Identifikation af olfaktoriske Flygtige stoffer ved hjælp af gaskromatografi-Multi-unit Recordings (GCMR) i Insect Antennal Lobe

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Olfaktoriske stikord medierer mange forskellige adfærd hos insekter, og er ofte komplekse blandinger bestående af snesevis til hundredvis af flygtige forbindelser. Anvendelse af gaskromatografi med flere kanaler optagelse i insekt antennal lap, beskriver vi en fremgangsmåde til identifikation af bioaktive forbindelser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Alle organismer bebor en verden fuld af sensoriske stimuli, der bestemmer deres adfærdsmæssige og fysiologiske respons på deres omgivelser. Lugtesansen er især vigtigt i insekter, som bruger deres olfaktoriske system til at reagere på, og diskriminere blandt, komplekse lugt stimuli. Disse lugte fremkalde adfærd, som medierer processer såsom reproduktion og levesteder udvælgelse 1-3. Derudover kemiske optagelser fra insekter medierer adfærd, der har stor betydning for landbruget og menneskers sundhed, herunder bestøvning 4-6, herbivory af fødevareafgrøder 7, og overførsel af sygdomme 8,9. Identifikation af olfaktoriske signaler og deres rolle i insekt adfærd er således vigtigt for forståelsen både økologiske processer og fødevarer ressourcer og velbefindende.

Hidtil har identifikationen af ​​flygtige stoffer, som driver insekt adfærd været vanskeligt og ofte kedelig. Aktuelle teknikker indbefattergaskromatografi-koblet electroantennogram optagelse (GC-EAG), og gaskromatografi-koblede enkelt sensillum optagelser (GC-SSR) 10-12. Disse teknikker viste sig at være afgørende i identifikationen af ​​bioaktive stoffer. Vi har udviklet en metode, der benytter gaschromatografi koblet til multi-kanal elektrofysiologiske optagelser (benævnt »GCMR«) fra neuroner i antennal lap (AL, insektet primære olfaktoriske center) 13,14. Denne state-of-the-art teknik giver os mulighed for at undersøge hvordan lugt information er repræsenteret i insektet hjernen. Endvidere, fordi neurale reaktioner på lugte på dette niveau af olfaktoriske behandling er meget følsomme på grund af graden af ​​konvergens af antennens receptor neuroner i AL neuroner, vil AL-optagelser tillade påvisningen af ​​aktive bestanddele i naturlige lugte effektivt og med høj følsomhed. Her beskriver vi GCMR og give et eksempel på dets anvendelse.

Adskillige generelle trin er involat the i afsløring af bioaktive flygtige stoffer og insekt respons. Flygtige først skal indsamles fra kilder af interesse (i dette eksempel bruger vi blomster fra slægten Mimulus (Phyrmaceae)) og karakteriseres efter behov ved hjælp af standard GC-MS-metoder 14-16. Insekter er forberedt til studie med minimal dissektion, hvorefter en optagelse elektrode sættes ind i antennal lap og multi-kanal neural optagelse begynder. Post-behandling af de neurale data derefter afslører, hvilke specifikke lugtstoffer medføre betydelige neurale reaktioner fra insektet nervesystemet.

Selvom eksemplet præsenterer vi her er specifikt for bestøvning undersøgelser, kan GCMR udvides til en lang række studier organismer og flygtige kilder. For eksempel kan denne fremgangsmåde anvendes til identifikation af lugtstoffer der tiltrækker eller frastøder insekter og skadedyr i afgrøden. Desuden kan GCMR også anvendes til at identificere tiltrækningsmidler for gavnlige insekter såsom pollinators. Teknikken kan udvides til ikke-insektceller emner også.

Protocol

1. Flygtig Follection

  1. I dette eksempel anvender vi flygtige prøver fra M. lewisii blomster - en alpin wildflower indfødte til Californien. Flygtige stoffer opsamles ved hjælp af dynamiske sorption fremgangsmåder ifølge Riffell et al. 14. Kort fortalt er denne fremgangsmåde anvender et lukket kredsløb trapping system, hvor blomsterne er omgivet af en Teflon pose. Ved hjælp af en inert vakuumpumpe, er luften omkring blomsterne suges gennem en "fælde" består af en Pasteur-pipette fyldt med Porapak Q matrix. Returluften fra pumpen filtreres med aktiveret trækul. Efter et foreskrevet tidsrum, i vores tilfælde 24 timer er Porapak Q matrix elueret med et ikke-polært opløsningsmiddel, typisk hexan til opsamling af den koncentrerede ekstrakt. Ekstrakten lagres derefter i -80 ° C indtil analyse. Om nødvendigt kan prøverne koncentreres før analyse under en strøm af nitrogengas. Medmindre prøven allerede er velkarakteriserede, køre en portion af det gennem etgaskromatograf-massespektrometer (GC-MS) for at identificere flygtige komponenter før anvendelse af prøven.

2. Elektrofysiologiske Forberedelse

  1. Skåret 1 cm fra enden af ​​en 1.000 pi pipettespids. Anbring en humlebi (Bombus Impatiens) i bunden af pipettespidsen og forsigtigt skubbe mod den modsatte ende af spidsen indtil kun hovedet er udsat.
  2. Smelt dentalvoks og forme det omkring den udsatte hoved, og sørg for, at de voks klæber over på de sammensatte Øine for sikkerhed og gøre biens hoved helt ubevægelig. Vær sikker på ikke at få nogen voks på antenne bi.
  3. Når hovedet er sikker, lave en firkant, vindue-lignende indsnit ind i hovedet kapsel med en barberblad-breaker eller den passende størrelse skalpel til at skære neglebånd. Ved hjælp af blad-breaker, starte fra den dorsale side af hovedet kapsel, umiddelbart bag antennen og grænsende op til en af ​​de sammensatte øjne. Klipen ret linie, fra en forbindelse øje til den kontralaterale forbindelse øjet. Efter at skære en lige linje til den modsatte sammensatte øje, begynde at gøre et snit dorsalt indtil hovedet kapsel kurver og ender tæt på sin brystkasse. På dette tidspunkt begynder at skære mod den modsatte ende af hovedet kapslen. Endelig, når en linie er blevet skåret til den modsatte ende, skæres en linje tilbage til udgangspositionen af ​​det oprindelige snit. Det er vigtigt at fjerne den kutikula, som støder op til antennen, da dette vil hindre insertion af elektroden.
  4. Når kutikula skæres, anvende en pincet til at fjerne bi kutikula, som derefter udsættes biens hjernen og, mere vigtigt, de antennal lapper. Umiddelbart begynde superfusing hjernen med insekt saltvand, så hjernen ikke bliver udtørret. Når hjernen er udsat for, omhyggeligt bruge et par meget fine tænger til fjernelse af perineural hylsteret umiddelbart over antennal lapper. Vær meget forsigtig med ikke atpunktere biens hjerne med pincetten.

3. Gaskromatografi med Multi-channel Recording

  1. Bien "præparat" - fikseret i et rør med udsatte sin hjerne - er nu klar til elektrofysiologisk optagelse. Anbring bi i en klemme, der er fastgjort til en magnetisk base, der er placeret på et luftbord.
  2. Arrangere en IV pose, strømningsregulator, og slangen (fyldt med insekt saltvand), således at saltvand kontinuerligt superfuses hjernen.
  3. Ved hjælp af en mikromanipulator, insertareference elektrode, lavet af wolfram tråd, ind i bi øje.
  4. Anvendelse af en separat mikromanipulator, af multi-channel elektrode indsættes, såsom en coiled wire tetrode eller silicium flere kanaler elektrode (Neuronexus Technologies), ind i de antennal kamre af bi. Denne elektrode er forbundet til en forforstærker, såsom TDT systemets S-3 Z serier til Z-bus bioamp processor i TDT-systemet. Output fra Gas Chromatogram s detektor via et skærmet BNC-kabel kan være forbundet med forstærkeren og dataopsamlingssystem, således at både det neurale og GC signal er synkroniseret.
  5. Vent cirka 30-60 minutter for de neurale optagelser for at stabilisere. Når den spontane aktivitet og bølgeform af andele i optagelse kanaler er blevet konsekvent, skal du bruge en lugt sprøjte til at stimulere bi og observere svaret fra optagelse kanaler til lugt.
  6. Optag ekstracellulære spidser fra neuroner ved auto-tærskling af optagekanaler ved 3,5-5 sigma af signalet på de enkelte optagelse kanaler. Manuel tærskelværdiansættelse kan være påkrævet for en række kanaler for at undgå forurening fra elektrisk støj. De virkningspotentialer fra neuroner vises som spændingsspidser i optagelsen kanal. Når kanalens spændingen overstiger tærsklen, systemet buffere og gemmer få millisekunder før og efter passage af tærsklen, hvorved takinga snap-shot af kurveformen, eller spike.
  7. Umiddelbart ved siden af ​​luftbordet er GC. Før indsprøjtning af blomster ekstrakt i GC, så sørg for, at metoden til temperatur rampe af GC run er korrekt. I vores eksempel bruger vi en temperatur fremgangsmåde startende ved 50 ° C i 4 min efterfulgt af en forøgelse af temperaturen med en hastighed på 10 ° C / min. til 220 ° C, på hvilket tidspunkt man holder GC i yderligere 6 min. Vi anvender en DB-5 GC-kolonne (J & W Scientific, Folsom, CA, USA) med helium som bæregas. Indløbet er splitless, med en temperatur sat til 200 ° C. The flammeioniseringsdetektor temperaturen er sat til 230 ° C.
  8. Injicer ekstrakt prøve af blomster headspace i den opvarmede indsprøjtning port GC til at frigive de adsorberede flygtige stoffer i GC-kolonne. Effluenten fra kolonnen er opdelt 1:01 mellem flammeionisationsdetektor (FID) og bi-antenne med en glas-"Y"-stik (J & W Scientific). Begynd recOrding fra elektroden som man injicere en prøve i gaskromatografen.
  9. Efter at GC kørslen er færdig, lad forberedelse hvile i 5 til 15 min. Derefter enten injicere en anden prøve i GC eller stimulere præparatet med enkelt flygtige forbindelser eller blandinger af forbindelser. I sidstnævnte fremgangsmåde til stimulering af præparatet, er impulser af luft fra en konstant luftstrøm ledes gennem en glassprøjte indeholdende et stykke filtrerpapir, hvor forbindelserne er deponeret. Lugten stimulus blev pulseret ved hjælp af en solenoide-aktiveret ventil styres af softwaren.
  10. Hvis enhed aktivitet pludselig stopper eller ændringer, skal du kontrollere saltvand drop og lad forberedelse hvile i 15 min. Hvis den spontane aktivitet ikke genvinde sit tidligere niveau så præparatet bør kasseres og en anden bi anvendes, hvis tilgængelig.
  11. Efter forsøget fiksere hjernen med 5% formalin i 20 minutter med sonden stadig i vævet. Next, udskære hjernenog placere den i 2% glutaraldehyd i 4 timer, og derefter gøre en gradueret ethanol dehydrering serier og rydde hjernen med methylsalicylat. Baseret på fastsættelse og clearing af vævet, de steder i AL, hvor elektroderne punkteret vævet skal være tydeligt synlige ved konfokal mikroskopi.

