Analyse av snare-mediert membran fusion Bruke en Enzymatisk Cell Fusion Assay

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi har utviklet en cellefusjon assay som kvantifiserer snare-medierte membran fusion hendelser etter aktivert ekspresjon av β-galaktosidase.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hasan, N., Humphrey, D., Riggs, K., Hu, C. Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay. J. Vis. Exp. (68), e4378, doi:10.3791/4378 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Interaksjonene mellom Snare (s oluble N-etylmaleimid-sensitive faktor en ttachment protein re ceptor) proteiner på vesikler (v-Snares) og på målet membraner (t-Snares) katalysere intracellulær vesicle fusjon 1-4. Reconstitution analyser er avgjørende for dissekere mekanismen og regulering av snare-mediert membran fusion 5. I en cellefusjon assay 6,7, er snare proteiner uttrykt ectopically på celleoverflaten. Disse "venda" Snare proteiner drive celle-celle fusion, viser at snarer er tilstrekkelig til å smelte cellemembraner. Fordi cellefusjon Forsøket er basert på mikroskopisk analyse, er det mindre effektivt når det brukes til å analysere flere v-og t-snare interaksjoner kvantitativt.

Her beskriver vi en ny assay 8 som kvantifiserer snare-medierte cellefusjon hendelser etter aktivert ekspresjon av β-galaktosidase. Tokomponenter av Tet-Off genuttrykksystem 9 brukes som en avlesning system: tetracyklin-kontrollerte transactivator (TTA) og en reporter plasmid som koder LacZ-genet under kontroll av tetracyklin-responselement (TRE-LacZ). Vi transfektere TTA inn COS-7 celler som uttrykker venda v-snare proteiner på celleoverflaten (V-celler) og transfektere TRE-LacZ i COS-7 celler som uttrykker venda t-snare proteiner på celleoverflaten (t-celler) . Snare-avhengige fusjon av de V-og T-celler resulterer i bindingen av TTA til TRE, den transkripsjonelle aktivering av LacZ og uttrykk for β-galaktosidase. Aktiviteten av β-galaktosidase er kvantifisert ved hjelp av en kolorimetrisk metode ved absorbans ved 420 nm.

De vesikkel-tilknyttede membran proteiner (Vamps) er v-Snares som bor i ulike post-Golgi vesikulær avdelinger 10-15. Ved å uttrykke en Vamps, 3, 4, 5, 7 og 8 på samme nivå, sammenligner vi deres membran fusionaktiviteter ved hjelp av enzymatisk cellefusjon analysen. Basert på spektrometrisk måling, tilbyr denne analysen en kvantitativ tilnærming for å analysere snare-mediert membran fusion og for høy gjennomstrømming studier.

Protocol

1. Cellekultur og Transfeksjon

  1. COS-7 celler dyrkes i Dulbecco Modified Eagle 's Medium (DMEM) supplert med 4,5 g / l glukose og 10% føtalt bovint serum (FBS).
  2. Plasmid transfeksjon er gjort med Lipofectamine i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen).

2. Fluorescens mikroskopisk analyse av celleoverflaten Snare Expression

  1. Dagen før transfeksjon, 3 x 10 4 COS-7 celler sås på sterile 12-mm glass dekkglass (Fisher Scientific) inneholdt i 24-brønners plater.
  2. For v-celler i hver brønn, 0,25 ug av plasmidet som koder TTA (pTet-Off, Clontech) kotransfekteres med 0,25 ug av plasmidene som uttrykker venda Vamps.
  3. For T-celler i hver brønn, er 0,25 ug av plasmid som koder TRE-LacZ (PBI-G, Clontech) kotransfekteres med 0,25 ug hver av plasmidene som uttrykker venda SNAP-25 og syntaxins 1 eller 4.
  4. 24 timer etter transfection, celler festes med 4% paraformaldehyd i PBS + + (PBS supplert med 0,1 g / l CaCl 2 og 0,1 g / l MgCl 2) i 10 min, og deretter blokkert i 10% FBS i PBS + + for 30 min.
  5. Cellene inkuberes i 1,5 timer med anti-myc monoklonalt antistoff 9E10 (neat hybridom kultur supernatant).
  6. Etter fire vaskinger med PBS + +, cellene blir inkubert i 1 time med FITC-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories) ved en fortynning på 1:500.
  7. Etter fire vaskinger med PBS + +, blir de merkede celler montert i Prolong Gull antifade reagens (Invitrogen).
  8. Confocal bilder er samlet på en Olympus laserskanning confocal mikroskop. Bildene behandles med Adobe Photoshop programvare.

3. FACS Analyse av celleoverflaten Snare Expression

  1. Dagen før transfeksjon, 2 x 10 5 COS-7 celler utsådd i hver brønn av seks-brønners plater.
  2. 24 timer etter at transfection med venda snare, pTet-Off og PBI-G plasmider, blir cellene fiksert med 1% paraformaldehyd i PBS + + i 15 min, og deretter blokkert i 10% FBS i PBS + + for 15 min.
  3. Cellene inkuberes med anti-myc monoklonalt antistoff 9E10 i 60 min.
  4. Etter tre vaskinger med PBS + +, blir cellene merket med FITC-konjugert sekundært antistoff (1:200 fortynning) i 45 min.
  5. Etter tre vaskinger med PBS + +, blir cellene skrapet av platene med en celle skrape.
  6. 15000 celler blir analysert ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). Den midlere fluorescensintensitet av hver prøve oppnås med CellQuest Pro programvare.

4. Enzymatisk Cell Fusion Assay

  1. Dagen før transfeksjon, 1,2 x 10 6 COS-7 celler utsådd i hver 100-mm vevskultur parabol, og 2 x 10 5 COS-7 celler utsådd i hver brønn av seks-brønners plater.
  2. For v-celler, 0,5 - 5 pg hver av Flipped VAMP plasmid kotransfekteres med 5 ug pTet-Off inn i cellene i hver 100-mm kultur parabolen. Kontroll celler kotransfekteres med den tomme vektoren pcDNA3.1 (+) og pTet-Off. Å forhindre N-glykosylering av en Vamps, 4, 5, 7 og 8, tunicamycin (10 ug / ml) er inkludert i cellekulturmedium under transfeksjon.
  3. For T-celler i hver brønn av seks-brønners plater, 1 ug snudd SNAP-25 plasmidet og PBI-G blir kotransfekteres med 0,5 ug venda syntaxin1 plasmid eller 0,05 ug venda syntaxin4 plasmid.
  4. 24 hr etter transfeksjon, blir v-cellene løsrevet fra kultur retter med den enzym-fri Cell Dissosiasjon Buffer (Invitrogen). Frittliggende celler telles med en hemacytometer og resuspendert i HEPES-bufret DMEM supplert med 10% FBS, 6,7 ug / ml tunicamycin og 0,67 mM DTT.
  5. 4,8 x 10 5 resuspendert v-celler tilsatt til hver brønn som allerede inneholder t-celler.
  6. Etter 6, 12 eller 24 timers rotte 37 ° C i 5% CO 2
  7. Etter 90 min, er den kolorimetriske reaksjonen stoppet ved å tilsette 1 M natriumkarbonat.
  8. Absorbans ved 420 nm måles ved hjelp av et Hitachi 100-40 spektrofotometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å utvikle en kvantitativ cellefusjon analysen, kan vi dra nytte av den sterke transcriptional aktivering av bindingen av TTA til TRE. I fravær av TTA, er transkripsjonen av lacZ-genet i TRE-LacZ taus. Når TTA er tilstede, bindes det til TRE og aktiverer transkripsjon av LacZ. Figur 1 viser et flytskjema av den enzymatiske cellefusjon assay. TTA er transfektert inn v-celler som uttrykker v-snare proteiner på celleoverflaten, og TRE-lacZ transfekteres inn i T-celler som uttrykker t-snare proteiner på celleoverflaten. Fusjon av v-og T-celler resulterer i bindingen av TTA til TRE, den transkripsjonelle aktivering av LacZ, og uttrykket i β-galaktosidase.

Figur 2A viser domene struktur av venda snare konstruksjoner. Den preprolactin signalsekvens er smeltet til N-termini av snarer. Disse konstruerte snarer kalles "snudd"Snarer fordi orienteringen av deres snare motiver mot mobilnettet membraner er snudd. Når COS-7 celler transfektert med flipped Snare plasmider, venda snare proteiner er uttrykt på celleoverflaten (figur 2B). Strømningscytometri er brukt til å måle nivåer av uttrykket snare proteiner på celleoverflaten (Tall 2C og D). For å sammenligne sine membran fusion kapasiteter, Vamps må uttrykkes på samme nivå. Derfor, titrert vi og optimalisert konsentrasjonen av hver venda snare plasmid brukt i transfeksjon. Vendt Snare plasmider transfektert på følgende konsentrasjoner (per 10 cm 2 vekstområde, dvs. per brønn i 6-brønners plater): VAMP1, 0,2 mikrogram, VAMP3, 0,5 ug, VAMP4, 0,5 ug, VAMP5, 0,05 mikrog; VAMP7, 1,0 mikrogram, VAMP8, 0,1 mikrogram, syntaxin1, 0,5 mikrogram, syntaxin4, 0,05 ug. TTA, TRE-LacZ og venda SNAP-25 ble kotransfekteres på 1 pg per 10 cm 2 vekstområde. Under lykkesh betingelser, 1 Vamps, 3, 4, 5, 7 og 8 er uttrykt på samme nivå, mens syntaxins 1 og 4 er uttrykt på samme nivå på celleoverflaten (figur 2D). Som vist ved konfokal og fasekontrast bildeanalyse (figur 2E), er 80% av COS-7 celler transfektert med snudd snare plasmider. Dual merking bildebehandling analyse (figur 2F) indikerer at 70% av de transfekterte v-celler uttrykker både TTA og spegla VAMP proteiner. Fordi LacZ genet i TRE-LacZ ikke uttrykkes før cellefusjon, er vi ikke i stand til å fastslå hvor stor prosentandel av transfekterte t-celler som uttrykker både TRE-LacZ og venda t-snare proteiner.

De nevrale snarer (VAMP2 v-snare, og t-Snares syntaxin1 og SNAP-25) som formidler synaptiske eksocytose brukes til å teste gjennomførbarheten av analysen. Faktisk, når v-celler som uttrykker VAMP2 og t-celler som uttrykker syntaxin1/SNAP-25 kombineres, robust β-galactosidase uttrykk oppdages (figur 3). Imidlertid, når enten VAMP2 eller snap-25 ikke er uttrykt, er bare baseline β-galaktosidase aktivitet oppdaget, noe som indikerer at cellefusjon og uttrykk for β-galaktosidase avhengige interaksjoner av v-og t-snarer. Disse resultatene indikerer at den enzymatiske cellefusjon assay identifiserer fusogenic sammenkoblinger mellom v-og t-snarer effektivt.

Ved å uttrykke VAMP proteiner på samme nivå på celleoverflaten (figur 2D), sammenligner vi deres membran fusion aktiviteter. Med syntaxin1/SNAP-25 t-snarer 1 Vamps, 3 og 8 har sammenlignbare og de ​​høyeste fusion aktiviteter, mens Vamps 4 og 7 har 50% og 30% lavere fusion aktiviteter, henholdsvis (figur 4). I kontrast, når VAMP5 kombineres med de t-snarer kun baseline β-galaktosidaseaktivitet påvist (figur 4), noe som tyder på at VAMP5 ikke kjøre membran fusion med Syntenaxin1/SNAP-25.

Figur 1
Figur 1. Enzymatisk cellefusjon analysen. TTA er kotransfekteres med snudd v-snare plasmider, og TRE-LacZ kotransfekteres med venda t-snare plasmider. Fusjon av V-og T-celler fører til bindingen av TTA til TRE og uttrykket i β-galaktosidase, som er målt ved en kolorimetrisk metode.

Figur 2
Figur 2. Ekspresjon av venda snarer på celleoverflaten. (A) Domene struktur venda snarer. Den preprolactin signalsekvens (SS) er kondensert til den N-termini av snarer og Myc tag settes inn mellom signalsekvensen og snaren motivene (coiled-coil). (B) COS-7 celler kotransfekteres med TTA og den tomme vektoren pcDNA3.1 (+) eller venda VAMP5 plasmid. 24hr etter transfeksjon blir unpermeabilized celler farget med et anti-Myc monoklonalt antistoff. Representative single-slice confocal bilder skal vises. (C og D) 24 timer etter cotransfection med TTA og pcDNA3.1 (+) eller venda Vamps (V-celler), eller 24 timer etter cotransfection med TRE-LacZ, vippes SNAP-25 og syntaxins 1 eller 4 (T-celler ) blir unpermeabilized celler farget med anti-Myc antistoff og analysert ved strømningscytometri. (C) Representative FACS profiler av cellene transfektert med pcDNA3.1 (+) eller venda VAMP1 plasmid. Den midlere fluorescensintensitet av hver prøve bestemmes ved hjelp av CellQuest Pro programvare. (D) For å uttrykke Vamps på samme nivå og uttrykke syntaxins 1 og 4 på samme nivå på celleoverflaten, venda snare plasmider transfektert ved titrerte konsentrasjoner. Vist er gjennomsnittsverdien fluorescensintensiteter av celleoverflaten farging av snaren proteiner. Feilfelt representerer standardavviket 4 uavhengige eksperimenter. (E og F) 24 timer etter cotransfe Dette skjer med TTA og spegla VAMP5 plasmidet, cellene permeablized med 0,2% Triton X-100 i PBS + + og (E) farget med anti-Myc antistoff, eller (F) dual farget med anti-Myc monoklonalt antistoff og et polyklonalt antistoff til TET repressor (for å påvise TTA). (E) som vises er representative confocal og fase kontrast. Antallet transfekterte celler som er merket med anti-Myc antistoff (VAMP5) og det totale antall celler i fasekontrast kanalen telles (n = 60 celler), og transfeksjon Virkningsgraden beregnes (80%). (F) Antallet transfekterte celler som uttrykker både VAMP5 og TTA, og det totale antallet transfekterte celler som VAMP5 uttrykkelige, TTA eller begge telles (n = 75 transfekterte celler). Prosentandelen av de transfekterte celler som uttrykker både VAMP5 og TTA beregnes deretter (70%). Scale barer, 20 mikrometer. Klikk her for å se større figur .

"Fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 3
Figur 3. Cellefusjon avhenger interaksjoner av v-og t-snarer. v-celler som uttrykker TTA og VAMP2 ruges med t-celler som uttrykker TRE-LacZ, syntaxin1 og SNAP-25. Etter 24 t, blir cellene lysert og aktiviteten β-galaktosidase i cellelysater bestemmes ved hjelp av en kolorimetrisk metode ved absorbans ved 420 nm. Bare baseline b-galaktosidaseaktivitet blir oppdaget når enten vendt VAMP2 eller SNAP-25 plasmid er utelatt fra transfeksjon.

Figur 4
Figur 4. Sammenligning av fusion aktiviteter vampyrene. Under optimaliserte transfeksjon betingelser, 1 Vamps, 3, 4, 5, 7 og 8 er uttrykt på samme nivå på celleoverflaten av v-celler. 24 hr etter kombinere v-celler med T-celler som exTrykk syntaxin1/SNAP-25 er cellefusjon kvantifiseres ved hjelp av enzymatisk cellefusjon analysen. Feilfelt representerer standardavviket 4 uavhengige eksperimenter. ** P <0,01; *** P <0,001 vs VAMP1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den opprinnelige cellefusjon analysen 6 fastsetter snare-medierte cellefusjon hendelser ved fluorescens mikroskopi. Her beskriver vi en nyskapende analyse som kvantifiserer snare-medierte cellefusjon hendelser ved aktivert uttrykk for β-galaktosidase og spektrometrisk måling. Ved hjelp av denne analysen, vi rutinemessig analyserer 15-20 v-og t-snare kombinasjoner i et enkelt eksperiment. Bruke flowcytometri å måle Snare uttrykk på celleoverflaten, titrere vi uttrykket nivåer av Vamps og sammenligne deres membran fusion kapasiteter (figurene 2 og 4). Videre, ved hjelp av enzymatisk cellefusjon analysen, fant vi ut at avhengighet av cellefusjon aktivitet på celleoverflaten tetthet av VAMP1 protein, og observerte ingen cooperativity av VAMP1 protein i cellen fusjonsreaksjon 8, noe som tyder på at felles handling av flere snare komplekser er ikke nødvendig å fusjonere cellemembraner.

Det er antatt N-glykosylering motivertfs (Asn-X-Ser/Thr) i snare proteiner. Fordi N-glykosylering hemmer fusion aktivitetene venda Snare proteiner 6, har to tilnærminger blitt brukt for å hindre at glykosylering av snudd snare proteiner. Først er glykosylering-site mutasjoner introdusert i venda snare konstruerer 6. Sekund, som er beskrevet i den aktuelle protokoll, er N-glykosylering inhibitor tunicamycin (6,7 ug / ml) som er inkludert i cellefusjon reaksjonen. I tillegg, er 0,67 mM DTT tilsatt i cellefusjon reaksjonen for å hindre dannelse av disulfidbindinger mellom venda snare proteiner, noe som ville hemme Snare fusion aktiviteter. Våre eksperimenter viser at tilsetning av 6,7 ug / ml tunicamycin og 0,67 mM DTT i cellekulturmedium ikke forstyrrer spredning og overlevelse av COS-7 celler. Vi rutinemessig avslutte cellefusjon reaksjonen ved 24 timer etter å kombinere v-og T-celler. Betydelig snare-mediert cellefusjon detektert 6 hr etter kombinere v-and t-celler 8. Fordi den enzymatiske cellefusjon Reaksjonen avhenger uttrykket av β-galaktosidase etter cellefusjon, etterslep tidsforløpet av denne avlesning systemet tidsforløpet av membran fusion mediert av snudd snare proteiner.

Den enzymatiske cellefusjon assay tilbyr en kvantitativ rekonstituering assay for behandlingen membranegenskapene fusion aktivitetene potensialet V-og t-snare interaksjoner i pattedyrceller. Av coexpressing regulatoriske proteiner (f.eks Munc18) og snarer på celleoverflaten eller ved å inkludere rekombinante regulatoriske proteiner i cellefusjon reaksjonen kan denne analysen brukes til å belyse de reguleringsmekanismer snare-mediert membran fusion. I tillegg bør denne analysen ha programmer i high-throughput screening for inhibitorer eller aktivatorer av snare-mediert membran fusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Dette arbeidet støttes av oppstart midler fra University of Louisville og CA135123 fra National Institutes of Health (til CH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 cells ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Enzyme-free cell dissociation solution Invitrogen 13151-014
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody Millipore AB3541
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
FACSCalibur flow cytometer BD Biosciences
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer Hitachi C740843

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics