehend aus einem einfachen Salzlösung.

Obwohl leicht anpassbar an die meisten Labor-Einstellungen gibt es mehrere Schritte, die besonderer Aufmerksamkeit bedürfen. Dissections sollte mit frisch geschärften Pinzette durchgeführt werden. Jüngere Stufen (<st. 30) profitieren von einer Behandlung mit Collagenase B mit dem Cell Culture Medium gemischt. Alle Schritte, die zum Transfer von Gewebe oder Zellen von einem Medium zum anderen muß mit besonderer Sorgfalt ausgeführt werden, um das Gewebe oder Zellen kommen in die Nähe des Luft-Lösungs-Grenzfläche zu verhindern. Die Pipette, die das Gewebe sollten in reichlich Flüssigkeit eingetaucht werden und die Zellen oder Gewebe ausgestoßen sehr langsam. Nachdem die Zellen ausplattiert worden, alle Transfers von Fluiden, einschließlich, Fluo4-AM hinaus und Zellkulturmedium, oder Fixierung wäscht, müssen sorgfältig gegeben, daß Zellen leicht verdrängt werden durchgeführt werden. Wie bei allen Zellkultur ist Sterilität Anliegen, so ist darauf zu achten, um alle Materialien zu sterilisieren. Schließlich lassen die dissoziierten Netzhaut Explantate sitzen der vorgesehenen Frist bei der Dissoziation Medium ist entscheidend für eine erfolgreiche Zelladhäsion und zu vermeiden, zu verklumpen.

Währenddie Dissektion und Kulturbedingungen in diesem Protokoll beschrieben, sind beide Nekrose und Apoptose äußerst begrenzt (weniger als 5-10% der Zellen). Verlust von Zellen auf der Platte (Apoptose) wird nur selten während des Pre-und Post konfokale Abbildung Sessions bemerkt. Umgang mit Zellkulturen sorgfältig ist der Schlüssel, um die Zellviabilität. Lösung ändert muss sehr langsam und stetig durchgeführt werden, um Zellen Nekrose und Apoptose verhindern. Während Versuche, den genauen Verhältnis von retinalen Zelltypen abzugrenzen derzeit laufenden, wir beachten, dass eine Vielzahl von retinalen Zelltypen in den Kulturen und daß Muller Gliazellen (die einen deutlichen Morphologie haben) dargestellt werden erscheinen, sind nicht in den Kulturen dominanten .

Ein potenzielles Problem bei der Analyse Platten nach In-situ-Hybridisierungsexperimente ist, dass einige der Zellen bewegt werden kann, aber dies kann durch die Verwendung von Zell-Tracking-Programmen zu richten. Auch die sich aus der Technik der primären Zellkultur, ist eine große Einschränkung the offensichtlichen Verlust von räumlichen Mustern, die in der intakten Gewebe ist. Die Identität der Einzelzellen muss festgestellt mittels molekularer Assays und nicht durch Position in dem Gewebe werden. Allerdings wird diese Funktion auch die Möglichkeit, den Zustand der Spezifikation von Zellen sehr präzise und in Abwesenheit von anhaltenden Zell-Zell-Interaktionen zu analysieren. Es ermöglicht auch der Prüfer zum selektiven Behandlung der Zellen mit Wachstumsfaktoren oder anderen Verbindungen und genau zu analysieren, ohne die Auswirkungen des Einflusses der Signale von benachbarten Zellen. Während wir diese retinalen Dissektion und primäre Zellkultur-Technik zur Korrelation Calcium Imaging mit spezifischen Neurotransmitter Phänotyp Marker eingesetzt haben, ist diese Technik an eine breite Palette von anderen nachgelagerten Anwendungen wie elektrophysiologischen Aufnahmen und einzelne Zelle Genexpression-Assays mittels RT-PCR oder "next -gen "Transkriptom-Analyse (Abbildung 1).

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir huldvoll danken Dr. John Hayes für Skripte; Drs. Eric Bradley und Christopher Del Negro für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, und Liz MacMurray für ihre Arbeit bei der Entwicklung des Projekts und die Bereitstellung vorläufige Daten; Dr. Greg Smith für Anregungen auf einer statistischen Analyse. Diese Arbeit wurde durch ein NIH (NINDS IR15N5067566-01), um MSS und Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant zum College of William and Mary unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.

Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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