4. Dataanalyse

  1. Analyser indsamlede data efter eksperimentet at udskille og identificere de registrerede neurale enheder. Brug typiske softwareprogrammer (Offline sorteringsanlæg, MClust, og SClust) til særskilt kurveformer, eller "spikes", baseret på spike former, såsom peak eller dal amplitude, peak halv bredde, etc., eller reducerede foranstaltninger (hovedkomponenter) 17 , 18 (fig. 2). Kun anvende de klynger af pigge, der er adskilt i tredimensionalt rum (PC1-PC3) og er statistisk forskellige fra hinanden (multivariate ANOVA, p <0,05) (figur 2) for yderligere analyse. Der henvises tilcitation # s 17-19 for fuld beskrivelse af tetrode optagelse og spike-sortering metoder.
  2. Tidsstempel spidser i hver klynge, og eksportere disse data til analyse ved hjælp af MATLAB eller Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) til at oprette raster plots og fyringsgraden reaktioner (figur 2, 3A).
  3. Identificere retentionstid flygtige stoffer ved hjælp af de samtidigt indspillede GC data. Brug af retentionstiderne for de flygtige stoffer, bestemt ved spidsen af ​​toppen fra chromatogrammet, til at undersøge enhed reagerer ved disse tidspunkter.
  4. For at undersøge de enkelte enhed reagerer via GC køre, bin antallet af pigge i 100 msek intervaller og undersøge tidsforløbet for fyring forrentede svar med henvisning til retentionstiden for eluering flygtige. Den binning af pigge i 100 ms intervaller giver nok detaljer, eller signal, om tidsforløbet for den neuronale reaktion på en eluering lugtstof fra GC.
  5. Til EXAminere befolkningen reaktioner på de forskellige eluerende flygtige stoffer, integrere fyringsgraden reaktioner individuelle enheder over en 3 sek prøveudtagningen, 1,5 sek før og 1,5 sek efter, at retentionstiden for flygtige (figur 3). Denne periode er typisk for varigheden af ​​en eluerende volatile fra GC. Vi viser fyring sats svarene fra de enheder ved farvekodning dem (rød er en høj fyring frekvensrespons, blå er en lav respons) og arrangere dem som en aktivitet matrix med hver række repræsenterer ensemblet svar på GC spildevand (kolonner) ( figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I GCMR assay under anvendelse af M. lewisii blomstret duft, vi injicere 3 pi af ekstraktet i GC. Det samlede antal flygtige stoffer eluerede ved GC er typisk 60-70 flygtige stoffer. Duften af M. lewisii er overvejende sammensat af monoterpenoids, herunder β-myrcen (acykliske) og α-pinen, med den resterende del af duft sammensat af seks carbon-flygtige stoffer, såsom 2-hexanol, og sesquiterpenoids der omfatter <1% af frirummet.

GCMR udnytter følsomheden af ​​antennal lap neuroner såvel som det neuronale behandling af biologisk vigtige flygtige stoffer. Men multi-kanal optagelser af denne art i realiteten tage en tilfældig stikprøve af neuroner i antennal lap. Dette skyldes, at små ændringer i positionen af ​​sonden position mellem forskellige præparater kan forårsage optagelsen arrayet for at prøve forskellige neuroner. Endvidere de nøjagtige positioner og morphologies af optagede neuroner er ukendt, fordi optagelsen er ekstracellulær. For at imødekomme for disse effekter, vi typisk køre GCMR eksperimenter med 8 til 16 Tilberedte, med 8 til 18 neurale enheder i hvert præparat. Til illustrationsformål, vil vi imidlertid anvende data fra kun en forberedelse (8 enheder).

Fra GCMR forsøg har det vist sig, at enheder er overraskende selektive i deres respons på flygtige stoffer, som afbildet i figur 3A. Den nedre kurve (med sort) betegner ionkromatogram, hvor hver top svarer til en given flygtigt, som ankommer til detektoren over tid. Den øvre spor (blå) viser de fyringsgraden reaktioner en enhed. Enhed responser blev beregnet ved binning antallet af spidser er fremstillet i en 100 ms interval, og dividere med denne tidsramme til frembringelse satsen. I eksemplet er det neurale enhed selektive som reaktion på D-limonen. Bemærk, at i denne enhed, den spontane Firing rate kan stadig være variabel og underlagt tilfældige udsving. Ikke desto mindre reaktioner på D-limonen var et godt stykke over 95% konfidensinterval, som beregnet af variansen i de fyringsgraden reaktioner gennem tiden.

Ikke alle enheder er imidlertid, reagerede de flygtige elueret fra GC. Faktisk omkring 50% af registrerede enheder i hver ensemble i gennemsnit var ikke reagerer (figur 3B). Dette er overraskende i betragtning af den mangfoldighed af flygtige forbindelser i den blomstrende headspace, der elueres fra GC. Imidlertid er andelen af ikke-reagerende enheder i et ensemble er overraskende konsistent mellem præparater, som findes i tidligere undersøgelser 13,14.

Ud over reaktionerne fra enkelte enheder også GCMR system muliggør analyse af befolkningen niveau reaktioner på de lugtstoffer eluerende fra GC. I det viste eksempel er der stærk ensemble selektivitet for en gruppe af flere duftstoffer ( trans-β-ocimene, henholdsvis) producerede robuste responser i ensemblet, som er repræsenteret ved den normaliserede fyring sats for hver enhed i ensemblet (farveskala).

Figur 1
Figur 1. Skematisk diagram over headspace sorption og GCMR systemet. (A) I diagrammet er en blomst indesluttet i en Teflon pose, og anvendelse af en vakuumpumpe, bliver luften fra posen suges gennem et flygtigt fælde (Porapak Q) til koncentrering af udsendte flygtige stoffer. Luften filtreres, og returneres til det lukkede blomst. (B) Ekstraktet prøve af blomster headspace er injicerered i GC og effluenten fra kolonnen er opdelt således, at halvdelen af ​​strømmen ind enten GC s flammeioniseringsdetektor, og den anden halvdel af effluenten er båret af en opvarmet overføringslinie og ankommer samtidigt på biens antenne. Virkningspotentialer fra AL neurale ensemble løbende registreres ekstracellulært under 20 min af lugt levering via GC. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Sortering af enheder optaget med multi-kanal optagelse array (MR) i biens AL. De to ben er anbragt således, at arrayet omfatter et stort volumen af AL. (A) Bølgeformen karakteristik (f.eks amp litude, dal) af hvert "spike" i tetrode optagelse kan afbildes i tre-dimensionelle rum. I det viste eksempel er højden af ​​hver stigning i 3 af de 4 optagekanaler afbildet i 3-D. Idet hver enhed har sit eget spike form, vil spidserne fra en given enhed i klynger og, hvorved de enheder, der skal identificeres og sorteres fra hinanden. Sorteret enheder viste klare forskelle i fyring respons (B raster plot) og bølgeform (C) placering af de fire kanaler på hver skaft forudsat optagelse af store zoner inden for behandling af glomeruli og neuropil. Neural aktivitet blev optaget på hver af de fire kanaler, afbildet i 3-dimensionalt rum (som vist i A), og sorteres efter signalformskarakteristika. se større tal .

måder "> Figur 3
Figur 3. (A) Firing frekvenshistogramrapporten for unit reaktioner på de eluerende forbindelser fra M. lewisii headspace ekstrakt (3 pi injektion) (nederst spor, sort). Visse lugtstoffer (fx D-limonen, rød pil) fremkaldte signifikant respons i enheder (B) Respons af alle enheder, der blev optaget fra MR til hver odorant elueret fra GC.. Overfladen plot er farvekodet i henhold til de normaliserede fyringsgraden svarene fra de enkelte enheder. Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Insekt lugte-medierede adfærd køre mange forskellige processer, herunder reproduktion, host-site markering, og identifikation af egnede føderessourcer. Undersøgelsen af ​​disse processer kræver evne til at identificere de flygtige udsendes fra kilden, såvel som evnen til at identificere de forbindelser, der medierer den adfærd. Komplicerende forhold er, at lugte består af snesevis til hundredvis af individuelle forbindelser, der tilsammen skaber en unik duft, der opfattes anderledes end de enkelte bestanddele 6,7,13,19,20. Forskning, der oprindeligt udført i kønsferomonet system 12, og senest i fødevare-og æglægning-relaterede lugte 13,20, har vist, at den adfærdsmæssige effektivitet af blandingen bosat som en funktion af nogle få, centrale flygtige bestanddele i blandingen, og at blandingerne fremkalde signifikant større adfærdsmæssige reaktioner end de enkelte bestanddele. Identificere de nøglebestanddele er således et vigtigt element i moderne kemisk økologi samt olfaktoriske neurobiologi.

