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마우스 Estrous 사이클 스테이징 확인을 위해 질 세척, 크리스탈 바이올렛의 착색 및 질 Cytological 평가를 수행

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Summary

여기, 우리는 간단한 비 침습적 수집 및 질을 뛰어 넘는 샘플 cytological 평가하여 손쥐 생식 (proestrus, 발정, metestrus, 또는 diestrus)의 단계를 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 더 질 세포학은 손쥐 생식주기를 통해 전환을 하부 호르몬 수준을 순환 반영 방법에 대해 설명합니다.

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McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

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Abstract

설치류에 생식 상태를 평가의 급속한 수단뿐만 아니라 생식 기능 장애의 연구에 유용합니다뿐만 아니라 병적 인 도전에 따라 조직 변성의 호르몬 조절 (또는 재생)에 새 마우스 질병의 모델과 조사의 생산이 필요합니다. proestrus, 발정, metestrus 및 diestrus : 손쥐 생식 (또는 estrous)주기는 4 단계로 나누어 져 있습니다. 난소 스테로이드 17-β-에스트라 디올과 progesterone의 수준을 순환에 정의 변동, gonadotropins는 luteinizing와 자극 호르몬을 고치,이 생식 단계를 통해 luteotropic 호르몬 prolactin 신호 전환. 손쥐 질 운하 내에서 세포 예표 론의 변화는 이러한 기본 내분비 이벤트를 반영합니다. nucleated 상피 세포, cornified 편평 상피 세포, 그리고 질 얼룩에 존재하는 백혈구의 상대 비율 매일 평가는 손쥐 estrous을 식별하는 데 사용할 수 있습니다단계. invasiveness의 정도 그러나, 이러한 샘플 생식 상태를 변경하고 얼룩의 cytological 평가를 먹이고 수있는 염증 반응을 유도 할 수 있습니다 수집에 채용. 여기, 우리는 그녀의 생식주기를 변경하지 않고 여성 마우스의 estrous주기의 단계를 결정하는 데 사용할 수있는 간단한 비 침습적 프로토콜을 설명합니다. 어떻게 우리가 네 가지 질 얼룩의 주된 세포 예표 론의 수집과 분석에 의한 estrous주기의 단계와 우리가 이러한 변경 사항은 내분비 상태에 대해 해석 할 수있는 방법을 보여 구별하는 방법을 자세히 설명합니다.

Protocol

1. 준비 시약

  1. 필요한 때까지 무균 질 세척을, 실온에서 단단하게 밀봉 된 용기에 두 번 증류수 (ddH 2 O)와 상점을 압력솥.
  2. cytological 평가를 들어, ddH 2 O. 100 ML에 크리스탈 바이올렛 가루 0.1 g을 추가 잘 섞는다. 필요한 때까지 크리스탈 바이올렛 얼룩 (0.1 %)는 실온에서 단단하게 밀봉 된 용기에 저장할 수 있습니다.

2. 수집 질 세포 (질 세척)

  1. 멸균 200 μl 팁의 끝 부분에 라텍스 전구를 놓고 멸균 ddH 2 O는 볼륨 지침으로 끝에서 순서를 사용하는 약 100 μl를 그린다.
  2. 그녀 케이지의 마우스를 올려 당신에 대한 그녀의 엉덩이 / 후방 단부와 케이지 호퍼 (뚜껑)에 그녀를 놓습니다.
  3. 단단히 꼬리를 파악하고 뒤쪽 끝을 향상. 마우스는 이제 호퍼을 쥐었고 만 그녀 앞에서 손을 갖게됩니다. 이 시점에서 마우스가 소변을 할 수 있습니다. 그렇다면, 배뇨 멈출 때까지 기다리십시오. 거기에 질 운하의 입구에서 왼쪽으로 소변을 할 경우, 당신은 별도의 팁 (즉,하지 샘플 수집 팁)를 사용하여 초과 ddH 2 O로 시작을 씻어 할 수 있습니다.
  4. 질 (및 경부) 자극이 쥐 1,2에 pseudopregnancy을 일으킬 수로 구멍을 통과하지 돌봐 질 운하의 개통에 ddH 2 O 가득한 팁의 끝을 놓으십시오. 최근 보고서는 쥐가 그럼에도 불구하고 치료가 반복 분석 3 invasiveness의 정도를 최소화하기 위해주의해야한다이 효과에 덜 민감한 것이 좋습니다.
  5. 부드럽게 질 운하의 개통에 물 (~ 25-50 μl)의 양의 절반에 분기 추방 전구를 놓으면 되죠. 액체가 저절로 팁 삽입없이 운하에 기음합니다. 천천히 전구에 가해지는 압력을 놓습니다. 유체는 끝으로 다시 인출됩니다. 유체의 흡인을 방지하기 위해 너무 빨리 해제 압력을 피전구에. 필터링 팁이 목적을 위해 유용 할 수 있습니다.
  6. 하나의 샘플에서 세포의 충분한 숫자를 얻기 위해 같은 팁, ​​전구, 그리고 유체를 사용하여 이전 단계 4-5 번 반복합니다.
  7. 유리 슬라이드에 유체를 삽입하고, 비방 완전히 실온에서 건조 할 수 있습니다. 일단 건조,이 estrous 얼룩은 즉시 물들거나 저장하고 나중에 물들 일 수 있습니다.

3. 크리스탈 바이올렛을 사용하여 Cytological 착색 * 4

  1. 크리스탈 바이올렛은 1 분에 얼룩을 포함하는 coplin 병 (또는 다른 유사한 착색 용기)에서 건조 슬라이드를 놓습니다.
  2. ddH 2 O.을 포함하는 두 번째 coplin 병에 제거 1 분에 ddH 2 O로 슬라이드를 씻으십시오. 반복합니다.
  3. 스테인드 도말 표본과 접촉을 피하고, 가벼운 의무 조직 와이퍼와 슬라이드의 가장자리에서 초과 ddH 2 O를 제거합니다.
  4. 비방과 커버 상단에 글리세롤의 피펫 약 15 μl나오십시오. 또한, 다른 조직 학적 장착 시약은 더 영구적, 비 diffusing 얼룩을 얻기 위해 이용 될 수있다.

여기에 설명 * 착색 방법은 실험실에서 수행 할 수있는 간단한 절차입니다. 다른 방법은 자세한 내용을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, Papanicolaou의 얼룩 사용하여 nucleated 상피 세포의 성숙이 덜 성숙 세포 스테인드 청록색 더 성숙 세포 핑크 또는 오렌지 스테인드로 구별 할 수 있습니다. 이러한 차이는 일찍 또는 늦게 proestrus를 개최하는 데 사용할 수 있습니다. 4

4. 질 세포학

  1. 세포 유형이 존재 결정하는 빛 현미경 아래에있는 얼룩을 검사합니다. 현미경 검사는 coverslipping에 글리세롤을 사용하면 크리스탈 바이올렛은 시간이 지남에 따라 세포의 확산되므로 얼룩 후 바로 수행해야합니다. Photomicrographs는 세포학을 문서화하는 분석시에주의해야한다.
  2. entir를 검사하여 시작낮은 배율의 전자 도말 표본. 대표 지역을 선택하고 더 높은 배율로 이동합니다. 귀하는 (대표 결과, 그림 1A-C) 편평 상피 세포, 백혈구 및 / 또는 nucleated 상피 세포를 cornified 볼 수 있습니다. 세포 존재의 비율은 샘플 수집 시간 (대표 결과, 그림 1D-G)와 즉각적인 호르몬 상태 (토론, 그림 2)에서 마우스의 estrous 단계를 결정 할 수 있습니다.

5. 대표 결과

세포학 : 세 가지 기본 세포 유형은 질을 뛰어 넘는 샘플에서 감지 할 수 있습니다 : (1) nucleated 상피 세포 (그림 1A)는, (2) 편평 상피 세포 (그림 1B) 및 (3) 백혈구 (그림 1C)을 cornified. Nucleated 상피 세포는 가볍게 스테인드 세포질, 어두운 스테인드 플라즈마 막, 그리고 타원형 핵이 ( (그림 1B)를 부족합니다. Polymorphonuclear 백혈구들은 불규칙한 모양, 어둡게 스테인드 다형성 핵, 그리고 작은 크기 (그림 1C, 검은 색 화살표)로 상피 세포로부터 구별 할 수 있습니다. 소변 오염 비방에 존재해야합니다, 요산의 결정이 쉽게 어떤 예상 세포 유형 (그림 3)에 이종의 결정 구조에 의해 감지됩니다. 이 문제가 발생할 있으며, 주된 세포 유형의 모호한 감지 경우, 비방은 삭제와 목적을 교대 사용하지해야합니다.

준비 : 얼룩에서 관찰 세포 유형의 상대적 비율은 샘플 수집의 날 (그림 1D-G)에 마우스의 estrous주기의 단계를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. proestrus 동안, 세포는 거의 대부분 아르원형의 클러스터는 상피 세포를 (그림 1D, 흰색 화살표로 표시 대표 셀) nucleated 잘 형성 될 수있다. 발정 동안, 세포는 주로 밀도가 높은 포장 클러스터에 존재하는 편평 상피 세포 (그림 1E, 화살촉으로 표시 대표 셀) cornified 있습니다. metestrus 동안, 작은 모호하게 스테인드 백혈구는 (그림 1 층 검은 색 화살표로 표시 대표 셀) predominate. Cornified 편평 상피 세포는 종종 조각, (그림 1 층, 검은 화살촉으로 표시 대표 셀)에서 관찰 될 수 있습니다. diestrus 동안, 희귀 cornified 편평 상피 세포가 계속 (그림 1G, 검은 화살촉으로 표시 대표 세포)가 될 수 있습니다, 그러나 백혈구는 여전히 (그림 1G, 검은 색 화살표로 표시 대표 셀) predominate. Metestrus는 diestrus의 nucleated 상피 세포의 모양 (가 diestrus 구별 할 수 있습니다 g> 그림 1G는 대표 셀은) 흰색 화살표로 표시.

그림 1
1 그림. 질 얼룩의 Cytological 평가는 estrous 단계를 식별하는 데 사용할 수있는 세 가지 기본 세포 유형의 질을 뛰어 넘는 샘플에서 발견됩니다. (A) nucleated 상피 세포, (B) cornified 편평 상피 세포, 그리고 (C) 백혈구. 비방에 존재하는 이러한 세포 유형의 비율 (D) proestrus이 (E) 발정은 (F) metestrus, 또는 (G) diestrus대로 대표 결과에 설명의 생쥐를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 대표 cornified 편평 상피 세포에 E, F 및 G 포인트의 블랙 화살촉. 대표 leykocytes에 C, F 및 G 포인트의 검은 색 화살표. D와 G 강조 담당자에 흰색 화살표는 상피 세포를 nucleated.

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그림 2. 질 비방 세포학은 기본 내분비 이벤트를 반영합니다. 세부 사항도 토론에 제공됩니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 요산의 결정이 소변 오염 된 시료의 현재 다음 크리스탈 바이올렛 염색 할 수 있습니다. (A) 크리스털 투명하고 다양한 크기 ((B)에 확대 화살표와 박스 지역) 될 수 있습니다. 어떤 세포는이 분야에서 존재하지 않습니다. cytological 착색에 사용되는 필드 내에서 요산의 결정 오염이 존재해야, 그것은 정확하게 세포 유형이 현재와 비방을 폐기해야합니다 식별하기 어려울 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm.

Discussion

셀 예표 론의 이러한 변화는 기본 내분비 이벤트를 나타내는 수 있습니다. estrous주기의 proestrus 단계는 월경주기 (5)의 인간 follicular 단계에 해당하며 17 β-에스트라 디올 수치에게 6 순환의 사전 ovulatory 증가뿐만 아니라, prolactin 7의 작은 급증 (그림 2에 의해 정의되는 것은, Proestrus, 왼쪽 패널). 17 β-에스트라 디올의 증가는 간접적으로 자극 생식샘 자극 호르몬 - 방출 차례로, 순환 8,9에 luteinizing 호르몬과 소낭 자극 호르몬을 출시 할 앞 뇌하수체에 반응 세포를 활성화, 시상 하부 및 심실 중격 호르몬 뉴런을 (그림 2 , Proestrus, 왼쪽 패널). proestrus의 동물에서 가져온 질 얼룩에서 세포는 거의 대부분 타원형 nucleated 상피 세포 (그림 1D, 그림 2, Proestrus, 오른쪽 패널)입니다. 소낭 자극의 horm의 피크발정 10,11 하나의 레벨 신호의 배란 및 항목. 발정 기간 동안, 17-β-에스트라 디올 수치 감소와 prolactin 수준에게 최대 6,7 (그림 2, 발정, 왼쪽 패널을). 질 얼룩은 clumps에서 종종 불규칙 모양의 cornified 편평 상피 세포 (그림 1E, 그림 2, 발정, 오른쪽 패널)의 거의 독점적 인 검색을 특징으로하고 있습니다. metestrus에 입장 progesterone 호르몬 수준 6 연속 상승과 일치과 인간의 luteal 단계 12 (그림 2, Metestrus, 왼쪽 패널)의 시작 부분에 해당합니다. progesterone 수준은 상승이 시작 코퍼스 luteum 활성화 6,13,14 (그림 2, Metestrus, 왼쪽 패널)에 대한 응답으로 17 β-에스트라 디올 수치의 작은 동요가 있습니다. 이 단계 동안 질 얼룩에 존재하는 세포 유형은 조각, cornified 상피 세포와 작은 어두운 스테인드 백혈구 (Figur 아르전자 층, 그림 2, Metestrus, 오른쪽 패널). 마지막으로, 쥐 diestrus에 항목이 발생하고 progesterone 수준에게 인간의 말 luteal 단계 12에 해당하는 최대 6, 순환. 코퍼스 luteum의 회귀는 progesterone 수준 15,16의 후속 급락 (그림 2, Diestrus, 왼쪽 패널)로 연결됩니다. 백혈구는 diestrus 동안 얼룩에 predominate. cornified 상피 세포의 주파수는 감소 nucleated 상피 세포는 이전에 proestrus (그림 1G, 그림 2, Diestrus, 오른쪽 패널)으로 전환 할 감지하기 시작합니다.

요약하면,이 단순하고, 일상적인 프로토콜은 매일 호르몬 변동을 예측하고 다음주의 사항을 촬영하는 경우 생식 상태를 변경하지 않고 실험 쥐 estrous 단계를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플링은 하루에 한 번씩 비 침습적 프로토콜 내림차순를 사용하는 것보다 더 이상 수행되지 않을 것입니다질 운하, 흡인 및 교반의 반복 침투에 비해 여기 ribed. 이 cytological 평가를 먹이고 있습니다 얼룩에 존재하는 백혈구와 다른 세포 유형의 결과 염증성 응답 17에 결과 질 자극을 일으킬 수 있습니다. 또한, 심지어 식민지-자리 여성은, 그게 잘 anestrous 18 유도하고이 식별 번식이, 성별에 호르몬 영향의 해석에 유용합니다, 질병 연구 등 다양한 마우스에 확장 diestrus와 발정 단계를 볼 정상입니다. 사이클 길이 변화는 나이가 및 여성 7,19-21의 식민지에서 주택의 차이 (개인 또는 그룹 주택)에 의해 소개되어 있습니다. 여성 전용 식민지에 자리 잡고 여자들은 자전거를 중단하고 자전거는 자전거 24,25을 유도하는 남성 소변과 pretreated 케이지에 노출에 의해 다시 instated 할 수 있지만 장시간 diestrus 18,22,23의 상태를 입력 할 수 있습니다. 따라서, individua를 확립하는주어진 마우스 리터 사이클 길이는,이 두개의 완벽한 사이클이 관찰 될 때까지 여기에 설명 된 비 침습적 평가가주의 매일 수행 할 것을 권장합니다.

Disclosures

저자는 이익 갈등을 선언하지 않습니다. 동물의 모든 실험은 오타와 동물 관리위원회의 대학과 동물 관리에 캐나다 의회에 의해 명시된 지침과 규정에 엄격한에 따라 수행되었다.

Acknowledgments

우리는 시각적 모델 지원 비디오 제작 및 편집과 칼튼에서 박사 마틴 버트 란드 몰입 미디어 스튜디오 / 신경 재생 연구실에서 전문가 기술 지원 칼튼 몰입 미디어 스튜디오에서 마크 레너드 감사드립니다. 저자는 굉장히 박사 매릴린 Keaney와 오타와 동물 관리 및 수의학 서비스의 대학에서 그녀의 헌신적 인 직원의 모든 전문가의 조언을 인정합니다. 이 작품은 SALB, 노화의 CIHR 연구소 SALB와 SF, 캐나다 재단에 Neurodegenerative Lipidomics의 건강 연구 / CIHR 교육 프로그램 (TGF 96,121)의 전략적 교육 사업에 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR, 걸레 62826)에 의해 재정 지원되었다 SF, SF에 온타리오 혁신 믿어, 그리고 SF에 대한 오토 데스크 연구에 혁신. ACM은 CIHR의 들소와 베스트 박사 상을 받게됩니다. NV는 노화와 Neurodegenerative Lipidomics의 CIHR 교육 프로그램의 연구소에서 포스트 - 전문 교제를받습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

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References

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