Identifikation der olfaktorischen Flüchtige mittels Gaschromatographie-Multi-unit Recordings (GCMR) im Insect Antennallobus

Neuroscience

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Summary

Geruchssinn vermitteln viele verschiedene Verhaltensweisen bei Insekten, und sind oft komplexe Mischungen von Dutzenden bis Hunderten von flüchtigen Verbindungen bestehen. Mittels Gaschromatographie mit Multi-Kanal-Aufnahme in das Insekt Antennallobus beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von biologisch aktiven Verbindungen.

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Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

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Abstract

Alle Organismen leben in einer Welt voller Sinnesreize, die ihre Verhaltens-und physiologische Reaktion auf ihre Umgebung zu bestimmen. Der Geruchssinn ist besonders wichtig bei den Insekten, die ihre olfaktorischen Systeme verwenden, um zu reagieren, und zu unterscheiden zwischen komplexen Geruch Reize. Diese Gerüche hervorrufen Verhaltensweisen, die zu vermitteln Prozesse wie Wiedergabe und Habitatwahl 1-3. Zusätzlich chemischen Sensorik durch Insekten vermittelt Verhaltensweisen, die von großer Bedeutung für die Landwirtschaft und die menschliche Gesundheit, einschließlich der Bestäubung 4-6, Herbivorie von Nahrungspflanzen 7 und Übertragung von Krankheiten 8,9. Bezeichnung des olfaktorischen Signale und ihre Rolle im Verhalten von Insekten ist somit wichtig für das Verständnis sowohl ökologische Prozesse und menschliche Nahrung Ressourcen und Wohlbefinden.

Bis heute hat die Identifizierung der flüchtigen das Verhalten von Insekten zu fahren war schwierig und oft langwierig. Übliche Techniken umfassenGaschromatographie-gekoppelte Elektroantennogramm Aufnahme (GC-EAG) und Gas einzigen Sensillum Aufnahmen (GC-SSR) 10-12 Chromatographie gekoppelt. Diese Techniken erwies sich bei der Identifizierung von bioaktiven Verbindungen von entscheidender Bedeutung. 13,14; Wir haben eine Methode, die Gas-Chromatographie gekoppelt Multi-Channel-elektrophysiologischen Ableitungen (sog. 'GCMR') von Neuronen im Antennallobus (das Insekt primäre Riechzentrum AL) verwendet entwickelt. Das state-of-the-art Technik ermöglicht es uns zu sondieren, wie Geruch Informationen im Insektengehirn vertreten ist. Darüber hinaus, weil neuronalen Reaktionen auf Gerüche auf dieser Ebene der olfaktorischen Verarbeitung hochsensibler wegen der Grad der Konvergenz der Antenne Rezeptor-Neuronen in AL Neuronen sind, wird AL-Aufnahmen ermöglichen den Nachweis der aktiven Bestandteile natürlicher Gerüche effizient und mit hoher Empfindlichkeit. Hier beschreiben wir GCMR und geben ein Beispiel für seine Verwendung.

Mehrere allgemeinen Schritte sind INVOLved bei der Detektion von bioaktiven flüchtigen und Insektenzellen Reaktion. Volatile müssen zunächst aus den Quellen von Interesse gesammelt werden (in diesem Beispiel verwenden wir Blumen aus der Gattung Mimulus (Phyrmaceae)) und gekennzeichnet nach Bedarf mit Standard-GC-MS-Techniken 14-16. Insekten sind für die Studie unter Verwendung minimal Dissektion, wonach eine Aufnahme-Elektrode in die Antennallobus und Multi-Channel neuronalen Aufnahme beginnt eingesetzt ist. Post-Processing der neuronalen Daten dann verrät, welche insbesondere Geruchsstoffe signifikanten neuronalen Reaktionen führen durch das Insekt Nervensystem.

Obwohl das Beispiel präsentieren wir hier ist spezifisch für die Bestäubung Studien können GCMR auf ein breites Spektrum der Studie Organismen und volatile Quellen erweitert werden. Zum Beispiel kann dieses Verfahren bei der Identifizierung von Geruchsstoffen anziehenden oder abstoßenden Wirtsinsekten und Pflanzenschädlinge eingesetzt werden. Darüber hinaus können GCMR auch verwendet, um Lockstoffe für Nützlinge, wie po identifizierenllinators. Die Technik kann auf nicht-Insekt Themen ausgebaut als gut.

Protocol

Ein. Volatile Follection

  1. In diesem Beispiel verwenden wir flüchtigen Proben von M. lewisii Blumen - eine alpine Wildblumen Kalifornien beheimatet ist. Volatile werden mittels dynamischen Sorption Methoden nach Riffell et al. 14. Kurz gesagt, werden bei dieser Methode eine geschlossene Schleife Trapping System, wo Blumen in einem Teflon Beutel eingeschlossen sind. Verwendung eines inerten Vakuumpumpe, wird die Luft um die Blumen durch eine "Falle" einer Pasteurpipette zusammen mit Q Porapak Matrix gefüllt gesaugt. Die Abluft aus der Pumpe wird über Aktivkohle filtriert. Nach einer vorgeschriebenen Zeitperiode, in unserem Fall 24 h wird die Porapak Q-Matrix mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, typischerweise Hexan eluiert, um das konzentrierte Extrakt sammeln. Der Extrakt wird dann im -80 ° C bis zur Analyse gelagert. Falls erforderlich, können die Proben vor der Analyse unter einem Strom von Stickstoffgas konzentriert werden. Sofern die Probe ist bereits gut charakterisierte, führen ein Aliquot der es durch eineGaschromatograph-Massenspektrometer (GC-MS), um flüchtige Komponenten zu identifizieren, bevor mit der Probe.

2. Elektrophysiologische Vorbereitung

  1. Geschnitten etwa 1 cm vom Ende des 1000 ul Pipettenspitze. Legen Sie eine Hummel (Bombus Impatiens) in der Basis der Pipettenspitze und sanft in Richtung der gegenüberliegenden Ende der Spitze drücken, bis nur noch der Kopf ausgesetzt ist.
  2. Melt Dentalwachs und formen es um den freigelegten Kopf, um sicherzustellen, dass das Wachs klebt auf den Facettenaugen für Sicherheit und um die Biene den Kopf völlig unbeweglich. Achten Sie darauf, keine Wachs auf der Antenne der Biene zu bekommen.
  3. Sobald der Kopf gesichert ist, einen quadratischen, fensterartige, Inzision in den Kopf Kapsel mit einer Rasierklinge Leistungsschalter oder die entsprechende Größe Skalpells um die Kutikula geschnitten. Mit der Blade-Leistungsschalter, von der dorsalen Seite des Kopfes Kapsel starten, unmittelbar hinter der Antenne und benachbart zu einer der Facettenaugen. Schneideneine gerade Linie, von einer Verbindung zur kontralateralen Auge Facettenauge. Nach dem Schneiden einer geraden Linie auf der gegenüberliegenden Facettenauge, beginnen einen Einschnitt dorsal bis die Kopfkapsel Kurven und Enden in der Nähe seines Brustkorbs. An diesem Punkt beginnen, auf das gegenüberliegende Ende des Kopfkapsel geschnitten. Schließlich, sobald eine Leitung mit dem gegenüberliegenden Ende geschnitten worden ist, eine Linie geschnitten wieder auf die Ausgangsposition der anfängliche Einschnitt. Es ist wichtig, die Kutikula, die benachbart zu der Antenne zu entfernen, wie dies das Einsetzen der Elektrode behindert wird.
  4. Sobald die Nagelhaut geschnitten wird, verwenden Sie eine Pinzette, um die Biene Kutikula, die dann aussetzen sollte der Biene Gehirn und, noch wichtiger, die Antennalloben entfernen. Sofort beginnen Superfusion das Gehirn mit Insekten Kochsalzlösung, so dass das Gehirn nicht zu dessicated. Nachdem sich das Gehirn ausgesetzt ist, sorgfältig mit einem Paar sehr feinen Pinzette die perineural Scheide unmittelbar über den Antennalloben entfernen. Seien Sie sehr vorsichtig nicht zuPunktion der Biene Gehirn mit der Zange.

3. Gas-Chromatographie mit Multi-Channel-Recording

  1. Die Biene "Vorbereitung" - in einem Rohr mit seinem Gehirn ausgesetzt fixiert - ist nun bereit für die elektrophysiologische Ableitung. Platzieren der Biene in einer Klemme, die an einem magnetischen Basis, die auf einem Luftkissentisch befindet.
  2. Anordnen einer IV Beutel, Durchflussregler, und Schläuche (gefüllt mit Insekt Kochsalzlösung), so daß die Salzlösung kontinuierlich superfuses das Gehirn.
  3. Mit einem Mikromanipulator insertareference Elektrode aus Wolfram Draht, in der Biene ins Auge.
  4. Mit einem separaten Mikromanipulator, legen Sie die Multi-Channel-Elektrode, wie einer gewickelten Draht Tetrode oder Silizium Multi-Channel-Elektrode (Neuronexus Technologies), in die Antennalloben der Biene. Diese Elektrode ist mit einem Vorverstärker wie die TDT Systems S-3 Z Serie mit dem Z-Bus bioamp Prozessor der TDT angeschlossen. Ausgabe vom Gas Chromatogram den Detektor über ein abgeschirmtes HF-Kabel kann eine Schnittstelle mit dem Verstärker und Datenerfassungssystem, so daß sowohl das neuronale und GC-Signal synchronisiert ist.
  5. Warten Sie ca. 30-60 Minuten für die neuronalen Aufnahmen zu stabilisieren. Sobald die spontane Aktivität und Wellenform von Einheiten in den Aufnahme-Kanäle geworden konsistente, verwenden Sie einen Geruch Spritze, um die Bienen zu stimulieren und beobachten Sie die Reaktion der Aufzeichnungskanäle der Geruch.
  6. Aufzuzeichnen extrazellulären Spitzen von Neuronen durch die automatische Schwellwertbildung Aufzeichnungskanäle, die 3,5 bis 5 Sigma des Signals auf den einzelnen Aufzeichnungskanäle. Manuelle Thresholding können für einige Kanäle benötigt werden, um eine Kontamination durch elektrische Störungen zu vermeiden. Die Aktionspotentiale von Neuronen wird als Spannungsspitzen in der Aufnahme Kanal angezeigt. Wenn des Kanals Spannung den Schwellenwert überschreitet, puffert das System und speichert die einige Millisekunden vor und nach dem Überschreiten der Schwelle, wodurch takinga Snap-shot der Wellenform oder Spike.
  7. Unmittelbar neben der Luft-Tabelle ist die GC. Vor dem Einspritzen des floral Extrakt in den GC, um sicherzustellen, dass das Verfahren für die Temperaturrampe Lauf des GC korrekt ist. In unserem Beispiel verwenden wir eine Temperatur Methode beginnend bei 50 ° C für 4 min durch eine Erhöhung der Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 10 ° C / min. bis 220 ° C, wobei zu diesem Zeitpunkt halten wir den GC für zusätzliche 6 min. Wir verwenden eine DB-5 GC-Säule (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), mit Helium als Trägergas. Der Einlass ist Splitlos mit einer Temperatur auf 200 ° C. Der Flammenionisationsdetektor Temperatur auf 230 ° C eingestellt
  8. Injizieren die Extraktprobe des Blumenarrangements Kopfraum in die erhitzte Einspritzöffnung der GC, um die adsorbierten flüchtigen Bestandteile in die GC-Säule zu lösen. Das Abwasser aus der Säule wird 1:1 zwischen dem Flammenionisationsdetektor (FID) und der Biene-Antenne mit einem Glas "Y"-Anschluss (J & W Scientific) aufgeteilt. Beginnen recording von der Elektrode, wie Sie eine Probe zu injizieren in die GC.
  9. Nach der GC-Lauf abgeschlossen ist, lassen Sie die Vorbereitung Rest für 5 bis 15 min. Dann ist entweder zu injizieren ein weiteres Beispiel in den GC oder stimulieren die Vorbereitung mit einzelnen flüchtigen Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen. In diesem letzteren Verfahren zur Stimulierung der Herstellung werden Luftimpulse von einem konstanten Luftstrom durch eine Glasspritze enthaltend ein Stück Filterpapier, die den Verbindungen hinterlegt umgeleitet. Der Geruch Stimulus wurde mittels eines Solenoid-Ventils durch die aktivierte Software gesteuert gepulst.
  10. Wenn das Gerät Aktivität plötzlich stoppt oder Änderungen, überprüfen Sie die Tropf mit Kochsalzlösung und lassen die Vorbereitung Rest für 15 min. Wenn die spontane Aktivität nicht wieder das seinen previous level wird die Zubereitung sollte verworfen und anderen Bienen verwendet werden, wenn verfügbar.
  11. Nach dem Experiment zu fixieren das Gehirn mit 5% Formalin für 20 min mit der Sonde immer noch im Gewebe. Weiter, Verbrauchssteuern das Gehirnund legen Sie sie in 2% Glutaraldehyd für 4 Stunden, und anschließend machen einen abgestuften Ethanol Dehydration Serie und deaktivieren Sie das Gehirn mit Methylsalicylat. Bezogen auf die Fixierung und Löschen des Gewebes, die Orte in der AL, wo die Elektroden punktiert das Gewebe sollte klar erkennbar durch konfokale Mikroskopie.

4. Data Analysis

  1. Gesammelten Daten nach dem Versuch zu trennen und zu identifizieren, die aufgezeichneten neuronalen Einheiten zu analysieren. Verwenden typische Software-Programme (Offline Sorter, MClust und SClust) an getrennten Wellenformen oder "Spikes" auf Spike Formen wie Peaks oder Tal-Amplitude, Peak Halbwertsbreite usw. oder vermindertem Maßnahmen beruht (Hauptkomponenten) 17 , 18 (Abb. 2). Nur solche Cluster von Spikes, dass im dreidimensionalen Raum getrennt (PC1-PC3) und sind statistisch verschieden voneinander (multivariate Varianzanalyse, p <0,05) (Abbildung 2) für eine weitere Analyse. Bitte beachten SieZitat # s 17-19 für die vollständige Beschreibung der Tetrode Aufnahme und Spike-Sortier-Methoden.
  2. Zeitstempel Spitzen in jedem Cluster, und exportieren diese Daten für die Analyse mit MATLAB oder Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) zur Raster-Plots und Feuerrate Antworten (2, 3A) zu erstellen.
  3. Identifizieren Sie die Retentionszeiten der flüchtigen mit den gleichzeitig aufgezeichnet GC-Daten. Mit den Retentionszeiten der flüchtigen Stoffe, die von der Spitze des Peaks des Chromatogramms bestimmt, zu Einheit Reaktionen an denjenigen Zeitpunkten untersuchen.
  4. Um einzelne Einheit Reaktionen durch die GC-Lauf zu untersuchen, BIN die Anzahl der Spitzen in 100 msec Intervallen und untersuchen den zeitlichen Verlauf der Feuerungsrate Antworten anhand der Retentionszeit von flüchtigen Eluieren. Die Binning von Spikes in 100 msec Intervallen genügend Detail, oder das Signal, um die Zeit-Verlauf des neuronalen Reaktion auf ein Odorans Eluieren vom GC.
  5. Um exaMine Die Population Reaktionen auf die verschiedenen eluierenden flüchtigen, integrieren die Feuerungsrate Reaktionen der einzelnen Einheiten über eine 3 sec Abtastfenster, 1,5 sec vor und 1,5 Sek. nach, die Retentionszeit der flüchtige (Abbildung 3). Dieser Zeitraum ist charakteristisch für die Dauer eines eluierenden flüchtigen vom GC. Wir zeigen Feuerungsrate Reaktionen der Einheiten durch Farbcodierung ihnen (Rot ist eine hohe Feuerungsrate Antwort; blau ist eine geringe Reaktion) und Anordnen derselben als Aktivität Matrix mit jeder Reihe, die die Reaktion auf das Ensemble GC Abstrom (Spalten) ( Abbildung 3).

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Representative Results

In der GCMR Assay unter Verwendung des M. lewisii blumigen Duft, spritzen wir 3 ul der Extrakt in der GC. Die Gesamtzahl der flüchtigen Eluieren durch den GC beträgt typischerweise 60-70 flüchtigen. Der Duft von M. lewisii überwiegend aus Monoterpenoide zusammengesetzt, darunter β-Myrcen (azyklische) und α-Pinen, wobei der Rest der Duft von sechs Kohlenstoffatomen flüchtigen, wie 2-Hexanol und Sesquiterpene, die <1% der Kopfraum umfassen zusammengesetzt.

GCMR nutzt die Empfindlichkeit des Antennallobus Neuronen sowie der neuronalen Verarbeitung von biologisch wichtigen flüchtigen. Allerdings, Multi-Kanal-Aufnahmen dieser Art, in der Tat, eine zufällige Stichprobe von Neuronen im Antennallobus. Dies liegt daran, dass geringfügige Änderungen in der Position der Sonde zwischen verschiedenen Zubereitungen kann das Aufzeichnen Array an verschiedene Neuronen abzutasten. Darüber hinaus sind die genauen Positionen und morphologies der aufgezeichneten Neuronen sind unbekannt, da die Aufnahme extrazellulärer. Um diese Effekte unterzubringen, wir typischerweise ausgeführt GCMR Experimenten mit 8 bis 16 Präparaten mit 8 bis 18 Einheiten in jedem neuronalen Zubereitung. Zum Zweck der Veranschaulichung, jedoch werden wir Daten nur aus einer Zubereitung (8 Einheiten) zu verwenden.

Aus den GCMR Experimenten haben wir herausgefunden, dass selektive Einheiten überraschend in ihrer Reaktion auf flüchtige Stoffe, wie in 3A dargestellt sind. Die untere Spur (in Schwarz) bezeichnet die Ionenchromatogramm, wobei jeder Peak einer gegebenen flüchtige, die an dem Detektor über die Zeit ankommen wird. Die obere Spur (blau) zeigt die Feuerungsrate Antworten einer Einheit. Einheit Reaktionen wurden durch Binning die Zahl der Spikes in einem 100 ms Intervall produziert berechnet, und dividiert durch dieses Zeitrahmens, um die Rate zu produzieren. In dem Beispiel ist die neuronalen Einheit in Reaktion auf selektive D-Limonen. Man beachte, dass in dieser Einheit, die spontane firing Rate kann noch variabel und unterliegt zufälligen Schwankungen. Dennoch waren Antworten auf D-Limonen deutlich über dem 95%-Konfidenzintervall, wie die Varianz der Feuerrate Reaktionen durch die Zeit berechnet.

Nicht alle Einheiten jedoch reagiert, um die flüchtigen Bestandteile aus dem GC Eluieren. In der Tat, im Durchschnitt etwa 50% der Einheiten in jedem aufgezeichneten Ensemble waren nicht reagierenden (Abbildung 3B). Dies ist überraschend angesichts der Vielfalt der flüchtigen Verbindungen in der floralen Kopfraum, die aus dem GC freisetzenden werden. Allerdings ist der Anteil der nicht-responsive Einheiten in einem Ensemble überraschend konsistent zwischen Zubereitungen, wie in früheren Studien 13,14 gefunden.

Über die Reaktionen der einzelnen Einheiten, die GCMR System ermöglicht auch die Analyse der Bevölkerung Ebene Antworten auf die Geruchsstoffe Eluieren aus der GC. In dem hier gezeigten Beispiel gibt es starke Ensemble Selektivität für eine Gruppe von mehreren Riechstoffen ( trans-β-Ocimen, jeweils) hergestellt robuste Reaktionen im Ensemble, wie durch das normalisierte Impulsauslösungsfrequenz jeder Einheit im Ensemble (Farbskala) repräsentiert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Prinzipskizze Kopfraum Sorption und dem GCMR System. (A) In der schematischen, eine Blume in einem Teflon Beutel eingeschlossen ist, und Verwendung einer Vakuumpumpe, wird die Luft aus dem Beutel durch eine flüchtige Falle (Porapak Q) angesaugt wird, um das Konzentrat emittierten flüchtigen. Die Luft wird gefiltert und wieder in den geschlossenen Blume. (B) Der Extrakt Probe des floralen Kopfraum injiziert wirded im GC und der Ausfluss aus der Säule aufgeteilt wird, so dass die Hälfte der Strömung tritt entweder des GC Flammenionisationsdetektor, und die andere Hälfte des Abwassers wird durch eine beheizte Transferleitung durchgeführt und gelangt gleichzeitig an der Biene Antenne. Aktionspotentiale aus dem AL neuronalen Ensembles kontinuierlich extrazellulär während der 20 min von Geruch Lieferung per GC aufgezeichnet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Sortierung der Einheiten verzeichneten die Multi-Kanal-Aufnahme array (MR) in der Biene AL. Die beiden Schenkel derart beabstandet sind, dass das Array ein großes Volumen des AL umfasst. (A) Die Wellenformcharakteristik (zB amp litude, Tal) jedes "spike" im Tetrode Aufnahme kann im dreidimensionalen Raum dargestellt werden. Im hier gezeigten Beispiel ist die Höhe jeder Spitze in 3 der 4 Aufzeichnungskanäle in 3-D aufgetragen. Da jede Einheit ihren eigenen Dorn Form erhalten wird, werden die Spitzen von einer gegebenen Einheit Cluster zusammen, wodurch die Einheiten identifiziert und sortiert werden voneinander. Sortiert Einheiten zeigten deutliche Unterschiede in Schussposition Antworten (B; Raster-Darstellung) und Wellenform-Form (C) Positionierung der vier Kanäle auf jedem Schaft vorgesehen Aufnahme von breiten Zonen innerhalb der Verarbeitung Glomeruli und Neuropil. Neuronale Aktivität auf jeder der vier Kanäle aufgezeichnet wurde, aufgetragen in 3-dimensionalen Raum (wie in A gezeigt) und sortiert nach Wellenform Eigenschaften. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Wegen "> Abbildung 3
Abbildung 3. (A) Feuerrate Histogramme Gerät reagiert auf den freisetzenden Verbindungen aus dem M. lewisii Kopfraum Extrakt (3 ul Injektion) (untere Kurve, schwarz). Bestimmte Riechstoffe (zB D-Limonen; roter Pfeil) evozierten signifikante Reaktionen in Einheiten (B) Reaktion aller Einheiten, die von dem MR an jeden Duftstoff aus dem GC eluiert wurden aufgezeichnet.. Die Oberfläche Grundstück ist nach den normierten Feuerrate Reaktionen der einzelnen Einheiten farbkodiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

Insect olfaktorischen-vermittelte Verhaltensweisen treiben viele verschiedene Prozesse, einschließlich der Reproduktion, Host-Auswahl des Standortes, und die Identifizierung von geeigneten Lebensmitteln Ressourcen. Die Untersuchung dieser Prozesse erfordert die Fähigkeit, die flüchtigen Bestandteile aus der Quelle, als auch die Fähigkeit, diese Verbindungen, die Vermittlung der Verhaltensweisen identifizieren emittierten identifizieren. Erschwerend ist, dass Gerüche Dutzende bis Hunderte von einzelnen Verbindungen, die zusammen einen einzigartigen Duft, die anders ist als die einzelnen Bestandteile 6,7,13,19,20 wahrgenommen bestehen. Forschung, zunächst in der Sex-Pheromon-System 12 durchgeführt, und in jüngerer Zeit in der Lebensmittel-und Eiablage-bezogenen Gerüche 13,20 hat gezeigt, dass die Verhaltens-Wirksamkeit der Mischung in Abhängigkeit von einigen wenigen, wichtigen flüchtigen Bestandteile in der Mischung befindet, und daß die Mischungen hervorzurufen signifikant größer Verhaltensreaktionen als die einzelnen Bestandteile. Die Ermittlung dieser TasteBestandteile ist daher ein wichtiger Bestandteil in der heutigen chemischen Ökologie sowie olfaktorische Neurobiologie.

Eine Vielzahl von Techniken sind in den letzten 50 Jahre für die Identifizierung von bioaktiven Verbindungen, dass das Verhalten fahren Insekten entstanden. Der primäre Technik zum Nachweis von flüchtigen durch das Insekt Antenne Gaschromatographie-Elektroantennographie (GC-EAG). EAG wurde ursprünglich von Schneider 21, der kleine Spannungsschwankungen im Allgemeinen angenommen, durch elektrische Depolarisationen vieler olfaktorische Neuronen zwischen der Spitze und der Basis eines Insekts Antenne während der Stimulation verursacht werden aufgezeichnet entwickelt. EAG wurde später mit dem GC zur genauen Identifizierung der Kopfraum flüchtigen, die antennalen Reaktionen hervorrufen 12,22 integriert. Darüber hinaus wurde die Aufzeichnung der einzelnen Neuronen aus der Rezeptor Insektenantenne später 11,23 entwickelt und gekoppelt mit der GC zu Single-Sensillum Aufnahmen oder GC-SSR bereitzustellen. Abwohl GC-SSR ist zeitintensiv und schwieriger als GC-EAG bieten die Aufzeichnungen Informationen zu den einzelnen Zell-Antworten über Aktionspotentiale in Reaktion auf die GC-Ausflüssen, und ermöglicht die Identifizierung derjenigen Rezeptoren, die darauf spezialisiert sind insbesondere Verbindungen, die könnte durch GC-EAG 24 verpasst werden.

Die GC-EAG und GC-SSR Techniken bieten Identifizierung der flüchtigen, die Antworten an der Peripherie zu entlocken, und sind somit in Geruchsstoff Empfang beteiligt. Neuere Techniken haben begonnen Untersuchen Reaktionen im zentralen Nervensystem von Säugetieren und Insekten beiden, und werden somit in Odorans Wahrnehmung involviert. Diese Techniken fallen unter zwei Kategorien: Bildgebende Verfahren 25 bezeichnet GC-I (Gaschromatographie-Bildgebung) und direkten elektrophysiologischen Methoden (zB GCMR). GC-I und GCMR bieten mehrere Vorteile wegen der Konvergenz der sensorischen Neuronen zu dem Vorsprung oder der Leistung, die in NeuronenAL, sowie dass diese sowohl die Bestimmung davon, wie Geruchsstoffe werden im Insekt Gehirn repräsentiert ermöglichen. Darüber hinaus sind ähnliche Methoden nun im Gehirn von Säugetieren 25 verwendet.

Trotz dieser Vorteile bieten GCMR und GC-I Nachteile. Datenanalyse kann zeitaufwändig sein, und im Falle des GCMR sind glomerulären Vorsprünge der aufgezeichneten neuronalen Einheiten nicht bekannt, da die Aufnahmen wobei extrazellulären. Darüber hinaus wird das Insekt AL durch mehrere unterschiedliche Typen einschließlich neuronaler Vorsprung Neuronen (PNS) und lokalen Interneuronen (LNS) und macht eine Identifizierung der aufgezeichneten Einheiten schwierig innerviert. Doch in der Motte, M. sexta haben neuere Arbeit zeigte, dass PNs und LNs vom Spiking Verhalten der Neuronen identifiziert werden kann, wodurch es für die Identifizierung dieser Neuron Typen durch ihre spontane Aktivität 26. Dennoch ermöglicht GCMR und GC-I die Identifizierung der Geruchsstoffe, dass aktivierendene spezialisierten Rezeptor-Neuronen, die nicht entlocken können starke EAG Antworten, sowie die Bestimmung, wie die Population von Neuronen im Gehirn verarbeiten die flüchtigen Bestandteile. Eine Studie, die diese verschiedenen Methoden noch nicht durchgeführt worden, obwohl unsere vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass die GCMR besser geeignet sein als die GC-EAG für die Verbindungen, die bioaktive sind, aber in Spuren im Extrakt (Riffell unveröffentlichte Ergebnisse). Zukünftige Arbeiten können die trade-off in der Empfindlichkeit der Detektion bioaktive Duftstoffe mit der Analyse der Zeit zwischen den verschiedenen Methoden zu untersuchen.

Obwohl wir hier auf detailliert die Testverfahren, die wir für B. konzentrierte impatiens Bienen und der Duft von M. lewisii, der Extrakt und die Insektenarten eingesetzt werden können geändert werden, wenn bestimmte Änderungen vorgenommen werden. Insektenarten können in verschiedene Pipettenspitzen (10 bis 200 ul) je nach ihrer Größe angeordnet werden. Größere Arten, wie die Motte, Manducasexta, kann in 6 ml Probenfläschchen platziert werden. Auf eine solche Weise wird die Herstellung wachgehalten wodurch stabile Aufnahmen mehrere Stunden Dauer.

Zusammengenommen analytischen Verfahren zur Isolierung von Verbindungen zusammen mit elektrophysiologischen Ableitungen in den Insektengehirn vorliegenden leistungsfähige Werkzeuge für die Identifizierung von bioaktiven Verbindungen, und wenn im Tandem mit Verhaltensexperimenten verwendet wird, kann ein Mittel, durch das zu präsentieren, um wichtige flüchtige für ernährungsbedingter bestimmen Verhaltensweisen bei Insekten 13, sowie jene in Host-Website 2 beteiligt, und Blut-host Verhaltensweisen 27, die wichtig sind für die landwirtschaftliche Schädlinge und Krankheitsüberträger.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NSF IOS 1121692, und von der University of Washington Research Foundation unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

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