En række teknikker er opstået i de sidste halvtreds år til identifikation af bioaktive stoffer, der kører adfærd i insekter. Den primære teknik til påvisning af flygtige stoffer ved insektet antenne er gaskromatografi-electroantennography (GC-EAG). EAG blev oprindeligt udviklet af Schneider 21, som nedskrev små spændingsvariationer generelt antages at være forårsaget af elektriske depolarisations af mange olfaktoriske neuroner mellem spidsen og bunden af et insekt antenne under stimulation. EAG blev senere integreret med GC for præcis identifikation af headspace flygtige som fremkalder antennal reaktioner 12,22. Desuden blev optagelsen af individuelle receptor-neuroner fra insektet antennen senere udviklede 11,23 og koblet med GC for at tilvejebringe enkeltstrengede sensillum optagelser eller GC-SSR. Aelv GC-SSR er mere tidskrævende og vanskelig end GC-EAG, optagelserne giver oplysninger om de enkelte celle responser via virkningspotentialer som reaktion på GC-udledninger, og tillader identifikation af de receptorer, der er specialiseret til bestemte forbindelser, kunne blive savnet af GC-EAG 24.

GC-EAG og GC-SSR teknikker giver identifikation af de flygtige stoffer, som fremkalder reaktioner i periferien, og er således involveret i odorant modtagelse. Nyere teknikker er begyndt at undersøge responser i centralnervesystemet af både pattedyr og insekter, og er således involveret i odorant perception. Disse teknikker kan inddeles i to brede kategorier: billeddiagnostiske metoder 25 betegnes GC-I (gaskromatografi-imaging) og direkte elektrofysiologiske metoder (f.eks GCMR). GC-I og GCMR giver flere fordele på grund af konvergensen af ​​de sensoriske neuroner til projektion, eller output, neuroner iAL, samt at disse fremgangsmåder tillader bestemmelse af, hvordan lugtstoffer er repræsenteret i insekt hjernen. Desuden er lignende metoder nu bruges i pattedyrhjernen 25.

Trods for disse fordele har GCMR og GC-I ulemper også. Dataanalyse kan være tidskrævende, og i tilfælde af GCMR er glomerulære fremskrivninger af de registrerede neurale enheder ukendt grund optagelserne er ekstracellulær. Endvidere er insekt AL innerveret af flere forskellige neuronale typer, herunder projektion neuroner (PNS) og lokale interneuroner (LMS), hvilket således gør identifikation af de optagne enheder vanskelig. Men i møl, M. sexta, har nyligt arbejde vist, at PNS og LNS kan identificeres ved spiking adfærd af neuronerne, hvilket tillader identifikation af disse Neuron typer ved deres spontane aktivitet 26. Ikke desto mindre GCMR og GC-I muliggør identifikation af de lugtstoffer, der Aktiveringe specialiserede receptor neuroner, der ikke fremkalder stærke EAG reaktioner, samt for, hvordan populationen af ​​neuroner i hjernen fremgangsmåde de flygtige stoffer. En undersøgelse, der sammenligner disse forskellige metoder er endnu ikke blevet udført, selv om vores indledende data antyder, at GCMR kan være mere egnet end den GC-EAG for de forbindelser, der er bioaktive, men er i ubetydelige mængder i ekstrakten (Riffell upublicerede resultater). Det fremtidige arbejde kan undersøge trade-off i følsomheden af ​​påvisning af bioaktive lugtstoffer med analysen tid mellem de forskellige metoder.

Selv om vi har fokuseret her på angivelse af de analysemetoder vi bruger til B. Impatiens bier og duften fra M. lewisii, ekstrakten og de ​​insekt anvendte arter kan ændres, hvis visse modifikationer. Insektarter kan anbringes i forskellige pipettespidser (10-200 ul) afhængigt af deres størrelse. Større arter, ligesom møl, Manducasexta, kan anbringes i 6 ml prøvehætteglas. På en sådan måde er præparatet holdes i live, hvorved stabile optagelser adskillige timer i varighed.

Tilsammen analytiske metoder til isolering af forbindelser sammen med elektrofysiologiske optagelser i insekt hjernen nuværende stærke værktøjer til identifikation af bioaktive stoffer, og når det anvendes i tandem med adfærdsmæssige forsøg kan præsentere et middel til at bestemme vigtige flygtige for fødevarer-relaterede adfærd hos insekter 13, såvel som de er involveret i host-site 2, og blod-vært adfærd 27, som er vigtige for skadedyr i landbruget og vektorer af sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud IOS 1121692, og ved University of Washington Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. e3440 (2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. e1098 (2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. e3282 (2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics