Disseksjon, kultur, og analyse av * These authors contributed equally

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Xenopus laevis gir en ideell modell system for å studere cellen skjebne spesifikasjon og fysiologiske funksjon av individuelle netthinnens celler i grunnskolen cellekultur. Her presenterer vi en teknikk for å dissekere retinal vev og generere primære cellekulturer som er avbildet for kalsium aktivitet og analysert ved in situ hybridisering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. K. L. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den prosessen som den fremre delen av nevrale plate gir opphav til virveldyr netthinnen fortsetter å være et stort fokus på både klinisk og grunnleggende forskning. I tillegg til de åpenbare medisinsk relevans for å forstå og behandle retinal sykdom, fortsetter utviklingen av virveldyr netthinnen å tjene som et viktig og elegant modellsystem for forståelse neuronal celletype bestemmelse og differensiering 1-16. Det nevrale netthinnen består av seks diskrete celletyper (ganglion, amacrine, horisontal, fotoreseptorer, bipolare celler, og Muller gliacellene) ordnet i stereotype lag, et mønster som er i stor grad bevart blant alle virveldyr 12,14-18.

Mens han studerte netthinnen i intakt utvikling av embryo er klart nødvendig for å forstå hvordan dette komplekse organ utvikler seg fra en utvekst av forebrain inn en lagdelt struktur, er det mange spørsmål som er til fordel from ansette tilnærminger med primær cellekultur av presumptive netthinnens celler 7,19-23. For eksempel, å analysere celler fra vev fjernet og dissosiert på forskjellige stadier tillater en å skjelne staten spesifikasjonen av individuelle celler på ulike utviklingsstadier, dvs. skjebnen av cellene i fravær av interaksjoner med nærliggende vev 8,19-22 ,24-33. Primære cellekulturer kan også etterforsker for å behandle kultur med spesifikke reagenser og analysere resultatene på en enkelt celle nivå 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, en klassisk modell system for studiet av tidlig nevral utvikling 19,27,29,31-32,40-42, fungerer som en spesielt egnet system for retinal primære cellekulturer 10,38,43-45.

Presumptive retinal vev er tilgjengelig fra de tidligste stadiene av utviklingen, umiddelbart etter nevrale induksjon 25,38,43. I tillegg gis thved hver celle i embryoet inneholder en tilførsel av eggeplomme, kan netthinnens celler dyrkes i en svært enkel definerte medier bestående av en bufret salt-løsning, og dermed fjerne forstyrrende effekter av inkubering eller andre sera-baserte produkter 10,24,44-45 .

Imidlertid er isolasjon av retinal vev fra omkringliggende vev og påfølgende behandling utfordrende. Her presenterer vi en fremgangsmåte for disseksjon og dissosiasjon av netthinnens celler i Xenopus laevis som skal anvendes for å fremstille primære cellekulturer som vil, i sin tur, blir analysert for kalsium aktivitet og genekspresjon på oppløsningen av enkeltceller. Mens temaet presenteres i denne artikkelen er analysen av spontane kalsium transienter, er teknikken bredt gjeldende for et bredt spekter av problemstillinger og tilnærminger (figur 1).

Protocol

Alle eksperimenter utføres etter protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved College of William and Mary. Utviklingsstadier refereres til i denne protokollen er i henhold til Nieuwkoop og Faber 46.

1. Disseksjon

  1. Tillat cellekulturmediet og kalsium magnesium fritt medium (CMF) å nå romtemperatur. Du vil også trenge 0.1X Marc Modified Ringer (MMR) pH 7.4 til 7.6.
  2. Steriliser følgende elementer ved å bruke en UV-lys i 30 minutter i en cellekultur laminær strømningshette. (Spray hvert element med 70% etanol før de legges i panseret.)
    • 35 mm plast petriskåler.
    • 60 mm plast petriskåler.
    • 35 mm Nunclon overflaten retter.
    • 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    • P1000 mikropipette (1000 ul mikropipette).
    • Aerosol resistente P1000 tips (1000 pl mikropipette aerosol resistente tips).
    • Alkoholmotstandsdyktig penn.
    • Fin dissekere tang.
    • * 15 ml koniske rør (kun for avbildning kalsium aktivitet).
    • * Bare for avbildning av kalsium aktivitet.
  3. Når hetten er UV sterilisert og løsninger har likevekt til romtemperatur, slå på laminær luftstrøm i panseret, spray ned hansker og media flasker med 70% etanol og sted medier flasker i panseret.
  4. Inne i hetten forberede følgende med en P1000 mikropipette for hver plate av celler, noe som sikrer hensiktsmessig merking.
    • Én 60 mm plast petriskål inneholdende 10 ml cellekulturmedium - Disseksjon Plate.
    • En 35 mm Nunclon overflate tallerken som inneholder 2 ml cellekulturmedium - Kultur Plate. (Nunclon plast retter ikke er videre behandlet med noen lim.)
    • En tom 1,5 ml mikrosentrifugerør-Eksplantasjon Dissosiasjon Tube.
    • * En 15 ml konisk falconrør som inneholder 15 ml cellekulturmedium. For vask ut overflødig Fluo4-AM når imaging kalsium aktivitet.
  5. Inne i panseret, forberede følgende med en P1000 mikropipette for hver disseksjon økten (mer enn én netthinnen kan dissekert i én økt).
    • En 35 mm plast petriskål inneholder 2 ml CMF - Eksplantasjon Skyll Plate.
    • En 35 mm plast petriskål inneholder 2 ml CMF - Eksplantasjon Dissosiasjon Plate.
  6. Utenfor hetten klar følgende:
    • En 60 mm plast petriskål per plate av celler som inneholder 10 ml 0.1X MMR - Holding Plate.
    • En 60 mm plast petriskål per plate av celler som inneholder 10 ml 0.1X MMR - Søsken Plate.
    • Én 60 mm plast petriskål pr disseksjon sesjon inneholdende 10 ml 0.1X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (Tricaine) - Anesthetization Plate.
  7. Eksplantasjon Dissosiasjon Plate (noe som resulterer i en 0,1% trypsin løsning), virvel for å blande, og sett til side.
  8. Hvis dissekerende et embryo som er yngre enn 30 stadium, tilsett 10 mg kollagenase B til Dissection Plate (som resulterer i en 1 mg / ml kollagenase B løsning), virvel å oppløse og settes til side.
  9. Velg en embryo av det ønskede stadium, overføre til holdeplaten med en ikke-steril overføringspipetten, og fjern vitelline membran (hvis embryoet har ennå klekket) ved hjelp av fine pinsetter.
  10. Overføre flere identisk iscenesatt embryoene søsken Plate med en ikke-steril overføringspipetten.
  11. Hvis på embryoet er stadium 25 eller tidligere, fortsett direkte med disseksjon, på annen måte overføre embryo til Anesthetization Plate med en ikke-steril overføringspipetten og la embryoet å sitte inntil bevegelse og respons på stimuli opphører. Dette kan taopp til et minutt.
  12. Fortsett med disseksjon (figur 2) under en dissekere omfang (4X mål, 10X okularet).

For embryoer stadium 25 eller yngre:

  1. Overfør embryo til Dissection Plate med en ikke-steril overføringspipetten.
  2. Bruker to par av fine tang, lage en midsagittal kutt på ventrale siden av embryo, som begynner på den bakre enden og fortsetter gjennom sement kjertel i den fremre delen av embryo.
  3. Åpne forsiktig embryo ved å ta tak enten kanten av kuttet og spre venstre og høyre. Dette resulterer i et embryo med dorsal side vender inn Dissection Plate, og med den ventrale ektoderm spre opp for å vise endoderm og mesoderm innenfor.
  4. Begynne å fjerne endoderm og mesoderm (Figur 2A og 2B). Den første og største lag av dette vevet er svært "LUN" i utseende medstore celler og lite opplagt organisasjon.
  5. Etter å ha fjernet dette laget, vil somites og notochord blir synlige. For bedre kontrast, flytt embryo til en separat 60 mm plast petriskål inneholdende 10 ml cellekulturmedium og 100 ul av 1% oppløsning av Nile Blue Sulfate (i vann) i 2-3 min før overføring tilbake til Dissection Plate. Dette vil farge ektoderm, somites, og notochord for enklere identifikasjon og orientering.
  6. Med fokus på den fremre delen av embryoet, fjern forsiktig notochord og eventuelle gjenværende mesoderm utsette hjernen og optikk vesikler (figur 2C).
  7. Når hjernen og optikk vesikler fullstendig eksponert, bruke pinsett å bryte nevralrøret og underliggende ektoderm bare posterior til hjernen.
  8. Slå denne delen (hjernen og optikk vesikler) over slik at ektoderm er på toppen.
  9. Ta vare for ikke å skade de underliggende optiske vesikler, re forsiktigflytte ektoderm (figur 2D).
  10. Slutt, ved hjelp tang, skille de optiske vesikler fra hjernen (figur 2D og 2E).

For embryoer eldre enn scenen 25:

  1. Mens på embryoet er i Anesthetization Plate, fjern ventrale delen av embryoet med pinsett.
  2. For bedre kontrast, flytte embryo til en 60 mm plast petriskål inneholder 10 ml 0.1X MMR og 100 ul av 1% Nile Blue Sulfate i 2-3 min før de overføres til Dissection Plate. Dette vil farge ektoderm blå.
  3. En gang i Dissection Plate, trekke tilbake ektoderm overliggende netthinnen (eller optisk vesicle for embryo stadiet 26-30) (figur 2F og 2G). Hvis Nile Blue sulfat ble brukt, vil ektoderm være farget blå, men den underliggende retinal vev vil ikke.
  4. Fjern netthinnen eller optisk vesicle nøye med forceps (Figur 2H, 2I, og 2J). Det er nyttig å holde embryoet på plass med en tang og fjerne netthinnen eller optisk vesikkel med den andre.

2. Dissosiasjon av vev og plettering av Celler

Viktig merknad - Ved overføring vev, ikke la netthinnen eller optisk vesicle berøre noen luft-væske grenser, hvis dette skjer cellene vil lyse.

  1. Når den optiske vesikkel eller netthinnen er dissekert, nøye overføre til Eksplantasjon Skyll Plate med P100 mikropipette bruker aerosol resistente tips og la den sitte i 30 sek.
  2. Overfør 80 pl på 0,1% trypsin i CMF fra Eksplantasjon Dissosiasjon Plate til Eksplantasjon Dissosiasjon Tube.
  3. Ved hjelp av en P100 mikropipette og aerosoler resistente tips, overføre netthinnen eller optisk vesicle fra Eksplantasjon Skyll Plate til Eksplantasjon Dissociatipå Tube, unngå overføring av explants skyll løsning.
  4. Tillat vevet å dissosiere i Eksplantasjon Dissosiasjon Tube i 1 time ved romtemperatur. Ett netthinnen ble brukt per plate, men vi oppmerksom på at det er mulig å bruke mer enn én per plate hvis så ønskelig å øke antall celler per plate.
  5. Til plate cellene, første langsomt fjerne 40 pl av oppløsningen fra Eksplantasjon Dissosiasjon Tube og forkaste bruke en P100 mikropipette og aerosoler resistente tips. Ved hjelp av en P100 satt til 40 pl og aerosoler resistente tips, overføre cellene (nå at vevet har dissosiert) til Kultur Plate. Når aspirere cellene på platen, pipetteres langsomt og holde cellene i et lite område i sentrum av platen.

Merk: Hvis flere bilder av cellene skal tas gjennom hele forsøket, fester et rutenett (Cellattice) til undersiden av den kultur plate

  1. La cellene til å sitte uforstyrret i minst 1 time til å følge Nunclon plate. Etter denne tid, må de behandles svært forsiktig eller de kan løsne.
  2. Dyrke celler til ønsket stivhet ved å observere søsken embryoene som er alet ved samme temperatur som cellene. Hvis levende celler ikke blir brukt for videre manipulering, kan de festes i MEMFA løsning på dette tidspunktet.

Viktig merknad: De fleste av våre eksperimenter er løst innen 6 timer fra plating cellene. Levetiden av cellene i kultur er avhengig scenen der vevet ble dissekert og mengden eggeplomme fortsatt til stede i cellene, cellene dissekert fra yngre (neurula stadier) forbli sunne i kultur i 5-6 dager, mens celler ervervet fra eldre embryoer (svømming rumpetrollstadier) forblir levedyktig i kultur i 2-3 dager.

3. Kalsium Imaging 47-49

Denne protokollen benytter kalsium-følsom Fluo4-AM og konfokalmikroskopi å kvantifisere kalsium transienter i enkeltceller. Alle trinnene ved hjelp Fluo4-AM skal utføres bort fra lys, som Fluo4-AM er lysfølsomt. Alle vasker bør legges til eller fjernes ved hjelp av en P1000 mikropipette og aerosol-resistente tips. Pipettering bør gjøres sakte og mot kanten av platen for å unngå å forstyrre cellene. Media er ikke endret fordi kulturene er generelt løst innen seks timer for å bli dissekert. For mer langsiktige kulturer bør mediene bli forandret daglig.

  1. Fluo4-AM lagres ved -20 ° C, og vi foreslår lagring i 5 pl alikvoter. Før du bruker, tine en 5 pl porsjon av Fluo4-AM bort fra lys og tilsett 2 pl Pluronic F-127 direkte til denne delmengde.
  2. Sent dyrking cellene for den ønskede mengde av tid (minst1 time), fjerne en ml av cellekulturmediet fra kultur Plate. Legg dette til Fluo4-AM og Pluronic, blande med milde pipettering.
  3. Sakte overføre alle av denne løsning tilbake til kanten av Kultur Plate av cellene som skal bli avbildet og la cellene i denne løsningen uforstyrret i 1 time for å absorbere Fluo4-AM.
  4. Å vaske ut overflødig Fluo4-AM fra cellekulturmedium, følger vask serien:
    • Fjern en ml av media fra platen.
    • Tilsett 3 ml av fersk cellekulturmedier (fra 15 ml konisk rør) til plate.
    • Utføre to ytterligere vaskinger, hver gang langsomt fjerne 3 ml oppløsning fra platen og legge 3 ml frisk cellekulturmedier.
  5. Cellene bør nå være i 4 ml cellekulturmedium og inneholder Fluo4-AM. Fluo4-AM er enzymatisk spaltet gang inne i cellen, og hindrer den fra å spre ut av cellen eller inn i noen membran bundet avdelinger. Før du legger platen på scenen av confocal mikroskop for bildebehandling, tegne en vertikal rød linje med permanent markør på parabolen samtidig dekselet på å hindre markør partikler forurenser kultur. Den vertikale linje trekkes ned ved siden av petriskålen (bunnen av petriskålen, ikke lokket). Dens formål er å indikere orienteringen av kulturen platen med hensyn til synsfeltet slik at den nøyaktige orientering og innretting av de enkelte cellene kan være re-etablert ved et senere tidspunkt.
  6. Platen er nå klar for å settes inn i fasen av konfokal mikroskop for avbilding. Visualisere cellene ved hjelp av de lyse feltet innstillinger på en laserskanning confocal mikroskop (mål 20X). Finn et område med tett celler som ikke inneholder klumper, helst med et synsfelt som inneholder stort rutenett tallene på Cellatice dekkglass å gjøre å finne den samme synsfelt lettere senere når avbildning kulturen etter i situ hybridisering. Før til avbildning fokusere ned gjennom kulturen og ta en mørkefelt bilde av rutenettet nedenfor cellene til posten plasseringen og orienteringen av cellekultur. Dette gir mulighet for omstillingen av cellene for etterfølgende analyser.
  7. Hev fokusplan og fange en lyse feltet bilde av cellene før du begynner kalsium imaging (figur 3A).
  8. Når senterplan av cellene er i fokus, er platen klar for avbildning av kalsium aktivitet. Innstillingene vil variere avhengig mikroskopet og programmet. Vi image cellene ved hjelp av en Argon 488 nm laser for 1, 2, eller 12 t med følgende parametere:
    • 1 hr bilder:
      • Argon 488 nm laser skanner med 4% av sin maksimale 30 mW makt.
      • Skann én gang hvert 4 sek (900 skanninger per time).
    • 2 hr bilder:
      • Argon 488 nm laser skanner med 4% av sin maksimale 30 mW makt.
      • Skann én gang hver8 sek (450 skanninger per time).
    • 12 timers bilder:
      • Argon 488 nm laser skanner ved 2% av sin maksimale 30 mW.
      • Skann én gang hvert 48 sek (75 skanninger per time).

Disse parameterne vil resultere i et sett av 900 stillbilde bilder for hver tidsramme. Kalsium aktivitet kan deretter bli registrert ved å analysere fluorescence nivåer over tidsforløpet bilder (Figur 3B) med bruk av et bildebehandlingsprogram eksempel ImageJ 50.

4. Fikse Cells

  1. Etter avbildning, kan cellene være løst i 30 min ved å fjerne 3 ml oppløsning fra platen og tilsetning av 1 ml 2X MEMFA til gjenværende 1 ml kulturmedia.
  2. Etter fiksering, fjerne MEMFA og dehydrerer celler med en serie på 5 min vaskinger, hver et volum på 1 ml:
    • 25% etanol i 1X fosfat-bufret saltvann (PBS).
    • 50% etanol i 1X PBS.
    • <li> 75% etanol i SDD H 2 O (sterilt avionisert destillert vann).
    • Erstatt siste vask med 1 ml 100% etanol og lagre platen ved -20 ° C.

Merk: Metanol kan også bli brukt til disse vasker og lagring.

5. Fluorescerende in situ hybridisering (FISH)

Kulturer kan analyseres ved hjelp av standard FISH protokollen for Xenopus som beskrevet 51 med modifikasjoner for cellekultur som skissert av Anderson Lab 52. Modifikasjoner på Anderson Lab-protokollen er listet nedenfor. Alle vaskinger er gjennomført på 35 mm Nunclon plater i volumer på ca 1 ml, med mindre annet er nevnt. Løsninger er som definert i Sive m.fl.. 53 mindre annet er angitt.

Viktig: Ikke bruk fluorescein-merket RNA prober når du utfører in situ hybridisering på celler fotografert forkalsium aktivitet. Anti-fluorescein antistoffer vil binde seg til gjenværende Fluo4-AM i cellene og kan forårsake positivt signal i alle celler i kulturen.

Dag 1: Permeabilization og Hybridisering

  1. Rehydrering vasker bør gradert til dehydrering løsemiddel som brukes til lagring. For våre eksperimenter, ble vasker gradert til etanol i 1X PBS.
  2. Etter rehydrering, vaske cellene tre ytterligere ganger i 1X PBS i 5 min hver ved romtemperatur.
  3. Bland 25 ml 0,1 M trietanolamin (pH 8,0) med 62,5 pl eddiksyreanhydrid i en Falcon rør og raskt blandes inntil grundig dispergert som diskutert i Anderson Lab 52 protokollen. Inkuber kulturer i denne blandingen i 10 minutter ved romtemperatur. Etter eddiksyreanhydrid behandling, vask celler i 1X saltvann natriumcitrat (SSC) i 5 min ved romtemperatur.
  4. Fjerne den siste SSC vask og erstatte med 0,2 M HCl (i SDD H 2 O) i 10 min til permeabilize celler. </ Li>
  5. Skyll HCl med to vaskinger i 1X PBS i 5 min.
  6. Prehybridize i ISH buffer ved 60 ° C i et riste vannbad i minst 6 timer, men ikke over natten som prehybridize dette sterkt reduserer signalet.
  7. Hybridisere natten over ved 60 ° C i 8-14 hr i 750 pl av fortynnet probe (1:250 fortynning fra et renset probe). Den rensede probe konsentrasjonsområder 1,0 til 1,5 mikrogram / ul.

Dag 2: Fjerning av Ubundet Probe og Antibody Inkubasjon

  1. Fjern probe og skyll kulturer i 5 min i 0.2X SSC ved 60 ° C. Vask i frisk 0.2X SSC i en time ved 60 ° C.
  2. Fjern kulturer fra vannbadet og tillate dem å justere til romtemperatur i 5 min.
  3. Skyll i 0.2X SSC ved romtemperatur i 5 min.
  4. Vask etter 15 min i 1X PBS med 0,1% Triton-X-100 (PBT).
  5. Å inaktivere endogene peroxidases, vask i 1 time i en 2% H 2 O 2 løsning i PBT.
  6. Blokkere i 2% Blokkering reagens i maleinsyre Buffer (MAB) i 1 time ved romtemperatur. Vi har funnet at denne blokkering metoden øker følsomheten i forhold til tidligere metoder for blokkering i 20% sau serum i PBT.
  7. Inkuber kulturer i 1 ml 2% Blokkering reagens i MAB inneholdende en 1:1.000 fortynning av en POD-konjugert antistoff over natten ved 4 ° C.

