Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

Neuroscience

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Summary

Spunti olfattivi mediare molti differenti comportamenti in insetti, e sono spesso miscele complesse costituite da decine a centinaia di composti volatili. Mediante gascromatografia con registrazione multicanale nel lobo insetto antennale, si descrive un metodo per l'identificazione di composti bioattivi.

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Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

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Abstract

Tutti gli organismi vivono in un mondo pieno di stimoli sensoriali che determinano la loro risposta comportamentale e fisiologica al loro ambiente. Olfatto è particolarmente importante negli insetti, che utilizzano i loro sistemi olfattivi di rispondere, e discriminare tra odori, stimoli complessi. Questi odori sollecitare comportamenti che mediano i processi come la riproduzione e la selezione dell'habitat 1-3. Inoltre, il rilevamento chimico di mediare insetti comportamenti che sono di grande importanza per l'agricoltura e la salute umana, compresa l'impollinazione 4-6, erbivori delle colture alimentari 7, e la trasmissione di malattie 8,9. Identificazione dei segnali olfattivi e il loro ruolo nel comportamento degli insetti è quindi importante per capire sia i processi ecologici e le risorse di cibo umano e il benessere.

Ad oggi, l'identificazione di sostanze volatili che guidano il comportamento degli insetti è stato difficile e spesso noioso. Le tecniche attuali sonogas cromatografia-coupled registrazione electroantennogram (GC-EAG), e gas cromatografia accoppiata singole registrazioni sensillum (GC-SSR) 10-12. Queste tecniche rivelato fondamentale per l'identificazione di composti bioattivi. Abbiamo messo a punto un metodo che utilizza la gascromatografia accoppiata a multicanale registrazioni elettrofisiologiche (definito 'GCMR') dai neuroni nel lobo antennale (AL; principale centro olfattivo degli insetti) 13,14. Questo stato-of-the-art tecnica permette di sondare come informazioni odore viene rappresentata nel cervello insetto. Inoltre, poiché le risposte neurali agli odori a questo livello di elaborazione olfattiva sono causa molto sensibili al grado di convergenza dei neuroni recettori dell'antenna in neuroni AL, AL registrazioni permetterà di costituenti attivi di odori naturali efficiente e con elevata sensibilità. Qui descriviamo GCMR e dare un esempio del suo utilizzo.

Diversi passaggi generali sono coinved nella rilevazione di sostanze volatili bioattivi e risposta insetti. Volatili necessario prima di essere raccolti da fonti di interesse (in questo esempio si usa fiori dal genere Mimulus (Phyrmaceae)) e caratterizzata, se necessario utilizzando le normali tecniche di GC-MS 14-16. Insetti sono preparati per studio utilizzando dissezione minima, dopo di che un elettrodo di registrazione viene inserito nel lobo antennale e multi-canale neurale inizia. Post-processing dei dati neurali poi rivela che odori particolari causare notevoli risposte neurali del sistema nervoso degli insetti.

Anche se l'esempio che presentiamo qui è specifico per gli studi di impollinazione, GCMR può essere estesa ad una vasta gamma di organismi di studio e fonti volatili. Per esempio, questo metodo può essere utilizzato per l'identificazione di odoranti attrarre o respingere insetti vettori ei parassiti delle piante. Inoltre, GCMR può anche essere utilizzato per identificare attrattivi per gli insetti benefici, come Pollinators. La tecnica può essere estesa a soggetti non-insetti pure.

Protocol

1. Follection volatile

  1. In questo esempio, usiamo campioni volatili da M. fiori lewisii - un nativo alpino wildflower in California. Volatili vengono raccolti con metodi dinamici di assorbimento secondo Riffell et al. 14. In breve, questo metodo impiega un sistema di condensazione ad anello chiuso in cui sono racchiusi i fiori in un sacchetto di Teflon. Utilizzando una pompa a vuoto inerte, l'aria intorno ai fiori viene aspirata attraverso una "trappola" composto da una pipetta Pasteur riempito con Porapak Q matrice. L'aria di ritorno dalla pompa viene filtrata dal carbone attivo. Dopo un periodo di tempo prescritto, nel nostro caso 24 h, la Porapak Q matrice viene eluito con un solvente non polare, tipicamente esano, per raccogliere l'estratto concentrato. L'estratto viene quindi memorizzato in -80 ° C fino all'analisi. Se necessario, i campioni possono essere concentrato prima dell'analisi sotto flusso di azoto. A meno che il campione è già ben caratterizzata, eseguire una aliquota di esso attraverso unagas cromatografo-spettrometro di massa (GC-MS) per identificare i componenti volatili prima di utilizzare il campione.

2. Preparazione elettrofisiologica

  1. Tagliare circa 1 cm dall'estremità di una punta di pipetta 1000 microlitri. Mettere un calabrone (Bombus impatiens) nella base della punta della pipetta e spingere delicatamente verso l'estremità opposta della punta fino a che solo la testa è esposta.
  2. Fondere la cera dentale e plasmarlo intorno alla testa esposta, facendo in modo che aderisca cera sul occhi composti per la sicurezza e per rendere la testa dell'ape completamente immobile. Assicurarsi di non avere la cera sul antenna delle api.
  3. Una volta che la testa è sicuro, fare una, piazza finestra tipo, incisione nella capsula testa con una lama di rasoio automatico o la dimensione appropriata bisturi per tagliare la cuticola. Utilizzando la lama dell'interruttore, partire dal lato dorsale della capsula testa, immediatamente dietro l'antenna e adiacente a uno degli occhi composti. Tagliouna linea retta, composto da un occhio all'occhio composto controlaterale. Dopo il taglio di una linea retta per l'occhio composto contrario, cominciare a fare un'incisione sul dorso fino a quando le curve capsula testa e finisce vicino al suo torace. A questo punto, comincia a tagliare verso l'estremità opposta della capsula testa. Infine, una volta che la linea è stata tagliata all'estremità opposta, tagliare una linea indietro fino alla posizione di partenza della incisione iniziale. È importante rimuovere la cuticola che è adiacente all'antenna, poiché ciò impedirà l'inserimento dell'elettrodo.
  4. Una volta che la cuticola è tagliato, usare un paio di pinze per rimuovere la cuticola delle api, che dovrebbe quindi esporre il cervello delle api e, soprattutto, i lobi antennali. Iniziare immediatamente superfusing cervello con soluzione salina insetto, in modo che il cervello non diventa essiccato. Dopo il cervello è esposto, accuratamente usare un paio di pinze molto fini per rimuovere la guaina perineurale immediatamente sopra i lobi antennali. Fare molta attenzione a nonperforare il cervello dell'ape con le pinze.

3. Gascromatografia con Multi-channel di registrazione

  1. La "preparazione" ape - fissata in un tubo con il suo cervello esposto - è ora pronto per la registrazione elettrofisiologica. Posizionare l'ape in un morsetto, fissati ad una base magnetica che si trova su un tavolo aria.
  2. Organizzare una sacca IV, regolatore di flusso, e tubi (riempito con soluzione fisiologica insetto) in modo che la soluzione salina superfuses continuamente il cervello.
  3. Utilizzando un micromanipolatore, elettrodo insertareference, fatto di filo di tungsteno, nell'occhio dell'ape.
  4. Utilizzando un micromanipolatore separato, inserire l'elettrodo multicanale, ad esempio un tetrodo filo a spirale, o silicio multicanale elettrodo (NeuroNexus Technologies), nei lobi antennali delle api. Questo elettrodo è collegato ad un pre-amplificatore, come il sistema TDT S-3 serie Z alla Z-bus processore bioamp del sistema TDT. Uscita dal Chro GasRilevatore di matogram tramite un cavo schermato BNC può essere interfacciato con il sistema di acquisizione dati amplificatore e tale che sia il segnale neurale e GC è sincronizzato.
  5. Attendere circa 30-60 minuti per le registrazioni neurali per stabilizzare. Una volta che l'attività spontanea e la forma d'onda delle quote dei canali di registrazione sono diventati coerente, utilizzare una siringa odore di stimolare l'ape ed osservare la risposta dei canali di registrazione per l'odore.
  6. Registrare picchi extracellulari di neuroni da auto-sogliatura i canali di registrazione da 3,5-5 sigma del segnale sui canali di registrazione individuali. Soglia manuale può essere richiesto per alcuni canali per evitare la contaminazione da disturbi elettrici. I potenziali d'azione di neuroni appaiono come picchi di tensione nel canale di registrazione. Quando la tensione del canale supera la soglia, il sistema di buffer e salva i pochi millisecondi prima e dopo l'attraversamento della soglia, così takinga istantanea della forma d'onda, o di picco.
  7. Immediatamente accanto al tavolo aria è il GC. Prima di iniettare l'estratto floreale nel GC, assicurarsi che il metodo per la rampa di temperatura della corsa GC è corretto. Nel nostro esempio, si utilizza un metodo di temperatura iniziale a 50 ° C per 4 min seguita da un aumento di temperatura ad una velocità di 10 ° C / min. a 220 ° C, momento in cui teniamo la GC per altri 6 min. Usiamo una colonna DB-5 GC (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), con elio come gas di trasporto. L'ingresso è splitless, con una temperatura impostata a 200 ° C. Il rilevatore a ionizzazione di fiamma temperatura è impostato a 230 ° C.
  8. Iniettare il campione estratto lo spazio di testa floreale nella porta di iniezione riscaldata del GC per rilasciare le sostanze volatili adsorbiti nella colonna GC. L'effluente dalla colonna è divisa 1:1 tra il Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) e l'antenna ape con una lente di "Y" (J & W Scientific). Inizia recording dall'elettrodo durante l'iniezione di un campione nel GC.
  9. Al termine della corsa GC ha finito, lasciate riposare la preparazione per 5 a 15 minuti. Allora o somministrazione di un altro campione nel GC o stimolare la preparazione con singoli composti volatili o miscele di composti. In questo secondo metodo di stimolare la preparazione, impulsi di aria da un flusso d'aria costante vengono deviati attraverso una siringa di vetro contenente un pezzo di carta da filtro in cui i composti sono stati depositati. Lo stimolo odore era impulsi mediante un solenoide attivato valvola controllata dal software.
  10. Se l'attività unità si ferma improvvisamente o modifiche, consultare il fleboclisi e lasciate riposare la preparazione per 15 minuti. Se l'attività spontanea non ritrovare il suo livello precedente il preparato deve essere eliminato e un'altra ape utilizzata, se disponibile.
  11. Dopo l'esperimento, fissare il cervello con formalina al 5% per 20 minuti con la sonda ancora nel tessuto. Avanti, accisa il cervelloe metterlo in glutaraldeide al 2% per 4 ore, e successivamente fare una serie graduata di etanolo disidratazione e cancellare il cervello con salicilato di metile. In base alla fissazione e di compensazione del tessuto, le posizioni nel AL cui gli elettrodi perforato il tessuto deve essere chiaramente distinguibile mediante microscopia confocale.

4. Analisi dei dati

  1. Analizzare i dati raccolti dopo l'esperimento di separare e identificare le unità registrate neurali. Utilizzare programmi software tipici (Sorter Offline, MClust e SClust) per forme d'onda separate, o "picchi", basata su forme a spillo, come picco o valle ampiezza picco a metà larghezza, ecc, o misure ridotte (componenti principali) 17 , 18 (Figura 2). Utilizzare solo quei cluster di picchi che separati in uno spazio tridimensionale (PC1-PC3) e sono statisticamente diversi tra loro (ANOVA multivariata; p <0,05) (Figura 2) per ulteriori analisi. Si prega di fare riferimento alcitazione # s 17-19 per la descrizione completa di registrazione tetrodo e spike-ordinamento metodologie.
  2. Time-stamp picchi di ciascun cluster, ed esportare questi dati per l'analisi utilizzando MATLAB o Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) per creare grafici raster e le risposte dei tassi di cottura (figure 2, 3A).
  3. Identificare i tempi di ritenzione dei volatili utilizzando i dati simultaneamente registrati GC. Utilizzare i tempi di ritenzione dei volatili, determinate dal vertice del picco del cromatogramma, per esaminare i unitari a quei punti temporali.
  4. Per esaminare le risposte per singola unità attraverso la corsa GC, bin il numero di punte in 100 msec ed esaminare il time-course di sparare risposte a tasso con riferimento al tempo di ritenzione di eluizione volatili. Il binning dei picchi in 100 msec fornisce dettagli sufficienti, o segnale, in merito ai tempi corso della risposta neuronale a un odorizzante eluizione dal GC.
  5. Per exaestrarre le risposte della popolazione al volatiles eluizione differenti, introdurre le risposte di frequenza di attivazione di singole unità su una finestra di campionamento 3 sec, 1.5 sec prima e dopo 1,5 secondi, il tempo di ritenzione del volatile (Figura 3). Questo periodo di tempo è tipico della durata di un eluizione volatile dalla GC. Mostriamo sparare risposte a tasso delle unità di codifica a colori delle loro (il rosso è un alto tasso di risposta fuoco, blu, è una risposta bassa) e l'organizzazione come una matrice attività con ogni riga che rappresenta la risposta insieme al effluente GC (colonne) ( figura 3).

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Representative Results

Nel saggio GCMR utilizzando il M. lewisii profumo floreale, abbiamo iniettare 3 ml di estratto nel GC. Il numero totale di sostanze volatili di eluizione attraverso il GC è in genere 60-70 volatili. Il profumo di M. lewisii è prevalentemente composta monoterpenoids, compresi β-mircene (aciclico) e α-pinene, con il resto del profumo composto di sei atomi di carbonio volatili, come 2-esanolo e sesquiterpenoidi che compongono <1% di spazio di testa.

GCMR sfrutta la sensibilità dei neuroni lobi antennali nonché l'elaborazione neuronale di volatili biologicamente importanti. Tuttavia, registrazioni multicanale di questo tipo, in effetti, prendere un campione casuale di neuroni nel lobo antennale. Questo perché piccole variazioni della posizione della posizione della sonda tra diverse preparazioni possono causare l'array di registrazione per campionare neuroni differenti. Inoltre, le posizioni esatte e morphologies dei neuroni registrati non sono noti perché la registrazione è extracellulare. Per accogliere per questi effetti, abbiamo tipicamente eseguire esperimenti GCMR 8 a 16 preparazioni, con 8 a 18 unità neurali in ciascun preparato. Per scopi di illustrazione, tuttavia, useremo i dati da una sola preparazione (8 unità).

Dagli esperimenti GCMR, abbiamo trovato che le unità sono sorprendentemente selettivi nella loro risposta al volatili, come illustrato nella figura 3A. La traccia inferiore (in nero) indica il cromatogramma ionico, dove ogni picco corrisponde a un instabile, visto che è in arrivo al rivelatore nel tempo. La traccia superiore (blu) mostra le risposte in frequenza di attivazione di una unità. Risposte unitari sono stati calcolati binning il numero di punte prodotte in un intervallo di 100 msec, e dividendo per questo arco di tempo per produrre la velocità. Nell'esempio, l'unità neurale è selettivo in risposta a D-limonene. Si noti che, in questa unità, il firin spontaneatasso di g può essere ancora variabile e soggetto a fluttuazioni casuali. Tuttavia, le risposte a D-limonene erano ben al di sopra dell'intervallo di confidenza del 95%, come calcolato dalla varianza nelle risposte frequenza di scarica nel tempo.

Non tutte le unità, tuttavia, ha risposto ai volatili eluiti dal GC. Infatti, in media circa il 50% delle unità registrate in ogni insieme erano insensibili (Figura 3B). Ciò è sorprendente, data la diversità dei composti volatili nello spazio di testa floreale che sono eluizione dal GC. Tuttavia, la percentuale di unità che non rispondono in un insieme è sorprendentemente coerente tra preparativi, come si trova in studi precedenti 13,14.

Oltre le risposte di singole unità, il sistema GCMR consente anche l'analisi di livello di popolazione risposte alle odoranti eluiti dal GC. Nell'esempio mostrato qui, non c'è selettività insieme forte per un gruppo di odori diversi ( trans-β-Ocimene, rispettivamente) prodotta risposte robuste nell'insieme, come rappresentato dal tasso cottura normalizzato di ciascuna unità nell'insieme (scala di colore).

Figura 1
Figura 1. Diagramma schematico di spazio di testa assorbimento e il sistema GCMR. (A) Nello schema, un fiore è racchiuso all'interno di un sacchetto di Teflon, e utilizzando una pompa a vuoto, l'aria dal sacchetto viene aspirata attraverso una trappola volatile (Porapak Q), per concentrare il emessa volatili. L'aria viene filtrata e restituita al fiore allegata. (B) Il campione estratto lo spazio di testa floreale è iniettareed in GC e l'effluente dalla colonna è divisa in modo tale che la metà del flusso entra o del GC rivelatore a ionizzazione di fiamma, e l'altra metà dell'effluente è portato da una linea di trasferimento riscaldata e arriva simultaneamente antenna dell'ape. I potenziali d'azione del complesso AL neurale vengono registrate in continuo extracellulare durante il minuto 20 di consegna odore via GC. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. Ordinamento delle unità registrate utilizzando il multi-canale matrice registrazione (MR) in AL dell'ape. I due steli sono distanziati in modo tale che la matrice comprende un grande volume della AL. (A) La caratteristica forma d'onda (ad esempio amp litude, valle) di ogni "spike" nella registrazione tetrodo possono essere tracciati in uno spazio tridimensionale. Nell'esempio qui illustrato, l'altezza di ciascun picco in 3 dei 4 canali di registrazione è tracciata in 3-D. Perché ogni unità avrà una sua forma spike, le punte di una data unità si raggruppano, consentendo in tal modo le unità da identificare e ordinati l'uno dall'altro. Unità di visualizzazione mostrato evidenti differenze nelle risposte di cottura (B; trama raster) e la forma d'onda (C) Posizionamento dei quattro canali su ogni gambo forniti registrazione di ampie zone in trasformazione glomeruli e neuropilo. Attività neurale è stata registrata su ciascuno dei quattro canali, tracciati in 3-dimensionale spazio (come indicato in A), e ordinati in base alle caratteristiche di forma d'onda. Clicca qui per ingrandire figura .

modi "> Figura 3
Figura 3. (A) Firing istogrammi della frequenza di risposte dell'unità ai composti eluiti dalla M. lewisii spazio di testa estratto (l'iniezione di 3 microlitri) (linea di fondo, nero). Odoranti Alcuni (ad esempio, D-limonene, freccia rossa) evocato risposte significative in unità (B) Risposta di tutte le unità che sono state registrate dal MR per ogni odorizzante eluito dalla GC.. La trama di superficie è un colore in base alle risposte normalizzati frequenza di scarica delle singole unità. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Insetti olfatto-mediate comportamenti guidare molti processi diversi, tra cui la riproduzione, host-selezione del sito, e l'individuazione di risorse alimentari adeguate. Lo studio di questi processi richiede la capacità di identificare i composti volatili emessi dalla sorgente, così come la capacità di identificare i composti che vengono mediano i comportamenti. A complicare le cose è che gli odori sono costituiti da decine a centinaia di singoli composti che insieme creano un profumo unico che viene percepito diversamente i singoli costituenti 6,7,13,19,20. Ricerca, inizialmente condotta nel sistema feromone sessuale 12, e più recentemente in odori alimentari e ovideposizione connesse 13,20, ha dimostrato che l'efficacia comportamentale della miscela risiede in funzione di qualche chiave, volatili nella miscela, e che le miscele di suscitare risposte significativamente maggiori comportamentali rispetto ai singoli componenti. Identificare quelli chiavecomponenti è quindi una componente importante nella moderna ecologia chimica e neurobiologia olfattivo.

Una varietà di tecniche sono sorti negli ultimi 50 anni per l'identificazione di composti bioattivi che guidare il comportamento degli insetti. La tecnica principale per la rilevazione delle sostanze volatili dalla antenna insetto è gas-cromatografia electroantennography (GC-EAG). GAE è stato originariamente sviluppato da Schneider 21 anni, che ha registrato piccole fluttuazioni di tensione in genere presume essere causata da depolarizzazione elettrica di molti neuroni olfattivi tra la punta e la base di una antenna insetto durante la stimolazione. GAE è stato successivamente integrato con il GC per l'identificazione precisa dei volatili dello spazio di testa che suscitano risposte antennali 12,22. Inoltre, la registrazione di singoli neuroni recettori dall'antenna insetto è stata poi sviluppata 11,23 e accoppiato con il GC per fornire singolo sensillum registrazioni o GC-SSR. Lanche se GC-SSR è più tempo ed è difficile che GC-EAG, le registrazioni forniscono informazioni in merito alle risposte delle singole celle tramite potenziali d'azione in risposta ai GC-effluenti, e permette l'identificazione di quei recettori che sono specializzati per particolari composti che potrebbe perdere da GC-EAG 24.

La GC-EAG e GC-SSR tecniche offrono l'identificazione di quei volatili che suscitano risposte alla periferia, e sono quindi coinvolte nella ricezione odorizzante. Le tecniche più recenti hanno iniziato a esaminare le risposte del sistema nervoso centrale dei mammiferi e insetti, e sono quindi coinvolte nella percezione odorizzante. Queste tecniche si dividono in due grandi categorie: metodi di imaging chiamato GC 25-I (gas cromatografia-imaging) e dirette (ad esempio i metodi elettrofisiologici GCMR). GC-I e GCMR offrono diversi vantaggi per la convergenza dei neuroni sensoriali alla proiezione, o di uscita, neuroniAL, nonché che questi metodi permettono la determinazione di come odoranti sono rappresentati nel cervello insetto. Inoltre, metodi simili vengono ora utilizzati nel cervello dei mammiferi 25.

Nonostante questi vantaggi, GCMR e GC-Offro svantaggi pure. Analisi dei dati può richiedere molto tempo, e nel caso del GCMR, proiezioni glomerulari delle unità registrate neurali sono noti per le registrazioni essendo extracellulare. Inoltre, l'insetto AL è innervato da vari tipi neuronali inclusi neuroni di proiezione (PN) e interneuroni locali (LN) rendendo identificazione delle unità registrate difficili. Tuttavia, la falena, M. sexta, lavoro recente ha dimostrato che PN e LNS possono essere identificati dal comportamento spiking dei neuroni, permettendo quindi l'identificazione di questi tipi di neuroni dalla loro attività spontanea 26. Tuttavia, GCMR e GC-I consente l'identificazione delle odoranti che attivataneuroni recettori elettronici specializzati che non possono suscitare risposte EAG forti, oltre a determinare come la popolazione di neuroni nel processo cervello le sostanze volatili. Uno studio di confronto tra queste differenti metodologie non è stato ancora effettuato, anche se i nostri dati preliminari suggeriscono che il GCMR può essere più adatto rispetto al GC-EAG per questi composti bioattivi che sono, ma sono a livello di tracce nell'estratto (Riffell risultati non pubblicati). Il lavoro futuro può esaminare il trade-off nella sensibilità di rilevare odoranti bioattivi con il tempo di analisi tra le diverse metodologie.

Anche se ci siamo concentrati qui in dettaglio i metodi di analisi che utilizziamo per B. api impatiens e il profumo da M. lewisii, l'estratto e le specie di insetti utilizzati possono essere modificate se alcune modifiche sono fatti. Specie di insetti possono essere posizionati in puntali differenti (da 10 a 200 pl) a seconda della loro dimensione. Specie più grandi, come la falena, ManducaSexta, può essere collocato in 6 fiale ml di campione. In tal modo, il preparato viene mantenuto vivo consentendo registrazioni stabili diverse ore di durata.

Nel loro insieme, i metodi analitici per l'isolamento di composti insieme con registrazioni elettrofisiologiche cerebrali negli insetti presenti potenti strumenti per l'identificazione di composti bioattivi, e se usato in tandem con esperimenti comportamentali, può costituire un mezzo per determinare volatili importanti legati all'alimentazione comportamenti negli insetti 13, così come coloro che sono coinvolti in host-sito 2, e il sangue-host comportamenti correlati 27 che sono importanti per i parassiti agricoli e vettori della malattia.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere IOS 1121692, e dalla University of Research Foundation di Washington.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

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