昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング(GCMR)を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

Neuroscience

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Summary

嗅覚は、昆虫の多くの異なった行動を媒介し、よく揮発性化合物の数十〜数百から構成される複雑な混合物である。昆虫の触角葉でマルチチャンネル録音でガスクロマトグラフィーを用いて、我々は、生物活性化合物の同定のための方法を説明します。

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Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

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Abstract

すべての生物は、その環境への彼らの行動や生理的な応答を決定する感覚刺激に満ちた世界に生息しています。嗅覚はに反応し、間で、複雑な香りの刺激を区別するために彼らの嗅覚システムを使用して昆虫、特に重要である。これらの臭気はこのような再生や生息地の選択1月3日のようなプロセスを仲介する行動を誘発する。食用作物の受粉4-6、草食7、病気8,9の伝送を含む、農業と人間の健康のために非常に重要である昆虫を媒介行動によってさらに、化学センシング。嗅覚信号と昆虫行動における役割の同定は、生態学的なプロセスおよびヒューマン·食糧資源と幸福の両方を理解するためにこのように重要です。

現在までに、昆虫行動を駆動揮発性物質の同定は困難で、しばしば退屈であった。現在の技術には、ガスクロマトグラフィー結合electroantennogram記録(GC-EAG)、およびガスクロマトグラフィー-結合されたシングル感覚子の録音(GC-SSR)10-12。これらの技術は、生物活性化合物の同定に不可欠であることが判明した。 13,14、我々は、触角葉のニューロン(昆虫の主嗅覚中枢AL)からマルチチャンネルの電気生理学的記録( 'GCMR "と呼ばれる)に結合し、ガスクロマトグラフィーを用いた方法を開発しました。この最先端の技術は、私たちは匂いの情報は昆虫脳の中でどのように表現されるかを調べることが可能になります。嗅覚処理のこのレベルの匂いに対する神経反応がALニューロンへのアンテナの受容ニューロンの収束の度合いに非常に敏感なせいであるので、さらに、ALの録音は自然な臭気の活性成分の検出を効率的かつ高感度にできるようになります。ここでは、GCMRを説明し、その使用例を与える。

いくつかの一般的な手順はinvolアール生理揮発性物質と昆虫応答の検出にVED。揮発性物質は、最初に興味のある情報源から収集します(この例では、我々は属Mimulus(Phyrmaceae)から花を使用)および標準のGC-MS技術を14-16を使用して、必要に応じて特徴づけする必要があります。昆虫は記録電極が神経録音が始まる触角葉およびマルチチャネルに挿入された後、最小限の切開を用いた研究のために準備されます。神経データの後処理はその後、特定の匂い物質は、昆虫の神経系で重要な神経反応を起こしているか明らかにする。

ここでお見せする例では、受粉の研究に固有のものですが、GCMRは試験生物と揮発性ソースの広い範囲に拡大することができます。たとえば、このメソッドは媒介昆虫と作物の害虫を集めたり反発臭気物質の識別に使用することができます。また、GCMRはまた、POと益虫に対して誘引を識別するために使用することができますllinators。技術は同様に非昆虫被験者に拡張される可能性があります。

Protocol

1。揮発性Follection

  1. この例では、Mから揮発性のサンプルを使用するlewisii花-カリフォルニア州に高山野草ネイティブ。揮発性物質をRiffell に従って動的吸着法を用いて収集れます14。簡単に説明すると、このメソッドは花がテフロン袋に囲まれている閉ループ捕捉システムを採用しています。不活性の真空ポンプを使用して、花の周りの空気がPorapak Q行列でいっぱいパスツールピペットからなる "トラップ"を介して吸引される。ポンプからの戻り空気は活性炭によってフィルタリングされます。所定時間後、私たちの場合24時間で、Porapak Q行列は、濃縮された抽出物を収集するために、非極性溶媒、典型的にはヘキサンで溶出させる。抽出液を-80℃·分析まで保存されます。必要であれば、サンプルが窒素ガス気流下で、分析の前に濃縮することができる。サンプルは、既に十分に特徴付けられていない限り、それを介してのアリコートを実行サンプルを使用する前に、揮発性成分を識別するために、ガスクロマトグラフ質量分析計(GC-MS)。

2。電気生理学的準備

  1. 千μlのピペットチップの先端から約1cmを切った。ピペットチップのベースにマルハナバチ( マルハナバチインパチェンス配置し、頭だけが露出するまでそっと先端の反対側の端に向かって押します。
  2. 歯科用ワックスを溶かすとセキュリティのための複眼の上にワックスが付着していることを確認して、露出した頭部のまわりでそれを成形し、完全に不動ハチの頭を作るために。ハチのアンテナの上に任意のワックスを取得しないようにしてください。
  3. ヘッドが固定されたら、カミソリの刃ブレーカまたはキューティクルをカットするメス適切なサイズを使用し、頭部カプセルに角、窓状、切り込みを入れる。ブレードブレーカを使用して、直ちにアンテナと複眼の1つに隣接後ろ、頭部カプセルの背側から開始します。カット1複眼から反対側の複眼に直線。反対複眼に直線をカットした後、その胸部に近い頭部カプセルカーブと終了するまで背側切開を作り始める。この時点で、頭部カプセルの反対側の端に向かってカットし始める。最後に、一度ラインが反対側の端にカットされており、初期の切開の開始位置に戻ってラインをカット。これは電極の挿入が妨げになるとして、それは、アンテナに隣接しているキューティクルを除去することが重要である。
  4. キューティクルがカットされたら、その後蜂の脳と、もっと重要なのは、触角葉を公開する必要があります蜂のキューティクルを除去するためにピンセットを使用しています。直ちに脳がdessicatedにならないように、昆虫生理食塩水で脳をsuperfusing始める。脳が露出した後、慎重に直ちに触角ローブの上に神経周囲シースを除去するために、非常に微細なピンセットを使用しています。非常に慎重にされないように鉗子で穿刺蜂の脳を。

3。マルチチャンネル録音付きガスクロマトグラフィ

  1. 蜂 "準備" - その脳が露出してチューブ内に固定 - 今電気生理学的記録の準備ができています。エアテーブル上に配置された磁気ベースに固定し、クランプで蜂を置きます。
  2. 生理食塩水が継続的に脳をsuperfusesように、IVバッグ、フローコントローラ、チューブ(昆虫生理食塩水で満たされた)に配置します。
  3. 蜂の目に、タングステン線で作られたマイクロマニピュレータ、insertareference電極を使用。
  4. 独立したマイクロマニピュレータを使用して、このようなコイル状のワイヤーテトロード、またはシリコンマルチチャネル電極(Neuronexusテクノロジーズ)として、多チャンネル電極を挿入 ハチの触角葉に。この電極は、TDT系のZバスbioampプロセッサへのTDTのシステムのS-3のZシリーズのように、前置増幅器に接続されています。ガスクロマトからの出力シールドBNCケーブルを経由してクロマトグラムの検出器は、神経とGC信号の両方が同期されているアンプやデータ·アクイジション·システムと接続することができます。
  5. 安定させるための神経録音の約30〜60分待ちます。自発的な活動と記録チャネルの単位の波形の形状が一貫になったら、蜂を刺激し、臭気に録音チャンネルの応答を観察するために臭気のシリンジを使用しています。
  6. 個々の記録チャンネル上の信号の3.5から5シグマによる自動しきい値記録チャネルによってニューロンから細胞外スパイクを記録します。マニュアルしきい値処理は、電気的ノイズからの汚染を避けるために、いくつかのチャネルが必要な場合があります。ニューロンからの活動電位は記録チャネルの電圧スパイクとして表示されます。チャネルの電圧がしきい値を超えると、システムはそれによってターキン、しきい値への到達前と後数ミリ秒をバッファし、保存しますgaは波形のスナップショット、またはスパイク。
  7. 直ちに空気テーブルの隣には、GCです。 GCに花のエキスを注入する前に、GC分析の温度上昇のための方法が正しいことを確認します。私たちの例では、10℃/分の速度で温度上昇が続く4分間50から始まる温度法°Cを使用します。 220℃我々は追加の6分のGCを保持し、その時点で、C。我々は、キャリアガスとしてヘリウムを、DB-5のGCカラム(J&Wサイエンティフィック、フォルサム、カリフォルニア州、米国)を使用します。入口は、200℃に設定した温度と、スプリットレスです水素炎イオン化検出器の温度を230℃に設定されている
  8. GCカラムに吸着した揮発性物質を解放するために、GCの加熱された注入口に花のヘッドスペースの抽出サンプルを注入します。カラムからの流出液は水素炎イオン化検出器(FID)とガラスの "Y"コネクター(J&W Scientific)を用いたミツバチアンテナとの間に1:1に分割されます。 RECを開始は、GCにサンプルを注入するように電極からディング。
  9. GCの実行が終了した後、5〜15分間準備休止してください。次に、いずれかGCに別のサンプルを注入したり、単一の揮発性化合物又は化合物の混合物を使用して準備を刺激する。準備を刺激するこの後者の方法では、一定の空気の流れから空気のパルスは、化合物が堆積されている上に濾紙を入れたガラスシリンジを介して転送されます。匂い刺激は、ソフトウェアによって制御ソレノイド活性化バルブによってパルスした。
  10. ユニット活動が突然停止し、または変更された場合は、生理的食塩水の点滴をチェックして、15分間の準備休止してください。自発的な活動はその前のレベルを回復しない場合は可能であればその後の準備は破棄され、別の蜂が使用されるべきである。
  11. 実験後、まだ組織内プローブを用いた20分間5%ホルマリンで脳を固定します。次に、消費税の脳そして4時間2%グルタルアルデヒドに置き、その後、段階的なエタノール脱水系列を行うとサリチル酸メチルと脳をクリアします。固定に基づいており、組織のクリア、電極が組織を穿刺アラバマ州の場所は、共焦点顕微鏡によって明確に識別する必要があります。

4。データ解析

  1. 記録された神経単位を分離し、同定するための実験の後に収集されたデータを分析します。このようなピークまたは谷振幅、ピーク半値幅などのスパイク形状、または減圧措置に基づいて別々の波形、または"スパイク"(主成分)17に代表的なソフトウェアプログラムを(オフラインソーター、MClust、そしてSClust)を使用し、18( 図2)。三次元空間で分離された(PC1〜PC3)と、互いに統計的に異なっているスパイクのだけそれらのクラスタを使用して(多変量ANOVA、P <0.05)( 図2)、さらなる分析のため。を参照してくださいテトロード記録とスパイクソーティング方法論の完全な説明については、引用#S 17から19。
  2. 各クラスタ内のタイム·スタンプスパイク、ラスタープロットと発火率応答( 図2、図3(a))を作成するためのMATLABまたはNeuroexplorer(NEXテクノロジーズウィンストンセーラム、ノースカロライナ州)を用いて、分析のためにこれらのデータをエクスポートします。
  3. 同時に記録GCデータを用いて揮発性成分の保持時間を特定します。それらの時点でユニットの応答を調べるために、クロマトグラムからピークの頂点によって決定揮発性物質の保持時間を使用します。
  4. GC分析を介して個々のユニットの応答を調べるために、100ミリ秒間隔でスパイクの数をbinおよび揮発性物質を溶出する保持時間を参照して、速度応答を焼成の時間経過を調べる。 100ミリ秒間隔でスパイクのビニングは、GCから溶出​​する匂い物質への神経応答の時間経過について、十分な詳細、または信号を提供します。
  5. EXAに異なる溶出揮発性物質への人口応答を採掘、前、3秒のサンプリング·ウィンドウの上に1.5秒を個々のユニットの発火率応答を統合し、1.5秒後の保持時間揮発性( 図3)。この期間は、GCから揮発性溶出の期間の典型です。我々は、色分けして(赤が高発射レート応答であり、青は低い応答です)によってユニットの速度応答を発射示し、(列)のGC排水にアンサンブル応答を表す各行が活性マトリックスとして、それらを配置する( 図3)。

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Representative Results

Mを使用GCMRアッセイでlewisiiフローラルの香りは、GCに抽出物の3μlを注入します。 GCを介して溶出する揮発性物質の総数は、一般的に60から70揮発性物質である。 Mの香りlewisiiは、 6 -炭素例えば、2 -ヘキサノールなどの揮発性物質、およびヘッドスペースの<1%を含むセスキテルから成る香りの残りの部分とは、β-ミルセン(非環式)およびα-ピネンなど、モノテルペノイドで構成されています。

GCMRは触角葉ニューロンの感度だけでなく、生物学的に重要な揮発性物質の神経処理を利用しています。しかし、このような性質のマルチチャンネル録音は、実質的には、触角葉の神経細胞のランダムなサンプルを取る。異なる製剤間のプローブ位置の位置のわずかな変化が異なるニューロンをサンプリングするために記録配列を引き起こす可能性があるためです。また、正確な位置とMo記録は、細胞外であるため、記録されたニューロンのrphologiesは不明である。これらの影響に対処するために、我々は、通常、各準備中に8〜18の神経単位と、8から16まで準備をGCMR実験を実行します。例示の目的のために、しかし、我々は1つだけ準備(8台)からのデータを使用します。

GCMR実験から、我々は、 図3Aに示すように、ユニットは、揮発性物質への応答に驚くほど選択的であることを見出した。下のトレースは、(黒)各ピークが時間をかけて検出器に到達されている与えられた揮発性に対応するイオンクロマトグラムを示すものである。上側のトレース(青)ユニットの発火率の応答を示しています。ユニットの応答はビニングにより、100ミリ秒間隔で生成スパイクの数を計算し、速度を生成するためにその期間で割った。この例では、神経単位は、D-リモネンに応じて選択的である。なお、このユニットでは、自発的firinグラム率は依然として変数およびランダムな変動の影響を受けることができます。それにもかかわらず、D-リモネンへの応答は時間を通して発射速度応答のばらつきによって計算され、よく95%信頼区間を上回った。

ていないすべてのユニットは、しかし、GCから溶出​​する揮発成分に反応した。実際には、各アンサンブルの記録単位の平均で約50%が無反応であった( 図3B)。これはGCから溶出​​している花のヘッドスペース中の揮発性化合物の多様性を与えられたことは驚くべきことである。しかし、アンサンブルで非応答単位の割合は、過去の研究13,14で見つかった調剤の間に驚くほど一貫しています。

単一ユニットのレスポンスを超え、GCMRシステムはまた、GCから溶出​​する匂い物質への人口レベルの応答の分析を可能にします。ここに示す例では、いくつかの匂い物質のグループのための強力なアンサンブルの選択があります( トランス-β-オシメン、)33と35は、アンサンブル内の各ユニットの正規化された発火率(カラースケール)で表される、アンサンブルで堅牢な応答を生成した。

図1
図1。ヘッドスペース吸着とGCMRシステムの概略図。()回路図では、花はテフロンバッグ内に囲まれており、真空ポンプを使用していて、袋から空気が集中するために揮発性トラップ(Porapak Q)を通って吸い込まれる揮発性物質を排出していた。空気を濾過し、同封の花に返されます(B)の花のヘッドスペースの抽出サンプルが注入されGCのedとカラムからの溶出液は、流れのように半分はどちらGCの水素炎イオン化検出器に入る分割され、排水の他の半分は、加熱移送ラインによって運ばれるとハチのアンテナで同時に到着します。 AL神経のアンサンブルから活動電位が連続的にGCを経由して臭気の配信の20分の間に細胞外に記録されます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

図2
図2単位のソートは蜂のALでマルチチャンネル録音アレイ(MR)を使って記録した。 2シャンクは、アレイがALの大ボリュームを包含するように離間している。(A)の波形特性( 例えばアンペアテトロード記録における各 "スパイク"のlitude、谷)が三次元空間にプロットすることができます。ここに示す例では、4つの録音チャンネル3の各スパイクの高さは3次元にプロットされます。各ユニットには独自のスパイク形状を持っているので、与えられたユニットからスパイクは、それによって単位を識別し、互いからソートすることができるように、ひとまとまりにします。糸球体と神経網を処理内で広いゾーンの記録を提供した各シャンク上の4つのチャネルの波形形状(C)位置決めソートされたユニットは、明確な発火応答の違い(ラスタープロットB)を示した。神経活動は、4つのチャネルのそれぞれに記録された(ように示されるように)3次元空間にプロットし、波形の特性に応じてソートされています拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

方法 "> 図3
図3。 ()Mから溶出する化合物の単位応答のレートのヒストグラムを焼成lewisiiヘッドスペース抽出(3μL注入)(下のトレース、黒)。特定の匂い物質( 例えば、D-リモネン、赤い矢印)単位で有意な応答を誘発GCから溶出した各匂い物質にMRから記録されたすべてのユニットの(B)の応答。表面プロットは、個々のユニットの正規化された発火率の応答に応じて色分けされています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

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Discussion

昆虫嗅覚媒介行動は、再生、ホストサイトの選択、適切な食糧資源の識別を含む多くの異なるプロセスを駆動する。これらのプロセスの研究では、光源から出射された揮発性物質と同様に、行動を媒介されるそれらの化合物を同定するための能力を識別する能力を必要とします。ややこしいことは臭いが一緒に個々の成分6,7,13,19,20とは異なる知覚される独特の香りを作成し、個々の化合物の数十〜数百から構成されているということです。最初は性フェロモンシステム12で、さらに最近では食品と産卵関連の匂い13,20で行われた研究では、混合物の行動の有効性は、混合物中のいくつかは、キーの揮発性物質の関数として存在し、ことが示されている混合物は、個々の成分よりも有意に大きい行動反応を引き出すこと。それらのキーを識別する成分は、このように現代の化学生態学ならびに嗅覚神経生物学の重要なコンポーネントです。

様々な技術は、昆虫の行動を駆動することを生物活性化合物の同定のための最後の50年の間に生じている。昆虫アンテナによる揮発性物質の検出のための主要な技術は、ガスクロマトグラフィー - electroantennography(GC-EAG)です。 EAGは、もともと一般的に刺激中の昆虫アンテナの先端とベースの間には多くの嗅覚ニューロンの電気depolarisationsが原因で発生することを想定し、小さな電圧変動を記録したシュナイダー21、によって開発されました。 EAGは後で触角応答12,22を引き出すヘッドスペース揮発性物質の正確な同定のためにGCと統合されました。また、昆虫のアンテナからの個々の受容ニューロンの記録は後で11,23を開発したもので、シングル感覚子録音、またはGC-SSRを提供するために、GCと相まって。 Although GC-SSRは録音は、GC-廃液に対応して活動電位を介して個々の細胞応答に関する情報を提供し、GC-EAGよりも時間がかかり、困難であること、および特定の化合物に特化して、これらの受容体の同定を可能にする24 GC-EAGでは見逃される可能性があります。

GC-EAGおよびGC-SSRのテクニックは周囲には反応を引き出すそれらの揮発性物質の同定を提供し、その結果臭剤受信に関与している。より最近の技術は哺乳類、昆虫の両方の中枢神経系での応答を調べる始めている、したがって、着臭剤知覚に関与している。 GC-I(ガスクロマトグラフィーイメージング)と直接電気生理学的方法( 例えば GCMR)と呼ばれるイメージング手法25:これらの技術は、大きく2つのカテゴリに分類されます。 GC-IとGCMRが原因投影、または出力に感覚ニューロンの収束、ニューロンのいくつかの利点を提供ALと同様、これらの方法は付臭剤は、昆虫の脳でどのように表現するかを決定することが許可されていること。また、同様の方法を今哺乳類の脳25で使用されている。

これらの利点にもかかわらず、GCMRおよびGC-私は同様の欠点を提供します。データ解析には時間がかかる場合があり、GCMRの場合には、記録された神経単位の糸球体突起が細胞外であるレコーディングのため不明である。また、昆虫のALは、このように記録されたユニットの識別が困難になる(LNS)投射ニューロン(PNS)と局所介在ニューロンを含むいくつかの異なるタイプの神経によって支配されています。しかし、蛾で、M. sexta、最近の仕事はPNおよびLNSがそれによって彼らの自発的活動26によりこれらのニューロンタイプの同定を可能にする、ニューロンのスパイク動作によって識別することができることを実証しています。それにもかかわらず、GCMRおよびGC-Iは、臭気物質の同定を可能にすることactivat強いEAG応答を引き出すだけでなく、脳の過程で揮発性物質をどのようにニューロンの人口を決定しない可能性のある電子専門の受容ニューロン。我々の予備的データはGCMRが生物活性であるが、抽出物中の微量レベル(Riffell未発表の結果)である化合物のGC-EAGよりも適していることを示唆しているが、これらの異なる手法を比較した研究はまだ行われていない。将来の仕事は異なる手法間の分析時間で生理臭気物質の検出感度のトレードオフを検討するかもしれません。

我々はBに使用アッセイ方法を詳述することにここに焦点を当てているがインパチェンス蜂Mから香りlewisii、抽出し、特定の変更が行われる場合に使用される昆虫種を変更することができます。昆虫種は、その大きさに応じて、異なるピペットチップ(10〜200μL)に配置することができます。蛾などの大型種、 マンドゥカsextaは、6ミリリットルサンプルバイアルに配置することができます。このようにして、準備することにより、安定したレコーディングの期間が数時間を可能生かされています。

化合物の単離のための分析方法は、生物活性化合物の同定のための昆虫脳現在の強力なツールで電気生理学的記録と一緒に、一緒になって、行動実験と並行して使用した場合、食品関連のための重要な揮発性物質を決定するための手段を提示してもよい昆虫13の行動だけでなく、ホストサイト2に関わる人々 、農業害虫や病気のベクトルのために重要である血液ホスト関連行動27。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、NSFの助成IOSの1121692で、ワシントンの研究財団の大学によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

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