Dag 3: Fjerning av Ubundet antistoff og Fluorescence Development

  1. Fjern antistoff løsningen og skyll 3 ganger i TBST i 5 min ved romtemperatur.
  2. Vask 4 ganger i TBST i 15 minutter ved romtemperatur mens kontinuerlig rock på lav hastighet.
  3. Vask to ganger i PBT ved romtemperatur i 10 min.
  4. Påfør 750 ul av 1:200 fluorescein-tyramide eller 01:25 Cy3 tyramide fortynnet i PBT. Inkuber i 5 min ved romtemperatur og tilsett 2,5 pl 0,3% H 2 2. Rock for 40 min å tillate signal å utvikle.
  5. Vask minst 4 ganger i 15 minutter hver i TBST ved romtemperatur med rocking.
  6. Når signalet er fullt utviklet, vask i 5 min i 1X PBT.
  7. Fikse i 1X MEMFA i 1 time ved romtemperatur og oppbevar i 1X PBS ved 4 ° C.

6. Bilde FISH Resultater og Co-register med kalsium imaging data

  1. Ved gjennomføring av fisk, er cellekultur plater avbildet til å bestemme hvilke celler viser en positiv fluorescens signal for en gitt sonde. Bruk Cellattice dekkglass å finne den eksakte synsfelt studert under kalsium bildebehandling og justere platen til orientering av kalsium bilde rammer.
  2. Fokus til senterplanet av cellene og ta en enkelt høy-oppløsning ved hjelp av Helium-Neon HeNe 543 nm laser ved 15% av sin maksimale 1 mW effekt (figur 3C).
  3. I den opprinnelige 900 ramme satt av bilder tatt fra kalsium Imaging protokollen,identifisere individuelle celler som regioner av interesse (ROIs) gjennom bruk av en bildebehandling program (for eksempel ImageJ 50). Pakk ROI fluorescens data som et sett av datapunkter som representerer tid fluorescens par verdier (figur 4).
  4. Overlappe FISH resultater bildet med identifisert ROIs fra kalsium bilder (figur 3D).
  5. Registrere hver ROI som positiv for sonden, negativ for sonden, eller ukjent - i tilfelle at cellen tilsvarer ROI kan ikke lenger bli funnet innenfor synsfelt fiskebildet.
  6. Prosess ROI fluorescens data ved hjelp av statistiske analyser skript (som laget gjennom MATLAB eller andre programmeringsspråk) for å sammenligne kalsium aktivitetsnivå mellom ulike dissekert stadier (figur 5A og 5C) eller celler positive for forskjellige fisk prober (figur 5B og 5D). Alle scriptene som brukes i vårt laboratorium er fritt tilgjengelig på forespørsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempler på vellykket dissekert optikk vesikler (stadium 25) og retinae (stadium 35) er vist i figurene 2E og 2J. Mens denne protokollen kan brukes på ulike stadier i utviklingen, er det avgjørende å få bare retinal vev for å sikre nøyaktighet for nye eksperimenter. Fjern forsiktig epidermis i alle ledd og sikre at tang ikke punktere retinal vev. I stadium 35 eller eldre, kan linsen bli sett på som et klart lag på toppen av netthinnen og kan fjernes ved forsiktig skraping med tang.

En vellykket belagt primær cellekultur er vist i figur 3A. Når dissociating vev, er det viktig ikke å forlate retinal eksplantasjon i skyll løsningen for lenger enn den anbefalte 30 sek inkubasjonstid å hindre vev fra dissociating i skyll løsningen. Tillegg kontrollere at vevet tillates å dissosiere i trypsin-løsning for en hel time(Eldre embryonisk og larvestadier kan kreve enda lengre) å tillate en jevn fordeling av celler i kultur plate. Når cellene er belagt, utvise forsiktighet når du flytter plate og endre løsninger for å unngå å vaske cellene fra platen.

Tall 3B og 3C viser bilder fra kalsium aktivitet skanning og fluorescerende in situ hybridisering eksperimenter (fisk), henholdsvis. Celler som vises lyse grønt i kalsium bildet er celler som er under en forbigående økning i intracellulær kalsium nivåer som følge av frigjøring av indre kalsium butikker. Cellene kan da bli analysert for genekspresjon bruke fisk, og genuttrykksmønster kan være korrelert til mønstre av kalsium spiking aktivitet ved å legge bildene (figur 3D). Ved hjelp av en kombinasjon av Python og MATLAB skript (fritt tilgjengelig på forespørsel), er data innhentet ved å analysere fluorescens aktivitet av hver individeral område av interesse (ROI) gjennom løpet av imaging. Et eksempel av kalsium-aktivitet for en individuell celle (ROI) over 1 hr av avbildning er vist i figur 4, en pigg er synlig på ca 57 min for avbildning. I tabell 1 er representative data for prosentandelen av celler som var positive for ulike prober vist, mens det er ingen data som er spesifikke for denne eksperimentet rapportert i litteraturen (punktet av vår nåværende eksperimenter er å fastslå disse prosenter), våre funn er i overensstemmelse med data fra lignende typer eksperimenter knyttet til kalsium aktivitet i ryggmargen 17,55,56.

Parametere som benyttes for analyse omfatter antall, frekvens og amplitude av toppene. Figur 5 gir representative resultater av kalsium bildebehandling og FISH eksperimenter i embryonale netthinnens celler ved hjelp prober for xVglut1, Ptf1a, og xGAD67. MATLAB skript, antall pigger for each ROI bestemmes og antall pigger blir midlet for alle ROIs i eksperimentet. Gjennomsnittlig antall pigger fra hvert eksperiment kan deretter bli kompilert med andre eksperimenter, som resulterer i gjennomsnitt for en gruppe av eksperimenter. Kumulativ distribusjon tomter kan bli opprettet for å vise fordelingen av gjennomsnittlig antall pigger for alle eksperimenter innenfor en gruppe. MATLAB skript blir deretter brukt for statistisk analyse av data.

Figur 5 viser representative data følgende MATLAB analyse. Kort, viser våre resultater at kalsium aktivitet er developmentally regulert, med spiking topp på scenen 35 (p <0,002) (figur 5A og 5C). I form av å korrelere kalsium aktivitet med celler positive for en spesifikk probe, mens det var ingen statistisk signifikante forskjeller, men det var en trend (p = 0,08) for celler positive for xGAD67 (en markør for differensierte GABAergic celler) for å vise highe r kalsiumnivå spiking aktivitet enn celler positive for en glutamaterg markør eller Ptf1a, et gen som koder for en transkripsjonsfaktor genet korrelert med fremme GABAeric fenotype. Selv foreløpige, disse dataene antyder at det kan være GABAergic celler, som utvikler på en måte uavhengig av Ptf1a eller at aktiviteten-avhengige nevrotransmitter spesifikasjonen er ikke opptrer på nivået av Ptf1a.

Figur 1
Figur 1. Prosessuelle skjematisk. Når retinal vev er dissekert og dissosiert, primær cellekultur kan brukes til en lang rekke bruksområder.

s.jpg "/>
Figur 2. Disseksjon fotografier. Embryoer ble farget i Nile Blue Sulfate for økt kontrast. AE: Stage 24. FJ: Stage 35. Forkortelser:. Ov, optisk vesicle, fb, forebrain, fm, ryggmargen, meg, mesoderm, så, somites, le, linse, cg, sement kjertel; re, netthinnen, ep, epitel Klikk her for større figur .

Figur 3
Figur 3. Bilder av cellekultur med ROIs sirklet. A. Lyse feltet. B. Bilde følge Fluo-4 (AM) behandling med ROIs sirklet. C. FISK bilde (pilene angir eksempler celler positive for alfa-underenheten av spenningen gated kalsiumkanalblokkerende CaV2.1). D. Overlegg av lyse feltet, Fluo-4, og FISH bilder.

7/4377fig4.jpg "alt =" Figur 4 "fo: content-width =" 3.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Eksempel på kalsium aktivitet for en enkelt celle (ROI). Plot av fluorescens (i relative fluorescens enheter, RFU) mot tid (i minutter) fra en Fluo4 kalsium fluorescens bilde.

Figur 5
Figur 5. Resultater viser kalsium skyter av scenen og sonde. A. Gjennomsnittlig antall kalsium pigger ved stadier 30 (n = 4), 35 (n = 8), og 38 (n = 13). B. Gjennomsnitt antall kalsium pigger pr kultur blant forskjellige prober brukes for in situ hybridisering ved stadium 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), og Ptf1a (n = 4). C. Kumulativ fordeling tomt på gjennomsnittlig antall pigger pr kultur ved 30 etapper, 35, 38. D. Kumulativ distributipå tomt på gjennomsnittlig antall pigger per kultur for celler identifisert som å ha positivt signal for in situ hybridiseringsprober på scenen 35,. xVglut1, xGAD67, og Ptf1a Klikk her for større figur .

Probe Stage n (plater) n (celler) Prosent Positive
xGAD67 35 4 1042 2%
38 4 690 2%
Ptf1a 30 3 352 1%
35 6 1856 1%
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2%
38 3 364 4%

Tabell 1. Prosent positive celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med sine godt karakterisert celletyper som er bevart på tvers av alle virveldyr, gir netthinnen en nyttig modell for å studere molekylære cellulære prosesser som styrer celletype spesifikasjon og differensiering. Primær cellekultur gir en kraftig metode for å undersøke en rekke prosesser, inkludert genekspresjon, protein dynamikk, og kalsium og elektriske aktiviteten på nivået av enkeltcelle oppløsning. Her presenterer vi en grei teknikk for primær cellekultur fra dissekert presumptive retinal vev i Xenopus laevis, spesielt mottagelig organisme for slike studier gitt at presumptive netthinnen er lett tilgjengelig fra de aller tidligste stadiene av utviklingen, og at primære cellekulturer kan oppstå i en definerte medier bestående av en enkel saltløsning.

Selv lett tilpasses til de fleste laboratoriet, er det flere trinn som krever særlig oppmerksomhet. Dissections bør utføres med fersk skjerpet tang. Yngre stadier (<st. 30) nytte av behandling med kollagenase B blandet med cellekulturmedium. Alle trinn involverer overføringen av vev eller celler fra ett medium til et annet må utføres med forsiktighet for å hindre at vev eller celler fra å komme inn nærhet av luft-løsningen grensesnitt. Pipetten inneholdende vevet bør være fullt nedsenket i masse væske og cellene eller vev utvist svært langsomt. Etter at cellene er blitt belagt, alle væskenivåer overføringer inkludert, Fluo4-AM tillegg og cellekulturmedium eller fiksering vasker, må nøye utført gitt at celler kan lett forskyves. Som med all cellekultur, er sterilitet bekymring, så forsiktighet bør tas for å sterilisere alle materialer. Endelig la dissosiert retinal explants sitte for utpekte tidsramme på dissosiasjon medium er avgjørende for vellykket celleadhesjon og for å unngå klumper.

Underdisseksjon og kultur tilstand er beskrevet i denne protokollen, både nekrose og apoptose er ekstremt begrenset (mindre enn 5-10% av cellene). Tap av celler på plate (apoptose) er sjelden merke under pre og post confocal bildebehandling økter. Håndtering cellekulturer nøye er nøkkelen til celle levedyktighet. Løsning endringer må utføres veldig sakte og jevnt for å utelukke celle nekrose og apoptose. Mens eksperimenter for å avgrense den nøyaktige forholdet mellom retinal celletyper er for tiden pågår, gjør vi oppmerksom på at en rekke av netthinnens celletyper synes å være representert i de kulturer og at Muller gliaceller (som har en distinkt morfologi) er ikke dominerende i kulturer .

En potensiell bekymring når analysere platene etter in situ hybridisering eksperimenter er at noen av cellene kan ha flyttet, men dette kan tas opp med den bruk av celle sporingsprogrammer. Også, iboende i teknikken av primær cellekultur, er en stor begrensning the åpenbare tap av romlig mønster som er tilstede i den intakte vev. Identiteten enkeltceller må etableres ved hjelp av molekylære assays snarere enn ved posisjon i vevet. Imidlertid gir denne funksjonen også mulighet til å analysere tilstanden til spesifikasjonen av celler meget nøyaktig og i fravær av fortsatt celle-celle interaksjoner. Det tillater også undersøkeren selektivt behandle cellene med vekstfaktorer eller andre forbindelser og presist analysere effekter uten påvirkning av signaler fra nabocellene. Mens vi har ansatt denne retinal disseksjon og primær celle kultur teknikk for å korrelere kalsium bildebehandling med spesifikke nevrotransmitter fenotype markører, er denne teknikken tilpasses et vidt spekter av andre nedstrøms applikasjoner, inkludert elektrofysiologiske opptak og enkelt celle genuttrykk analyser ved hjelp RT-PCR eller "neste -gen "transkriptom analyse (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi graciously takke dr. John Hayes for skript; Drs. Eric Bradley og Christopher Del Negro for å få hjelp med konfokalmikroskopi, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, og Liz MacMurray for deres arbeid med å utvikle prosjektet og gi foreløpige data, Dr. Greg Smith for nyttige forslag på statistisk analyse. Dette arbeidet ble støttet av en NIH stipend (NINDS IR15N5067566-01) til MSS og Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant til College of William and Mary.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.

Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110 (2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940 (2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11 (2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics